呂小健，許 引，徐蘭英，李士明，龍 濤*，王運(yùn)利

（1.武漢紡織大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 武漢 430200；2.黃岡師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院 催化材料制備及應(yīng)用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃岡 438000）

陳皮又稱橘皮、廣陳皮，為蕓香科植物橘及其栽培變種的成熟果皮，是一種藥食同源的中藥，有理氣調(diào)中，燥濕化痰功效[1-3]。已有研究表明，陳皮中特有的黃酮類化合物具有抗氧化[4-6]、抗炎[7-9]、抗癌[10-12]、抗菌[13]、保肝作用[14]、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)[15]等生理活性。橘皮素和川陳皮素均為多甲氧基黃酮類化合物，屬于陳皮中的特有黃酮，對(duì)陳皮的生物活性起到了重要作用，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

川陳皮素能通過抑制肝臟脂肪酸生物合成和增加脂肪酸氧化，來防止肝臟脂肪變性和血脂異常，具有預(yù)防肥胖、輔助降血脂的作用[16-18]。橘皮素能通過誘導(dǎo)CYP1A1/CYP1B1介導(dǎo)的代謝途徑，可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖[19]。隨著陳皮黃酮研究的不斷深入，許多生物活性研究尤其是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)受到單體數(shù)量的制約，因此亟需一種簡(jiǎn)便、高效的大量分離制備陳皮中橘皮素和川陳皮素的方法。

圖1 橘皮素（a）和川陳皮素（b）的結(jié)構(gòu)式Fig．1 Structural formulas of the tangeretin(a)and nobiletin(b)

本研究采用柱色譜法同時(shí)分離制備純度較高的橘皮素和川陳皮素，采用柱層析硅膠為分離介質(zhì)，不同比例的乙酸乙酯-石油醚混合液為洗脫溶劑，同時(shí)分離制備較高純度的橘皮素和川陳皮素。該方法成本低，簡(jiǎn)單易行，可以同時(shí)大量制備橘皮素和川陳皮素，以期為陳皮生物活性的深入研究提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陳皮：市售。

無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷（均為分析純），甲醇、乙腈（均為色譜純）：國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。橘皮素和川陳皮素對(duì)照品：本實(shí)驗(yàn)室自制（經(jīng)過1H-NMR、13C-NMR和ESI-MS鑒定結(jié)構(gòu)，純度采用HPLC峰面積歸一化法計(jì)算均≥98%）。

1.2 儀器與設(shè)備

GWX-9623MB型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；2XZ-1型旋片式真空泵：臨海市譚氏真空設(shè)備有限公司；CCA-20型低溫冷卻水循環(huán)泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；ZF7型三用紫外分析儀：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；BSA124S分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；1260型高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：美國(guó)安捷倫公司；UltiMate 3000 plus型液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-massspectrometry，HPLC-MS）聯(lián)用儀：美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

HPLC 條件：Agilent C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）液相色譜柱；流動(dòng)相：乙腈-水（梯度：0～15 min，40%～50%乙腈；15～20 min，50%～70%乙腈；20～25 min，70%～85%乙腈；25～30 min，85%～40%乙腈）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：326 nm；進(jìn)樣量：10μL。

質(zhì)譜條件：電子電離（electrospray ionization，EI）源；檢測(cè)方式為正離子模式，鞘氣流速34.5 kPa；噴霧電壓75 kV；毛細(xì)管溫度320℃；輔助氣加熱器溫度300℃。

1.3.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

分別精密稱取5.0 mg川陳皮素和橘皮素對(duì)照品，用色譜甲醇超聲輔助溶解并定容至10 mL容量瓶中，配制成0.5 mg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液，保存于4℃冰箱中，備用。

1.3.3 橘皮素和川陳皮素樣品的提取分離及檢測(cè)

乙醇浸提：稱取干陳皮粉，用無水乙醇于室溫條件下浸提48 h，料液比1∶10（g∶mL），過濾并收集濾液，將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾得陳皮粗提物Ⅰ。

有機(jī)溶劑萃?。簩㈥惼ご痔嵛铫裼眠m量蒸餾水配成混合懸浮液，混勻后加入一定體積的正己烷萃取2～3次，再用二氯甲烷萃取2～3次，合并二氯甲烷層，減壓濃縮除去二氯甲烷溶劑即得陳皮粗提物Ⅱ。

裝柱：稱取200～300目的硅膠70 g置于燒杯中，加入100 mL石油醚（即加入干硅膠體積1倍的溶劑），用玻璃棒充分?jǐn)嚢?，攪成勻漿。將4 cm×30 cm層析柱管清洗干凈并保持干燥，垂直固定在鐵架臺(tái)上，取一小團(tuán)脫脂棉用溶劑潤(rùn)濕后塞入管底。將硅膠均勻的裝入層析柱中，保持上部水平。然后在硅膠柱頂部加入適量海砂，用膠棒輕輕敲打海沙表面至水平。

洗脫：將適量陳皮黃酮混合物溶于少量二氯甲烷得懸濁液。濕法上樣后，依次用不同比例的乙酸乙酯-石油醚溶液進(jìn)行洗脫，乙酸乙酯的體積分?jǐn)?shù)分別為20%、30%、40%、50%、60%，每40 mL收集一瓶，從第一瓶按照順序編號(hào)，直到60%洗脫劑洗脫完畢。

檢測(cè)：分別將不同編號(hào)樣品收集瓶中的溶劑旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到的固體物質(zhì)用色譜甲醇溶解，過0.22μm濾膜后，直接注入進(jìn)樣瓶以供HPLC分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 橘皮素和川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線

將對(duì)照品儲(chǔ)備液采用逐步稀釋法稀釋至2.5μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL，得不同質(zhì)量濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.3.1中色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。以每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液對(duì)應(yīng)的峰面積（y）和其質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸分析，得到川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=31.719x+89.264（R2=0.999 9）；橘皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=37.632x+10.145（R2=0.999 8）。結(jié)果顯示，川陳皮素和橘皮素在2.5～500μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 陳皮粗提物Ⅱ中川陳皮素、橘皮素含量的檢測(cè)

準(zhǔn)確稱取5 mg陳皮粗提物Ⅱ用色譜甲醇定容至10 mL，取1 mL溶液過0.22μm濾膜后經(jīng)HPLC分離，檢測(cè)得到化合物的峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算，得陳皮黃酮混合物中川陳皮素含量為1.6 mg，橘皮素含量為1.1 mg。

2.3 陳皮粗提物Ⅰ與陳皮粗提物Ⅱ成分比較

川陳皮素和橘皮素標(biāo)準(zhǔn)品及二氯甲烷萃取陳皮粗提物前后經(jīng)HPLC檢測(cè)比較其中物質(zhì)變化，結(jié)果如圖2所示。

由圖2A可知，標(biāo)準(zhǔn)品川陳皮素和橘皮素的保留時(shí)間分別為13.1 min、19.3 min。對(duì)比圖2B和圖2C可知，二者均含有較多川陳皮素和橘皮素，可見這兩種多甲氧基黃酮是陳皮中的主要黃酮。陳皮粗提物Ⅰ經(jīng)有機(jī)溶劑萃取后，多甲氧基黃酮純度明顯提高。這是因?yàn)檎和檩腿〕チ顺砀嘀械姆菢O性物質(zhì)，且多甲氧基黃酮在二氯甲烷中溶解度很好，幾乎所有的多甲氧基黃酮都溶于二氯甲烷層，而極性較強(qiáng)的雜質(zhì)則大部分留在水溶液中。因此，陳皮粗提物Ⅰ通過正己烷和二氯甲烷萃取之后，混合組分得到了初步純化，為后續(xù)的柱色譜分離得到陳皮多甲氧基黃酮單體奠定了基礎(chǔ)。

圖2 對(duì)照品（A）、陳皮粗提物Ⅰ（B）、陳皮粗提物Ⅱ（C）的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of reference substance(A),crude extractsⅠ(B)and crude extractsⅡ(C)from tangerine peel

2.4 正相柱色譜法分離陳皮黃酮混合物

按照1.3.3方法裝柱，二氯甲烷萃取得到的陳皮粗提物Ⅱ上樣后，依次用不同比例的乙酸乙酯-石油醚溶液進(jìn)行洗脫，分別收集到25個(gè)樣品瓶中，1～5#、6～10#、11～15#、16～20#、21～25#樣品瓶分別是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 20%、30%、40%、50%、60%乙酸乙酯的洗脫劑洗脫所得溶液，同時(shí)用薄層色譜（thin layerchromatography，TLC）及HPLC跟蹤監(jiān)測(cè)。HPLC檢測(cè)結(jié)果中，體積分?jǐn)?shù)為30%乙酸乙酯洗脫后，流出物中開始出現(xiàn)川陳皮素和橘皮素，其中第8號(hào)樣品瓶檢測(cè)結(jié)果見圖3。由圖3可知，在保留時(shí)間21.9 min處有一個(gè)較大的物質(zhì)峰，但在保留時(shí)間19.3 min處出現(xiàn)了一個(gè)較小的色譜峰，通過保留時(shí)間、紫外光譜及標(biāo)準(zhǔn)加入法確證了保留時(shí)間為19.3 min的物質(zhì)為橘皮素。結(jié)果說明，體積分?jǐn)?shù)為30%的乙酸乙酯極性較弱，根據(jù)相似相溶原理，可將陳皮黃酮混合物中極性較弱的物質(zhì)洗脫下來，但在此極性條件下，橘皮素已經(jīng)開始被淋洗下來，但含量很低，因而可以加大淋洗液極性繼續(xù)進(jìn)行洗脫。

圖3 30%乙酸乙酯-70%石油醚洗脫劑洗脫樣品8#的色譜圖Fig.3 Chromatogram of the eluant of sample 8#eluted by 30%ethyl acetate and 70%petroleum ether

用體積分?jǐn)?shù)40%的乙酸乙酯洗脫劑洗脫，主要得到一種物質(zhì)，其中第12號(hào)管的液相色譜分離圖如圖4（a），通過面積歸一化法進(jìn)行計(jì)算，其純度達(dá)到98.1%。與橘皮素的標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其保留時(shí)間和紫外吸收一致。取該樣品同時(shí)進(jìn)行MS檢測(cè)，結(jié)果見圖4（b），其分子離子峰為372.7，和文獻(xiàn)報(bào)道一致[20]，進(jìn)一步證實(shí)分離得到的物質(zhì)為橘皮素。

圖4 12#樣品的色譜圖（a）及質(zhì)譜圖（b）Fig.4 Chromatogram(a)and mass spectrum(b)of sample 12#

用50%乙酸乙酯洗脫之后主要得到4種物質(zhì)，其中第16、18#管的色譜分離結(jié)果見圖5。由圖5可知，增大洗脫劑濃度，洗脫液中還殘留橘皮素，但明顯看到極性較大的物質(zhì)開始被洗脫，保留時(shí)間為13.1 min時(shí)出現(xiàn)了目標(biāo)色譜峰，根據(jù)保留時(shí)間和紫外光譜定性初步確定其為川陳皮素。18號(hào)管中橘皮素色譜峰繼續(xù)減小，川陳皮素色譜峰明顯增加。表明在此洗脫劑條件下，川陳皮素逐漸被洗脫，要想洗脫得到純度較高的川陳皮素，則需要繼續(xù)增大洗脫劑濃度。

用體積分?jǐn)?shù)60%的乙酸乙酯洗脫劑洗脫，取第21號(hào)樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。由圖6（a）可知，圖6（a）中只出現(xiàn)了一個(gè)明顯的色譜峰，通過保留時(shí)間和紫外光譜定性，初步確定該物質(zhì)為川陳皮素。通過峰面積歸一化法進(jìn)行計(jì)算，其純度達(dá)98.6%。取該樣品同時(shí)進(jìn)行MS檢測(cè)，結(jié)果見圖6（b），其分子離子峰為402.4，和文獻(xiàn)報(bào)道一致[20]，進(jìn)一步證實(shí)分離得到的物質(zhì)為川陳皮素。

圖5 50%乙酸乙酯-50%石油醚洗脫劑洗脫樣品16#（a）和18#（b）的色譜圖Fig.5 Chromatogram of the eluant of sample 16#(a)and 18#(b)eluted by 50%ethyl acetate and 50%petroleum ether

圖6 21#樣品的色譜圖（a）及質(zhì)譜圖（b）Fig.6 Chromatogram(a)and mass spectrum(b)of sample 21#

3 結(jié)論

采用醇提結(jié)合硅膠柱色譜分離方法，以乙酸乙酯-石油醚溶液為洗脫劑進(jìn)行洗脫，可以從陳皮中同時(shí)分離制備得到高純度的橘皮素和川陳皮素單品，經(jīng)HPLC進(jìn)行純度分析，并經(jīng)質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確證。該方法的確立，為陳皮黃酮的生物活性篩選和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的深入研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。