趙山山，杜秋玲，楊曉艷，張莎莎，王 磊，邸一桓，郝光飛，趙國(guó)忠，周玉巖*

（1.河北工程大學(xué) 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056000；2.天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院教育部食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；3.河北省藥品檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050011）

酸菜是在一定濃度的鹽溶液中經(jīng)微生物作用泡制而成的蔬菜食品[1]。東北酸菜的發(fā)酵多集中在冬季，以其酸香味醇、熱量低、營(yíng)養(yǎng)豐富、具有保健功效等特點(diǎn)而深受消費(fèi)者的喜愛(ài)，并逐漸發(fā)展成為一種獨(dú)特的飲食文化[2]。東北酸菜因其獨(dú)特的地理環(huán)境及人文歷史，在酸菜行業(yè)中占有彌足輕重的地位，日益成為人們餐桌上不可或缺的菜品。乳酸菌群在酸菜的發(fā)酵體系中發(fā)揮主導(dǎo)作用[3-4]，其發(fā)酵產(chǎn)生的酸、醇、酯等有機(jī)活性物質(zhì)，結(jié)合食鹽的滲透壓作用，賦予酸菜獨(dú)特的風(fēng)味及質(zhì)地[5]；同時(shí)代謝產(chǎn)生的乳酸和細(xì)菌素等物質(zhì)可以抑制發(fā)酵體系中腐敗微生物的生長(zhǎng)[6]。此外，酸菜中乳酸菌更有助于人體消化、降膽固醇，以及調(diào)節(jié)生理機(jī)能等保健功效[7-10]。

目前東北酸菜的生產(chǎn)正處于自然發(fā)酵向人工發(fā)酵的轉(zhuǎn)型期，發(fā)酵周期長(zhǎng)、受溫度影響大、產(chǎn)品安全性低等一系列問(wèn)題使酸菜的規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)受到限制。針對(duì)這些問(wèn)題進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌的性能與酸菜的品質(zhì)有著密切的關(guān)系，使用性能優(yōu)良的乳酸菌發(fā)酵劑可強(qiáng)有力地推動(dòng)酸菜發(fā)酵工藝的優(yōu)化[11-13]。近年來(lái)，優(yōu)良發(fā)酵性能乳酸菌的篩選已經(jīng)成為高品質(zhì)乳酸菌發(fā)酵劑開(kāi)發(fā)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，有研究從發(fā)酵食品中分離出一些具有不同生理特性的乳酸菌，如高產(chǎn)酸耐酸菌株[14-15]、耐鹽菌株[16-17]、低溫型菌株等[18]；此外，篩選出降膽固醇菌株[19]、降解亞硝酸鹽菌株[20-21]、抑菌菌株[22-23]等具有生理功能的乳酸菌株。但是，具有單一優(yōu)良性能的乳酸菌很難同時(shí)滿(mǎn)足實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)于乳酸菌產(chǎn)酸、耐鹽、抑菌等方面的需要。因此，以產(chǎn)酸、耐鹽及抑菌能力為主要指標(biāo)，從東北酸菜中篩選兼有多種優(yōu)良性能的低溫型乳酸菌對(duì)縮短發(fā)酵周期、提升酸菜品質(zhì)具有重要意義。

本研究從傳統(tǒng)東北酸菜中分離篩選高產(chǎn)酸乳酸菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并探究菌株的低溫生長(zhǎng)性能、耐鹽特性及抑菌能力，從中獲得優(yōu)良發(fā)酵性能的乳酸菌，并對(duì)比分析接種乳酸菌發(fā)酵酸菜與自然發(fā)酵酸菜過(guò)程中的各項(xiàng)指標(biāo)，旨在為東北酸菜的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)和酸菜發(fā)酵劑的制備提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

東北酸菜樣品：從東北地區(qū)采集的不同家庭自制酸白菜樣品11份；新鮮大白菜：東北農(nóng)家。

1.1.2 菌株

大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 8739、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538：美國(guó)菌種保藏中心（American type culture collection，ATCC）。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS肉湯（瓊脂）培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯（瓊脂）培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；LB培養(yǎng)基：上海博微生物科技有限公司；CaCO3-MRS瓊脂培養(yǎng)基：在MRS瓊脂培養(yǎng)基中加入1.5%的碳酸鈣。

1.1.4 試劑

細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：上海生物工程有限責(zé)任公司；氯化鈉、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉（均為分析純）：天津歐博凱化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JTNJB牛津杯（內(nèi)徑為6.0 mm）：北京吉泰遠(yuǎn)成科技有限公司；T100 Thermal Cycler（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國(guó)Bio-Rad公司；YXQ-LS-75SLL立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；SW-SJ-2D型超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHP-9012電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ZHPW-70臺(tái)式振蕩培養(yǎng)箱：天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；UV1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：杭州艾普儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離

取酸菜汁樣品用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)∵m當(dāng)稀釋倍數(shù)的菌液1 mL于平皿中，傾注CaCO3-MRS瓊脂培養(yǎng)基，待其凝固后，37℃厭氧培養(yǎng)48 h。挑取溶鈣圈較大的單菌落轉(zhuǎn)接到MRS平板上劃線(xiàn)分離，反復(fù)純化后，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢及過(guò)氧化氫接觸酶試驗(yàn)，判斷革蘭氏陽(yáng)性、無(wú)芽孢、接觸酶陰性的菌株為乳酸菌[24-25]。

1.3.2 高產(chǎn)酸乳酸菌的篩選

初篩：采用溶鈣圈法[26]進(jìn)行初篩。分別將分離的乳酸菌菌株劃線(xiàn)于MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24 h。向培養(yǎng)皿中澆注CaCO3-MRS瓊脂培養(yǎng)基，待其凝固后，用鑷子將牛津杯垂直培養(yǎng)基表面于中央位置放置。在牛津杯中分別傾注0.5 mL菌液，37℃厭氧培養(yǎng)，待菌液變干后，取下牛津杯，繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)量溶鈣圈的大小。

復(fù)篩：分別將分離的乳酸菌菌株劃線(xiàn)于MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24 h。取發(fā)酵液1 mL，加蒸餾水50 mL稀釋后，采用NaOH溶液（0.1 mol/L）測(cè)定發(fā)酵液酸度。每組滴定試驗(yàn)重復(fù)3次。采用酸堿滴定法[27]測(cè)定酸度。

選取溶鈣圈較大且酸度較高的菌株，以2%乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液為對(duì)照，采用紙層析法進(jìn)行乳酸定性[28]。

1.3.3 高產(chǎn)酸乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定

參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取高產(chǎn)酸乳酸菌的基因組DNA，以此為模板，使用16S rDNA通用引物（27F：5′-AACTGAGTTTGATCCTGGCTC-3′；1492R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)均參見(jiàn)文獻(xiàn)[29]。將經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后的PCR產(chǎn)物送至上海生物工程有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序。利用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）將測(cè)序結(jié)果與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行同源性比對(duì)，選取同源性較高的菌株使用MEGA7軟件中的鄰接法（neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.4 高產(chǎn)酸乳酸菌發(fā)酵性能的測(cè)定

（1）不同溫度生長(zhǎng)性能的測(cè)定：將篩選得到的高產(chǎn)酸菌株在MRS瓊脂培養(yǎng)基上劃線(xiàn)，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，得到的單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)12 h，以3%（V/V）的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，分別置于5℃、15℃、25℃條件下厭氧培養(yǎng)48 h，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)定發(fā)酵液的酸度和OD600nm值。

（2）耐鹽性能的測(cè)定[30]：以3%（V/V）的接種量分別接種于NaCl含量為0、4%、6%、8%的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃條件下厭氧培養(yǎng)24 h，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)定OD600nm值。

（3）抑菌性能的測(cè)定

指示菌懸液的制備[31]：將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌分別劃線(xiàn)于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)48 h。分別挑取單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，28℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h，調(diào)整菌體濃度約107CFU/mL。

菌株上清液的制備[32]：挑取乳酸菌菌種接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃條件下培養(yǎng)24 h，按2%的接種量轉(zhuǎn)接2次。4 000 r/min離心10 min（4℃），取上清液。

抑菌性能測(cè)定：采用牛津杯打孔法[33]進(jìn)行測(cè)定。向培養(yǎng)皿中傾注10 mL滅菌后的0.5%～0.8%瓊脂，待其凝固后，用鑷子將牛津杯垂直培養(yǎng)基表面于中央位置放置。將2 mL指示菌懸液與200 mL LB瓊脂培養(yǎng)基（50℃左右）混勻，吸取20 mL注入平板，待其完全凝固后，取出牛津杯，用移液槍在孔中注入100μL菌株上清液，4℃擴(kuò)散1 h后，37℃恒溫培養(yǎng)12 h，每組重復(fù)3次，用游標(biāo)卡尺，采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，根據(jù)比較抑菌圈直徑判斷菌株抑菌性能。抑菌圈直徑＞7 mm時(shí)，判為有抑菌作用。

1.3.5 優(yōu)良乳酸菌發(fā)酵酸菜的制備

按照參考文獻(xiàn)[34]制備發(fā)酵酸菜，鹽水濃度為8%，優(yōu)良乳酸菌的添加量為0、1%、3%、5%，15℃條件下靜置發(fā)酵，每隔3 d取樣測(cè)定pH值并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.3.6 分析方法

pH值測(cè)定[35]：采用玻璃電極法測(cè)定酸菜體系的pH值。

感官評(píng)價(jià)[36]：采用加權(quán)法對(duì)酸菜品質(zhì)進(jìn)行感官評(píng)定。由15名專(zhuān)業(yè)人員組成評(píng)定小組從視覺(jué)、嗅覺(jué)、味覺(jué)、口感等角度對(duì)酸菜的感官質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，滿(mǎn)分為9分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 東北酸菜的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of pickle in the northeast of China

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，試驗(yàn)所有不同處理均做3次平行，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用方差分析（analysis of variance，ANOVA）進(jìn)行顯著性差異分析，P＜0.05表示差異顯著；采用GraphPad Prism 6.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離

在MRS固體培養(yǎng)基中經(jīng)多次分離純化，共篩選獲得192株表面濕潤(rùn)、光滑，中間凸起、邊緣整齊的細(xì)菌，經(jīng)鑒定均為革蘭氏陽(yáng)性、無(wú)芽孢、過(guò)氧化氫陰性菌株。其中15株菌株溶鈣圈較大，分別為DBC3、DBC9、DBC14、DBC17、DBC30、DBC33、DBC41、DBC49、DBC50、DBC60、DBC73、DBC75、DBC79、DBC84、DBC89。

2.2 高產(chǎn)酸乳酸菌的篩選

2.2.1 初篩結(jié)果

15株乳酸菌的溶鈣圈直徑測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同乳酸菌的溶鈣圈直徑Table 2 Diameter of dissolved calcium circle of different lactic acid bacteria

由表2可知，15株乳酸菌均可在CaCO3-MRS瓊脂培養(yǎng)基上形成透明的溶鈣圈，其中乳酸菌DBC3、DBC17、DBC30、DBC33、DBC60產(chǎn)生的溶鈣圈顯著大于其他菌株（P＜0.05），因此，初步判斷其為高產(chǎn)酸乳酸菌，其中乳酸菌DBC30的溶鈣圈直徑（2.73±0.14 cm）最大。為進(jìn)一步確定菌株的產(chǎn)酸能力，對(duì)15株乳酸菌進(jìn)行復(fù)篩。

2.2.2 復(fù)篩結(jié)果

15株乳酸菌發(fā)酵液的酸度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同乳酸菌的產(chǎn)酸性能比較Table 3 Comparison of acid-producing performance of different lactic acid bacteria

由表3可知，乳酸菌DBC3、DBC17、DBC30、DBC33、DBC60的發(fā)酵液酸度明顯高于其他菌株（P＜0.05），與初篩所得結(jié)果相一致，酸度均≥（1.91±0.06）×10-1mol/L。其中乳酸菌DBC30發(fā)酵液酸度最高，為（2.29±0.07）×10-1mol/L。乳酸菌DBC3、DBC17、DBC30、DBC33、DBC60的產(chǎn)酸能力為DBC30＞DBC33＞DBC60＞DBC17＞DBC3。因此，確定以上5株菌為高產(chǎn)酸乳酸菌。

2.2.3 乳酸定性結(jié)果

2%乳酸標(biāo)準(zhǔn)液和5株高產(chǎn)酸乳酸菌發(fā)酵液的紙層析比移值（Rf值）見(jiàn)表4。

表4 不同乳酸菌發(fā)酵液Rf值的測(cè)定結(jié)果Table 4 Determination results of Rf values of the fermentation broth of different lactic acid bacteria

乳酸標(biāo)準(zhǔn)液Rf值與5株高產(chǎn)酸乳酸菌發(fā)酵液的Rf值之間均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），表明5株乳酸菌代謝產(chǎn)生乳酸。

2.3 高產(chǎn)酸菌株分子生物學(xué)鑒定

5株高產(chǎn)酸乳酸菌DBC3、DBC17、DBC30、DBC33、DBC60的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖1。

由圖1可知，菌株DBC3、DBC17、DBC30、DBC33、DBC60與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ST-III聚于一支，同源性分別為100%、99.93%、99.78%、99.78%、99.78%。在16S rRNA基因序列比對(duì)中，對(duì)屬和種的界定為：屬于同一個(gè)屬的最低同源性為95%[37]，當(dāng)同源性＞97%時(shí)，屬于同一個(gè)種[38]，因此，這5株菌均被鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

2.4高產(chǎn)酸乳酸菌發(fā)酵性能的測(cè)定

2.4.1 高產(chǎn)酸乳酸菌不同溫度生長(zhǎng)性能測(cè)定

酸菜的生產(chǎn)過(guò)程中，酸菜的品質(zhì)與發(fā)酵溫度密切相關(guān)。發(fā)酵溫度過(guò)高，發(fā)酵體系中同型發(fā)酵居于主導(dǎo)，乳酸大量積累，對(duì)酸菜的組成、色澤及風(fēng)味均產(chǎn)生不同程度的破壞。相比于常溫發(fā)酵，低溫發(fā)酵酸菜的風(fēng)味及色澤更佳，主要是由于酸菜發(fā)酵產(chǎn)生的二氧化碳和有機(jī)酸在低溫條件下，更易滲透進(jìn)入酸菜組織和汁液[39]，并且低溫發(fā)酵有利于酸菜保存期的延長(zhǎng)[40]。此外，大白菜的收獲及發(fā)酵多在低溫時(shí)節(jié)，因此，用于酸菜實(shí)際生產(chǎn)的菌株需具有良好的低溫生長(zhǎng)能力。5株高產(chǎn)酸乳酸菌在不同溫度條件下的生長(zhǎng)能力結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同培養(yǎng)溫度對(duì)5株高產(chǎn)酸乳酸菌酸度（A）及OD600 nm值（B）的影響Fig.2 Effect of different culture temperature on the acidity(A)and OD600 nm values(B)of 5 lactic acid bacteria with high-yield acid

由圖2可知，乳酸菌發(fā)酵液的酸度和OD600nm值的結(jié)果一致，不同溫度下各乳酸菌的生長(zhǎng)能力存在不同程度的差異，5℃條件下乳酸菌生長(zhǎng)能力較弱；在5～25℃范圍內(nèi)，隨溫度的升高，5株高產(chǎn)酸乳酸菌生長(zhǎng)能力均有不同程度的提升。其中15℃和25℃條件下，菌株DBC33均可正常生長(zhǎng)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的生長(zhǎng)能力（P＜0.05），在15℃條件下（酸菜的一般發(fā)酵溫度）培養(yǎng)24 h后，發(fā)酵液的酸度和OD600nm值分別為（2.11±0.09）×10-1mol/L和1.81±0.05，為篩選得到的低溫型乳酸菌，但對(duì)該菌株低溫下的應(yīng)激反應(yīng)及低溫耐受機(jī)制需做進(jìn)一步的研究。

2.4.2 高產(chǎn)酸乳酸菌耐鹽性能的測(cè)定

在酸菜發(fā)酵體系中，需要加入一定質(zhì)量的食鹽。食鹽利用滲透平衡作用，保持細(xì)胞的滲透壓，對(duì)酸菜脆性和色澤的保護(hù)發(fā)揮積極的作用。此外，食鹽產(chǎn)生的高滲透壓作用可抑制有害微生物的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)，降低酸菜腐敗變質(zhì)的可能性。然而隨著鹽含量的增加，不斷提高的滲透壓對(duì)乳酸菌生理代謝的抑制逐漸明顯，從而影響其產(chǎn)酸能力，延長(zhǎng)酸菜的發(fā)酵周期[41-42]。有研究報(bào)道[43-44]，當(dāng)食鹽含量達(dá)8%時(shí)，對(duì)乳酸菌的抑制較為明顯。5株高產(chǎn)酸乳酸菌對(duì)不同NaCl含量的耐受能力結(jié)果如圖3所示。

圖3 5株高產(chǎn)酸乳酸菌在不同NaCl含量下的生長(zhǎng)情況Fig.3 Growth situation of 5 lactic acid bacteria with high-yield acid under different NaCl contents

由圖3可知，5株高產(chǎn)酸乳酸菌的OD600nm值與培養(yǎng)基中NaCl含量呈負(fù)相關(guān)，該結(jié)果與前人的研究結(jié)論相一致[43]。其中在不含NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中，5株高產(chǎn)酸乳酸菌均可正常生長(zhǎng)，OD600nm值基本一致（P＞0.05）；在NaCl含量為4%的MRS液體培養(yǎng)基中，5株乳酸菌的OD600nm值有所下降，生長(zhǎng)狀況受到影響；在NaCl含量為6%的MRS液體培養(yǎng)基中，5株乳酸菌的OD600nm值差異顯著（P＜0.05），乳酸菌的生長(zhǎng)能力為DBC33＞DBC60＞DBC30＞DBC17＞DBC3；當(dāng)NaCl含量達(dá)到8%時(shí)，乳酸菌DBC33的OD600nm值為0.64±0.04，顯著高于其他菌株（P＜0.05），表明此菌株對(duì)高含量的NaCl具有較強(qiáng)的耐受能力，具有較大的應(yīng)用潛力。

2.4.3 高產(chǎn)酸乳酸菌抑菌能力的測(cè)定

在酸菜發(fā)酵初期，發(fā)酵體系中微生物的種類(lèi)較為復(fù)雜，其中蔬菜表面附生的細(xì)菌、真菌等有害微生物對(duì)產(chǎn)品的風(fēng)味及安全性產(chǎn)生不同程度的影響。乳酸菌代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸及細(xì)菌素等抑菌因子，可抑制酸菜中常見(jiàn)病原菌的代謝增殖[45]。CALIX-LARA T F等[46]通過(guò)試驗(yàn)表明乳酸菌可顯著降低大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的活性；ELYAS Y Y A等[47]報(bào)道從蘇丹發(fā)酵食品中分離出的40株乳酸菌對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用。5株高產(chǎn)酸乳酸菌對(duì)指示菌大腸桿菌ATCC 8739（G-）和金黃色葡萄球菌ATCC 6538（G+）的抑制作用結(jié)果如表5所示。

表5 5株高產(chǎn)酸乳酸菌的抑菌能力Table 5 Antibacterial ability of 5 lactic acid bacteria with high-yield acid

由表5可知，5株高產(chǎn)酸乳酸菌對(duì)大腸桿菌ATCC 8739均具有明顯的抑菌效果，且乳酸菌DBC3和DBC30的抑制效果最為明顯，其抑菌圈分別為（14.41±0.89）mm和（12.86±1.08）mm；而僅有乳酸菌DBC3和DBC33對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC 6538表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，抑菌圈分別為（10.62±0.63）mm和（9.43±0.34）mm，乳酸菌DBC17、DBC30、DBC60對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC 6538均無(wú)明顯的抑菌作用。其中菌株DBC3抑菌作用最強(qiáng)，可能是由于相同生長(zhǎng)條件下，菌株DBC3分泌抑菌物質(zhì)較多，或者對(duì)指示菌的細(xì)胞破壞能力更強(qiáng)[48]。且菌株DBC3具有較廣的抑菌譜，對(duì)大腸桿菌ATCC 8739和金黃色葡萄球菌ATCC 6538的抑制作用都顯著優(yōu)于其他菌株（P＜0.05），這可能與菌株自身特性相關(guān)。

一直以來(lái)，從自然資源中分離篩選微生物被認(rèn)為是獲得工業(yè)生產(chǎn)菌株的重要途徑，本試驗(yàn)區(qū)別于前人著重于乳酸菌的單一特性研究[14，23，49-51]，通過(guò)對(duì)5株高產(chǎn)酸乳酸菌在不同溫度、鹽含量下的生長(zhǎng)能力及抑菌能力進(jìn)行對(duì)比分析，篩選出兼有多種性能的乳酸菌DBC3和DBC33。

2.5優(yōu)良乳酸菌發(fā)酵酸菜的品質(zhì)特性

乳酸菌DBC3和DBC33的不同接種量對(duì)發(fā)酵酸菜pH值的影響結(jié)果見(jiàn)圖4，對(duì)發(fā)酵酸菜感官評(píng)分的影響見(jiàn)表6。

圖4 15℃條件下不同接種量對(duì)菌株DBC3（A）及DBC33（B）發(fā)酵酸菜pH值的影響Fig.4 Effect of different inoculum on pH value of fermented pickle by strain DBC 3(A)and DBC33(B)at 15℃

由圖4可知，發(fā)酵前12 d內(nèi)各發(fā)酵體系的pH值迅速下降，隨時(shí)間延長(zhǎng)下降速度逐漸趨于平緩。相比于自然發(fā)酵，接種菌株DBC3和DBC33可明顯加快發(fā)酵體系pH的降低?？傮w來(lái)看，接種菌株DBC33的發(fā)酵體系pH值普遍低于接種菌株DBC3的發(fā)酵體系，并且在0～5%的接種范圍內(nèi)，發(fā)酵速度與接種量呈正相關(guān)，即菌株接種量越大，發(fā)酵速度越快。但乳酸菌接種量過(guò)高不僅增加生產(chǎn)成本并且不同程度上破壞酸菜的風(fēng)味及結(jié)構(gòu)，結(jié)合表6，接種乳酸菌DBC33且接種量為3%時(shí)，酸菜品質(zhì)綜合評(píng)分顯著高于其他發(fā)酵處理（P＜0.05），為（8.10±0.18）分，說(shuō)明接種3%乳酸菌DBC33可顯著提高酸菜發(fā)酵品質(zhì)，且發(fā)酵18 d即可達(dá)到發(fā)酵酸菜所需pH[52]，明顯縮短酸菜發(fā)酵周期，降低生產(chǎn)成本，保證了菌株用于東北酸菜工業(yè)化生產(chǎn)的可行性。

表6 不同接種量發(fā)酵酸菜的感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 6 Sensory evaluation results of fermented pickle with different inoculum

3 結(jié)論

本研究從傳統(tǒng)東北酸菜中分離得到192株乳酸菌，其中5株為高產(chǎn)酸乳酸菌，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定5株高產(chǎn)酸乳酸菌均為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。5株高產(chǎn)酸乳酸菌經(jīng)低溫生長(zhǎng)性能、耐鹽特性及抑菌能力的測(cè)定，篩選得到兼有多種優(yōu)良發(fā)酵性能的乳酸菌DBC3和DBC33并應(yīng)用于發(fā)酵酸菜。其中接種3%乳酸菌DBC33可顯著提高酸菜發(fā)酵品質(zhì)，發(fā)酵18 d即可達(dá)到所需pH，感官評(píng)分為8.10分，明顯縮短酸菜發(fā)酵周期，為東北酸菜發(fā)酵劑的制備和酸菜的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供了參考依據(jù)。