張姍姍，姚夢雪，洪燕，韓燕全，汪小莉

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院/國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031

中藥炮制是在中醫(yī)藥理論的基礎(chǔ)上，根據(jù)用藥的需求和藥物本身的性質(zhì)所采取的一項(xiàng)制藥技術(shù)，是中醫(yī)藥學(xué)的一大特色。中藥所含的有效成分是其治療疾病的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，經(jīng)過炮制-配伍其內(nèi)在的物質(zhì)基礎(chǔ)發(fā)生了一定的改變，復(fù)方的療效也會受到影響，所以在復(fù)方中研究炮制更符合實(shí)際。

理中丸出自東漢張仲景所著漢醫(yī)經(jīng)典著作《傷寒論》，具有溫中散寒、益氣健脾之功能，臨床應(yīng)用廣泛，是療效確切的中醫(yī)經(jīng)典方劑。本實(shí)驗(yàn)所采用的理中丸按照2015版《中華人民共和國藥典》[1]所記載方法，分別采用4味生制飲片和4味炮制飲片(其中黨參為米炒黨參，甘草為蜜制甘草，白術(shù)為土白術(shù)，姜為炮姜)組成炮制-配伍的組方。實(shí)驗(yàn)前期發(fā)現(xiàn)，單味姜炮制前后指紋圖譜差異明顯，而本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上擬從復(fù)方的角度研究以姜為君藥的理中丸方炮制-配伍前后指紋圖譜的差異[2-4]，以期為中藥臨床選擇合適炮制品提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

超高效液相色譜儀(美國Waters Acquity H-Class，UPLC)，包括四元梯度泵自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器以及Empower 2工作站；ME55型十萬分之一分析天平[梅特勒-托利(上海)有限公司]；KQ3200DB型超聲儀(江蘇昆山超聲儀器有限公司)；0.2 μm微孔濾膜(上海陸納生物科技有限公司)。

1.2 試藥

甘草苷(551-15-5)、甘草酸單銨鹽(53956-04-0)、甘草素(578-86-9)、甘草次酸(471-53-4)、6-姜酚(13012303)、6-姜烯酚(12121803)、8-姜酚(13070101)、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ(16032203)、黨參炔苷(16062207)購于成都曼思特生物科技有限公司，經(jīng)1H-NMR、13C-NMR、UV、IR和MS等光譜檢測確認(rèn)其結(jié)構(gòu)；甲醇、乙腈、磷酸為色譜純；水為屈臣氏純凈水。

黨參、甘草、白術(shù)、姜由安徽省中醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院李立華主任中藥師鑒定符合2015版《中華人民共和國藥典》項(xiàng)下性狀鑒別規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

2.1.1 炮制品制備 取姜、甘草、白術(shù)和黨參分別按照《中華人民共和國藥典》2015版附錄項(xiàng)下砂燙法、蜜制法、土炒法和米炒法，制備得到炮姜、炙甘草、土白術(shù)和米黨參。

2.1.2 樣品提取 按照《中華人民共和國藥典》2015版理中丸組方比例，分別取黨參7.5 g、甘草9 g、姜5 g和白術(shù)7.5 g進(jìn)行配伍；將配好的理中丸方藥材加入10倍量水浸泡30 min，武火煮開后，改之文火煎煮40 min，過濾；藥渣再加8倍量水武火煮開后，文火煎煮30 min，過濾。合并濾液，濃縮，放冷后定容至20 mL，重復(fù)制備過程，共得10批理中丸(生品)水煎液[下文均稱理中丸(生)]；將組方中的姜、甘草、白術(shù)和黨參分別替換成等量的炮姜、炙甘草、土白術(shù)和米黨參。重復(fù)以上制備過程，得到10批理中丸(炮制品)水煎液[(下文均稱理中丸(炮)]。

2.2 色譜條件

Waters Acquity BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫：30 ℃；以乙腈為流動相A，0.1%磷酸水溶液為流動相B，進(jìn)行梯度洗脫，程序?yàn)?～1.5 min，3%A；1.5～10 min，15%A；10～14 min，30%A；14～16.5 min，55%A；16.5～19 min，70%A；19～20 min，3%A；檢測波長：237 nm；流速：0.2 mL·min-1[5]。

2.3 對照品溶液的制備

取甘草苷、黨參炔苷、甘草素、甘草酸銨、甘草次酸、6-姜酚、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、8-姜酚、6-姜烯酚對照品適量，精密稱定，配置成各對照品母液；再取一定量對照品母液，加甲醇制成每mL分別含甘草苷0.021 mg、黨參炔苷0.023 mg、甘草素0.002 17 mg、甘草酸銨0.012 mg、甘草次酸0.007 8 mg、6-姜酚0.007 8 mg、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ0.006 68 mg、8-姜酚0.000 552 8 mg、6-姜烯酚0.001 6 mg的混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

分別取10批理中丸方生品與10批理中方炮制品水煎液各1 mL，水提液加甲醇定容至10 mL，震蕩、混勻、靜置。取上清液于12 000 r·min-1離心10 min，上清液過0.2 μm濾膜供UPLC分析用。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液1 μL，在2.2色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次。各主要色譜峰保留時(shí)間和峰面積基本一致，在同一臺儀器測得的色譜指紋圖譜與其共有模式圖譜的相似度大于0.997，符合指紋圖譜的要求，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份理中丸(炮)處方生制飲片，按照2.4供試品的制備項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣，考察各份樣品色譜峰保留時(shí)間的一致性，并采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件2004(A版)”計(jì)算其相似度，結(jié)果表明6份理中丸(炮)制品相似度均大于0.994，符合指紋圖譜的要求。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取理中丸方(炮)水煎液樣品溶液1 μL，在2.2項(xiàng)色譜條件下，分別在0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣，以選定的色譜峰為觀測指標(biāo)，各主要色譜峰保留時(shí)間和峰面積基本一致，6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的指紋圖譜相似度大于0.997，表明在24 h內(nèi)理中丸方(炮)水煎液的穩(wěn)定性良好。

2.5.4 理中丸方水煎液指紋圖譜中的共有峰 取20批理中丸水煎液供試品溶液，按2.2項(xiàng)方法下依次進(jìn)樣檢測，根據(jù)指紋圖譜的檢測結(jié)果，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件2004(A版)”，生成理中丸方水煎液共有峰指紋圖譜，其中共有色譜峰16個(gè)；通過與混合對照品進(jìn)行比對，指認(rèn)了其中9個(gè)特征峰，分別為甘草苷(6)、黨參炔苷(7)、甘草素(9)、甘草酸銨(10)、甘草次酸(12)、6-姜酚(13)、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ(14)、8-姜酚(15)、6-姜烯酚(16)，理中丸方水煎液共有峰指紋圖譜和混合對照品圖譜見圖1。

注：a.理中丸方水煎液共有峰指紋圖譜；b.混合對照品圖譜。圖1 理中丸方水煎液對照圖譜和混合對照品圖譜

2.5.5 理中丸方水煎液指紋圖譜相似度評價(jià) 將所得的20批理中丸方水煎液UPLC圖以AIA格式依次導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件2004(A版)”，得到指紋圖譜疊加圖，見圖2，分別比較了20批理中丸方水煎液樣品的色譜圖，并計(jì)算得到20批樣品的相似度[6-7]，見表1。

注：S1～S10.理中丸(生)；S11～S20.理中丸(炮)。圖2 理中丸(生)液與理中丸(炮)各10批疊加指紋圖譜

表1 理中丸方水煎液相似度

2.5.6 理中丸方(生、炮)水煎液指紋圖譜相對保留時(shí)間與相對峰面積 對10批理中丸方(生)和10批理中丸方(炮)水煎液進(jìn)行指紋圖譜分析，生品與炮制品水煎液指紋圖譜的相對保留時(shí)間基本一致，符合程度好，而相對峰面積變化較大，可見炮制-配伍對理中丸方指紋圖譜影響較大，結(jié)果見表2～5。從圖2可見，6號峰的峰面積較大，保留時(shí)間居中，是含量較高的主要指標(biāo)成分甘草苷，所以選擇6號峰為參照峰，進(jìn)行相對保留時(shí)間和峰面積計(jì)算。

表2 理中丸(生)水煎液相對保留時(shí)間

注：RRT為平均相對保留時(shí)間。

表3 理中丸(炮)水煎液相對保留時(shí)間

注：RRT為平均相對保留時(shí)間。

表4 10批理中丸(生)水煎液指紋圖譜相對峰面積

注：RPA為平均相對保留峰面積。

表5 10批理中丸(炮)水煎液指紋圖譜相對峰面積

續(xù)表5

注：RPA為平均相對保留峰面積。

2.5.7 樣品的聚類分析 以峰面積為變量，采用SIMCA 13.0.3軟件對20批理中丸水煎液進(jìn)行聚類分析，理中丸方生品水煎液S(1～10)聚為一類，理中丸方炮制品P(1～10)聚為一類，表明炮制-配伍前后理中丸內(nèi)在質(zhì)量差異明顯。結(jié)果見圖3。

注：S.理中丸(生)；P.理中丸(炮)。

2.5.8 樣品的主成分分析 采用SIMCA 13.0.3軟件對20批理中丸水煎液進(jìn)行主成分分析，分析結(jié)果見圖4，PCA二維投影圖可見S1～S10距離相近，P1～P10距離相近，分別相聚成群，圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)理中丸水煎劑樣品，20批樣品的PCA圖可分明顯為2類，結(jié)果與聚類分析相互印證，表明炮制-配伍前后理中丸內(nèi)在質(zhì)量差異明顯。

注：S.理中丸(生)；P.理中丸(炮)。

如圖5所示，PLS-DA分析各色譜峰的VIP得分圖表明，色譜峰變量對樣品分類的影響大小排序?yàn)镕3>F1>F15>F2>F5>F9>F16>F11>F8>F13>F10>F6>F12>F7>F14>F4，其中VIP值大于1的色譜峰有7個(gè)，分別為F3、F1、F15、F2、F5、F9、F16，其中F9(甘草素)、F15(8-姜酚)、F16(6-姜稀酚)為指認(rèn)的共有峰，也進(jìn)一步說明炮制-配伍對理中丸水煎液的質(zhì)量有影響，其他成分色譜峰對其影響有待進(jìn)一步探索。

圖5 各色譜峰變量投影重要性分析得分圖

3 討論

中藥指紋圖譜能夠較好地體現(xiàn)中藥成分的復(fù)雜性和相關(guān)性，是研究中藥整體特征的一種有效方法，在國內(nèi)外應(yīng)用越來越多[8-9]。本實(shí)驗(yàn)采用水煎煮法分別制備10批理中丸(生品)水煎液和10批理中丸(炮制品)水煎液，采用UPLC法對炮制-配伍前后理中丸方水煎液指紋圖譜進(jìn)行分析，尋找生品和炮制品組方前后的總體化學(xué)成分差異[13]。因?yàn)槔碇型璺阶畛跻詼珓┑男问綉?yīng)用于臨床，為了使樣品的提取方法與傳統(tǒng)煎劑相符，所以在實(shí)驗(yàn)中采用水煎劑法進(jìn)行樣品提?。挥捎谒鍎┲械碾s質(zhì)較多，所以選擇甲醇為溶劑進(jìn)行沉淀以精制樣品。實(shí)驗(yàn)對樣品的指紋圖譜進(jìn)行了全波長掃描，分別比較了波長為237、254、267、280 nm的色譜圖，發(fā)現(xiàn)在237 nm波長處檢測出圖譜信息量較多，且峰形較好，最終確定了此波長。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)考察了不同流動相系統(tǒng)、梯度洗脫條件、柱溫條件和不同型號色譜柱對指紋圖譜的影響，經(jīng)過優(yōu)化，最終以乙腈-0.1%磷酸水作為流動相，柱溫為30 ℃，色譜柱為Acquity BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，此條件下各色譜峰的分離度較好，且基線平穩(wěn)，峰形較好，有利于樣品的測定和分析。

本實(shí)驗(yàn)對炮制-配伍前后理中丸指紋圖譜進(jìn)行了初步的研究，通過比較炮制配伍前后理中丸生品與炮制品的色譜峰的峰面積和色譜圖的直觀觀察可知，炮制-配伍前后各色譜峰大小差異明顯。經(jīng)炮制后，色譜峰1、2、3等7個(gè)色譜峰的峰面積增加，可能是炮制后這些成分容易煎出；而色譜峰6、7、8等9個(gè)色譜峰的峰面積減少，推測理中丸生品經(jīng)炮制后部分成分含量減少。理中丸生品經(jīng)炮制后其成分含量有增有減，說明炮制-配伍對理中丸水煎液指標(biāo)成分產(chǎn)生了影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，炮制-配伍對復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)有影響，而復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)可以直接影響方劑的臨床療效，但是，要闡明炮制-配伍前后復(fù)方成分的變化機(jī)理還需要結(jié)合質(zhì)譜分析和藥效學(xué)等手段進(jìn)行進(jìn)一步的研究。