陳浩楠 劉群 王菁 徐赟霞 王宇 吳艷輝 耿緒云 孫金生 薛淑霞

摘?要：根據偷死野田村病毒（CMNV）的保守基因序列，設計篩選出1對特異性引物CMN279，利用已公布的凡納濱對蝦白斑綜合征病毒（WSSV）和傳染性皮下及造血器官壞死病毒（IHHNV） 特異性引物WSS235和IHHN356，建立了一種同時檢測WSSV、IHHNV和CMNV的多重 PCR 檢測方法。收集18種病原、健康對蝦組織及WSSV、IHHNV、CMNV陽性病料，開展特異性測試，該方法可以特異性擴增出WSSV、IHHNV、CMNV基因片段，健康對蝦肌肉組織、其他18種病原均未擴增出任何片段，特異性強。應用克隆方法制備目的基因質粒，應用連續(xù)稀釋質粒方法開展靈敏度測試，測定該方法檢測靈敏度分別為WSSV 9.74 fg、IHHNV 7.65 fg、CMNV 10 fg;與已報道的多重PCR檢測靈敏度相比較，檢測靈敏度提高10倍。應用本研究建立的多重PCR檢測方法與實驗室標準檢驗方法同時進行22個樣品檢驗，多重PCR檢驗方法的檢驗結果與實驗室標準方法檢驗結果符合率為100%。上述實驗結果表明：本研究建立的多重PCR檢驗方法具有特異性強、靈敏度高、檢驗時間短、檢驗結果準確度高的特點，可用于WSSV、IHHNV和CMNV三種病原的快速檢測診斷。

關鍵詞：多重PCR;白斑綜合征病毒;傳染性皮下及造血器官壞死病毒;偷死野田村病毒

白斑綜合征病毒 （WSSV）和傳染性皮下和造血器官壞死病毒（IHHNV）是當前危害全球對蝦養(yǎng)殖業(yè)的兩種主要病原[1]，其引起的對蝦疾病被世界動物衛(wèi)生組織（World Organisation for Animal Health， OIE）《水生動物衛(wèi)生法典》收錄，被列為需要報告的水生動物病毒性疫病。2009年，上述兩種疾病被農業(yè)部《一、二、三類動物疫病病種名錄》列為水生生物一、二類動物疫病病原[2]，并被農業(yè)部列入《水生動物疫病監(jiān)測計劃》，在重要養(yǎng)殖區(qū)域進行定時、定點監(jiān)測。而偷死野田村病毒（CMNV）是導致對蝦病毒性偷死病的病原，是近年來新發(fā)現的一種病毒，成為危害對蝦養(yǎng)殖的又一個重要病原[3]。這三種病毒的存在，嚴重影響到對蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，每年造成巨大的經濟損失。

目前，檢測對蝦病毒的方法有很多種。其中，組織病理學方法和電鏡技術存在耗時費力、操作繁瑣的問題，實用性較差。而免疫學方法存在抗體不易獲得和成本過高的問題，很難在生產中進行推廣應用。隨著分子生物技術的發(fā)展而出現的常規(guī)PCR檢測技術，因其具有特異性強、反應迅速、靈敏度高的特點，而被廣泛應用于對蝦病毒檢測。但是，常規(guī)PCR和RT-PCR也具有局限性，一次PCR反應只能檢測一種病原。多重PCR技術的誕生剛好彌補了上述缺點，其突出特點是一次PCR反應可同時檢測多種病原，在對蝦病原檢測中具有很高的實用價值[4]。

本研究在前人的研究基礎上，以北方對蝦養(yǎng)殖過程中的常見病毒為研究對象，依據現有序列，建立WSSV、IHHNV、CMNV 多重PCR檢測技術。在常規(guī)病原檢測中使用該方法，可以一次檢測WSSV、IHHNV、CMNV 三種病原的攜帶情況，大大降低工作量，節(jié)約檢測時間和檢測成本，在對蝦健康養(yǎng)殖和產業(yè)發(fā)展的生物安全監(jiān)控中具有重要意義[5]。

1?材料與方法

1.1?實驗材料

試驗所需的攜帶WSSV、IHHNV和CMNV陽性樣品材料由天津市水生動物疫病預防控制中心實驗室提供，樣品編號分別為ZX2015-JY62、ZX2015-JY1656和ZX2015-JY1636。

TOP10感受態(tài)細胞（CB104）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（TIANGEN， DP209-03）、TIANprep Mini Plasmid Kit質粒小提試劑盒（TIANGEN， DP103）、TIANamp Genomic DNA Kit血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒均購于天根生化科技（北京）有限公司。

pMD18-T Vector （TaKaRa， D101A）購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.2?主要試劑

Ex Taq DNA 聚合酶，10×Ex Taq Buffer （Mg2+ free），MgCl2 （25 mmol/L），dNTP mixture （10 mmol/L），DL2000 DNA Marker，均購于寶生物工程（大連）有限公司。RNase-Free H2O，TRIzol Reagent，購于北京索萊寶科技有限公司。PCR引物由金唯智生物科技有限公司（北京）合成。LB培養(yǎng)基購于北京陸橋有限公司。

1.3?試驗方法1.3.1?引物設計與合成?依據NCBI提供的偷死野田村病毒（CMNV）序列（Gene Bank NO.： KM112247），利用Primer Premier 5軟件，設計篩選特異性引物CMN279。選取我單位設計的引物序列WSS235（CN 1944666A）為對蝦白斑綜合征病毒特異性引物。查閱OIE水生動物疾病診斷手冊，選擇IHHN356為傳染性皮下及造血器官壞死病毒特異性引物。引物由金唯智生物科技有限公司（北京）合成，引物序列見表1。

1.3.2?核酸提取及cDNA合成?取100 mg鰓絲、肝胰腺，放入1.5 mL離心管中，用小剪刀剪碎。樣品的DNA模板按照TIANamp Genomic DNA Kit血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書進行提取，將提取后的模板-20 ℃保存?zhèn)溆?。樣品的RNA模板按照TRIzol Reagent說明書進行提取，利用隨機引物，將提取的RNA反轉錄為cDNA，并保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?

1.3.3?單重PCR擴增及質粒構建?參照Ex Taq DNA聚合酶（TaKaRa， RR01AM）說明書，配置25 μL PCR反應體系：10× Ex Taq Buffer （Mg2+ free） 2.5 μL，MgCl2 （25 mmol/L） 1.5 μL，dNTPs （10 mmol/L） 2 μL，F （20 μmol/L） 0.5 μL，R （20 μmol/L） 0.5 μL，Ex Taq DNA聚合酶（5 U/μL） 0.125 μL，RNase-Free H2O 16.875 μL，模板1 μL。PCR程序：95 ℃預變性4 min，95 ℃變性20 s，56 ℃復性30 s，72 ℃延伸25 s，40個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保溫。進行PCR擴增后，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，并觀察結果。將PCR產物送往金唯智生物科技有限公司（北京）進行測序。

利用連接、轉化、克隆等技術手段，獲得濃度和純度較高的含有目的基因片段的重組質粒。用TIANprep Mini Plasmid Kit質粒小提試劑盒（TIANGEN， DP103）進行質粒提取，并使用超微量核酸測定儀（IMPLEN， P330）測定其濃度及純度，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4?多重PCR檢測方法的建立和優(yōu)化?以Ex Taq DNA聚合酶提供的體系為基礎，建立多重PCR反應體系和PCR反應程序。以建立的多重PCR反應體系和PCR反應程序為基礎，依次進行Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度、Ex Taq DNA聚合酶濃度和退火溫度的優(yōu)化。

設計Mg2+在體系中的終濃度為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol/L等六個濃度梯度，進行體系中Mg2+濃度的優(yōu)化。

設計dNTPs在體系中的終濃度為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L等六個濃度梯度，進行體系中dNTPs濃度的優(yōu)化。

設計引物在體系中的終濃度為0.1、0.25、0.5、1.0、1.5 μmol/L等六個濃度梯度，進行體系中引物濃度的優(yōu)化。

設計Ex Taq DNA聚合酶在體系中的終濃度為0.04、0.08、0.12、0.16、0.2、0.24 U/μL等六個梯度，進行體系中Ex Taq DNA聚合酶濃度的優(yōu)化。

以單重PCR反應程序為基礎進行反應程序的優(yōu)化，退火溫度共設置6個梯度，分別為49.5、52.5、55.5、58.5、61.5和64.5 ℃。

1.3.5?多重PCR反應的特異性測試

以凡納濱對蝦基因組為模板，引物分別為對蝦18S rDNA引物和多重PCR反應引物，利用優(yōu)化后的體系和程序，進行基因組特異性測試。

利用目前實驗室掌握的病原（寄生蟲、細菌、病毒），進行該方法的特異性測試。病原主要包括：病毒性神經壞死病病毒（Viral Nervous Necrosis Virus，VNNV）、大鯢虹彩病毒（Andrias davidianus iridovirus，ADIV）、中華鱉虹彩病毒（Soft shelled turtle iridovirus，STIV）、草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus-873，GCRV-873）、鯉春病毒（Spring viraemia of carp virus，SVCV）、傳染性造血器官壞死病毒（Infectious hematopoietic necrosis virus ， IHNV）、錦鯉皰疹病毒（Koi hepesvirus，KHV）、草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus-9014，GCRV-9014）、壞鰓指環(huán)蟲（Dactylogyrus vastator）、鳙指環(huán)蟲（Dactylogyrus aristichthy）、小鞘指環(huán)蟲（Dactylogyrus vaginulatus）、頁形指環(huán)蟲（Dactylogyrus lamellatus）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）、創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）、霍亂弧菌（Vibrio cholerae）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、副溶血弧菌（Vibrio paraheamolyticus）、肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）、副溶血弧菌高致病性基因（PirA、PirB）等。

1.3.6?多重PCR反應的靈敏性測試?以10倍比梯度稀釋的質粒（E+0～E+10）作為模板，利用優(yōu)化后的體系和程序，進行靈敏性測試。測試過程中，以電泳條帶明晰可辨為檢測臨界線，從而測試該方法的靈敏性。

1.3.7?多重PCR反應的準確性測試?隨機抽取2015年實驗室檢驗樣品22個，同時進行多重PCR檢測和標準方法檢測，以標準方法PCR檢測結果為準，對多重PCR檢測結果進行比較，從而評價多重PCR檢測方法的準確性。標準方法見表2。

2?結果

2.1?單重PCR擴增結果

采用合成的引物WSS235、IHHN356和CMN279，分別對相應的病毒進行擴增，將PCR產物送往金唯智生物科技有限公司（北京）進行測序。結果顯示，三對引物均能擴增出相應病毒的單一目的條帶（圖1），測序后經比對發(fā)現，擴增序列為相應病毒的特異性目的基因。

2.2?多重PCR檢測方法的確定

通過對Mg2+濃度（圖2）、dNTPs濃度（圖3）、引物濃度（圖4）和Ex Taq DNA聚合酶濃度（圖5）進行優(yōu)化，得出多重PCR反應體系為：10×Ex Taq Buffer （Mg2+ free） 2.5 μL，MgCl2 （25 mmol/L） 2.0 μL，dNTPs （10 mmol/L） 2.5 μL，WSSV、IHHNV和CMNV上下游引物 （20 μmol/L） 分別1.25 μL，Ex Taq DNA聚合酶（5 U/μL） 1.0 μL，RNase Free H2 O 6.5 μL，模板3.0 μL。

通過對退火溫度（圖6）進行優(yōu)化，得到PCR反應程序：95 ℃預變性4 min，95 ℃變性20 s，61.5 ℃復性30 s，72 ℃延伸25 s，40個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保溫。

2.3?多重PCR反應的特異性

以凡納濱對蝦基因組為模板，引物分別為對蝦18S rDNA引物和多重PCR反應引物，利用優(yōu)化后的體系和程序，進行基因組特異性測試，結果見圖7。擴增結果顯示，當模板為對蝦基因組時，進行多重PCR反應，無擴增條帶出現，說明建立的多重PCR反應不能擴增凡納濱對蝦基因組。

以20種病原的DNA或cDNA為模板進行多重PCR反應，結果見圖7。電泳圖顯示，陽性對照在235 bp、279 bp、356 bp處出現擴增條帶，且條帶清晰，無拖尾，也未發(fā)現由于引物二聚體或引物錯配而出現的非特異性擴增條帶;同時，其他非目標病原DNA或cDNA均無擴增條帶出現。由此說明該方法特異性強，引物之間無干擾。

2.4?多重PCR反應的靈敏性

多重PCR反應的靈敏性測試結果如圖8所示，當稀釋度為105copies/μL即模板中WSSV含量為0.974 pg、CMNV含量為1 pg、IHHNV含量為0.765 pg時，擴增效率明顯減弱，目的條帶變暗;當稀釋度到103copies/μL及模板中WSSV含量為9.74 fg、CMNV含量為10 fg、IHHNV含量為7.65 fg時，能夠清晰看到電泳條帶;當稀釋度到102copies/μL及模板中WSSV含量為0.974 fg、CMNV含量為1 fg、IHHNV含量為0.765 fg時，目的片段模糊。因此，本實驗建立的多重PCR的檢出限為103copies/μL，即模板中WSSV含量為9.74 fg、CMNV含量為10 fg、IHHNV含量為7.65 fg。

2.5?多重PCR反應的準確性測試

抽取實驗室保存的檢驗樣品22個，同時進行標準方法檢測和多重PCR檢測，以標準方法PCR檢測結果為準，對多重PCR檢測結果進行比較，從而評價多重PCR方法的準確性。對比結果統(tǒng)計見表3。

注：B： 空白對照;M： DL 2000Marker;+： 陽性對照;1泳道： 1010copies/μL ;2泳道： 109copies/μL;3泳道： 108copies/μL ;4泳道： 107copies/μL;5泳道： 106copies/μL ;6泳道： 105copies/μL ;7泳道： 104copies/μL ;8泳道： 103copies/μL;9泳道： 102copies/μL ;10泳道： 101copies/μL;11泳道： 100copies/μL圖8?靈敏度測試結果

應用建立的多重PCR方法進行對蝦樣品檢驗，檢測單一病毒的準確率為100%，檢測混合病毒的準確率為100%，表明該方法準確可靠。

3?討論

多重PCR（multiplex PCR，又稱多重引物PCR或復合PCR），是在常規(guī)PCR基礎上發(fā)展起來的一種DNA擴增技術，其反應原理、試劑、操作、儀器設備等與常規(guī)PCR反應相同，其突出特點是一次 PCR 反應即可同時檢測、鑒別出多種病原體，在臨床診斷病毒的混合感染中具有很高的實用價值[4]。該理論最早被Chamberian提出[6]，到2002年該技術被用于檢測凡納濱對蝦同時攜帶WSSV、TSV的情況[7]，隨后該方法在臨床檢驗中發(fā)揮重要作用。

隨著蝦類病毒混合感染的情況越來越嚴重，在進行蝦病診斷和親蝦篩選過程中，常規(guī)PCR和RT-PCR技術雖然較傳統(tǒng)檢驗方法縮短了檢驗時間，提高了準確性，但是仍然要消耗大量的檢測試劑、需要足夠多的儀器設備以及完成大量的重復工作，這些問題給實驗室造成了巨大的壓力[5]。本研究建立的多重PCR檢測方法，只需一次PCR反應，就能檢測3種病毒，節(jié)約了2/3的檢測成本。另外，該方法可以在8 h內同時完成凡納濱對蝦攜帶WSSV、IHHNV和CMNV的快速檢測，較常規(guī)PCR方法節(jié)省時間5 d，大大提高了檢測效率，縮短了檢測周期，能夠滿足臨床快速檢測的要求，可用于凡納濱對蝦病毒混合感染的臨床檢測和親蝦篩選等工作。

本研究通過Primer Premier 5軟件進行引物設計，并嚴格遵守引物設計原則，最終獲得多對特異性引物;結合現有PCR條件，篩選出符合要求的特異性引物。通過上述方法獲得的引物序列，具有擴增片段短、擴增效率高、特異性強等特點。這是多重PCR檢測方法靈敏度高的一個重要原因，而另一個原因是DNA聚合酶的改變。Ex Taq DNA 聚合酶與r Taq DNA 聚合酶相比，具有擴增效率更高、錯配率更低的特點。因此，本研究選擇擴增效果更好的Ex Taq DNA 聚合酶作為多重PCR反應的催化劑，能夠更好的完成多重PCR反應，保證PCR結果的準確性，從而提高了多重PCR檢測方法的靈敏度。

在我國，楊冰等首次研究了養(yǎng)殖對蝦同時攜帶WSSV、IHHNV的情況，并利用多重PCR技術檢出兩種病毒，該體系對WSSV DNA的檢測靈敏度為2.6 pg，對IHHNV DNA檢測靈敏度為99.25 fg[8]。吳思思等用多重PCR同時檢測WSSV和TSV，其靈敏度分別為5 pg和0.5 pg。此后，很對學者開展了利用多重PCR技術檢測蝦類病原的研究，其靈敏度一般在0.1～10 pg范圍內。而本研究建立的多重PCR檢測方法，能夠最低檢測出WSSV 9.74 fg、CMNV 10 fg、IHHNV 7.65 fg，比其他多重PCR反應靈敏度提高10倍。

利用多重PCR檢測方法與實驗室現有檢測方法分別對實驗室樣品進行檢測，發(fā)現兩種方法的檢測結果完全一致，說明該方法的準確性高。因此，本研究建立的多重PCR檢測方法，具有檢驗時間短、特異性強、靈敏度高、結果準確的特點。

WSSV、IHHNV和CMNV作為目前對蝦養(yǎng)殖生產中重要的病毒病原，不僅能夠單獨感染養(yǎng)殖對蝦，還能夠混合感染。在對上一年度檢驗結果進行統(tǒng)計時，發(fā)現混合感染樣品占樣品總數的10%，這說明多種病毒混合感染的現象日趨嚴重。本研究建立的多重PCR檢測方法具有快速、準確的特點，滿足生產的需要。在親蝦篩選、苗種檢疫中應用，能保證養(yǎng)殖者投放的蝦苗安全、可靠;在養(yǎng)殖過程中定期檢測病原攜帶情況，可以及早發(fā)現疾病，防止疾病的爆發(fā)流行，最大限度地減少經濟損失，保證對蝦健康養(yǎng)殖和產業(yè)發(fā)展。

參考文獻：

[1] 丁東，熊云，方勇新，等.WSSV和IHHNV對蝦病毒的膠體金免疫層析快速檢測[J].水產養(yǎng)殖，2014，35（10）：1-7.

[2] 農業(yè)部漁業(yè)漁政管理局，全國水產技術推廣總站.水生動物防疫工作實用手冊[M].北京：中國農業(yè)出版社，2015：112-113.

[3] Qingli Zhang， Qun Liu，Shang Liu，et al.A new nodavirus is associated with covert mortality disease of shrimp[J].Joumal of General Virology，2014，95：2700-2709.

[4] 吳思思，金立方，余招鋒.凡納濱對蝦桃拉病毒和白斑病毒多重PCR檢測體系的建立[J].農業(yè)與技術，2012， 32（10）：81-83.

[5] 劉飛，張寶存，張曉華，等.對蝦6種病毒多重PCR檢測方法的建立[J].漁業(yè)科學進展，2014， 35（1）：60-67.

[6] Chamberlain ，JS， ?Gibbs RA， ?Ranier JE， et al. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification [J].Nucleic Acids Res，1988，16（23）：111-141.

[7] Tsai J M，Shiar L J，Lee H H，et al.Simultaneous detection of white spot syndrome virus（WSSV） and Taura syndrome virus（TSV） by multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR） in Pacific white shrimp Penaeus vannamei[J]. Dis Aquat Org，50：9-12.

[8] 楊冰.對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）的檢測及其流行情況初步調查[D].青島：中國海洋大學，2004.

（收稿日期：2018-10-15）