郝樹廷 韓璐 張明遠(yuǎn) 劉麗

摘?要：在海洋中，石油-礦物顆粒團(tuán)聚體（Oil-Mineral Aggregation，OMA）在油的縱向遷移及去除中發(fā)揮重要作用。采用模擬實驗研究了細(xì)菌、微藻及菌藻共同作用下OMA的形成及特性。結(jié)果表明與無菌條件下生成的油滴狀OMA相比，菌、藻作用下生成的OMA有絲狀、纖維狀、網(wǎng)狀和球狀，且OMA生成速率加快，最快3 h即生成。OMA的沉降速率隨時間延長逐漸變快。菌藻共同作用下OMA沉速最大，且胞外聚合物透明顆粒（Transparent Exopolymer Particles，TEP）含量最大。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌;微藻;OMA;沉降速率;TEP

隨著全球石油產(chǎn)品需求的增加和海洋石油運輸量的加大，海上溢油事故頻繁發(fā)生。溢油可與海洋中的礦物顆粒相互作用形成油-礦物顆粒聚集體OMA并發(fā)生沉降，繼而影響溢油的環(huán)境行為。以往的研究中主要考察了不同物化因素對OMA的影響，對微生物作用下OMA的形成及其特性研究的較少。本研究通過模擬實驗，分別研究了細(xì)菌、微藻及菌藻共同作用下OMA的形成及特性。

1?材料與方法

1.1?實驗材料

由蒸餾水和海水素按一定比例配制鹽度為35‰的人工海水，pH=7.8;實驗用油為青島石化廠輕質(zhì)原油;采用捷菲特001溢油分散劑使溢油迅速乳化分散;采用高嶺土來模擬海洋中的懸浮顆粒物，實驗用高嶺土平均密度為2.6 g/cm3，平均粒徑為2.25 μm。

在青島小港碼頭近岸海域取石油污染海水，人工海水培養(yǎng)基和微量元素混合液用于石油烴降解菌的富集培養(yǎng)[1];每日定時測其OD600值，繪制細(xì)菌生長曲線，選取對數(shù)生長期后期的培養(yǎng)菌液制備菌懸液。

以青島大扁藻為代表性微藻，培養(yǎng)大扁藻所用海水取自青島魯迅公園附近海濱，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，121 ℃高壓蒸汽滅菌，冷卻后待用。配制營養(yǎng)液：采用f/2培養(yǎng)基[2-3]，在指數(shù)生長期接種，培養(yǎng)溫度20±1 ℃，光照強(qiáng)度1 200 lx，光暗周期12 h∶12 h。每天搖動錐形瓶數(shù)次，避免大扁藻黏附于瓶壁。

1.2?實驗設(shè)計

取12個容積為250 mL的錐形瓶，分別加入100 mL人工海水，加入5 mg高嶺土，121 ℃高壓蒸汽滅菌、冷卻，分別向錐形瓶內(nèi)準(zhǔn)確加入經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌的0.06 g輕質(zhì)原油和10 μL分散劑，將上述錐形瓶分為4組，每組3個平行樣，向第1組錐形瓶每瓶加入20 mL無菌水作為對照，第2組錐形瓶每瓶加入20 mL菌懸液，第3組錐形瓶每瓶加入20 mL大扁藻藻液，第4組錐形瓶內(nèi)每瓶加入20 mL大扁藻藻液和20 mL菌懸液，pH調(diào)至8，鹽度為35‰，將錐形瓶用高溫滅菌的紗布密封，保證錐形瓶透氣且不被外源菌污染，置于25 ℃、轉(zhuǎn)速為160 r/min的恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，觀察錐形瓶內(nèi)OMA形成情況并記錄分析。

1.3?測定方法

（1）光密度（Optical Density，OD）法[4]測定細(xì)菌生長量。

（2）采用血球計數(shù)板對青島大扁藻進(jìn)行計數(shù)。

（3）利用石油尤其是油中多環(huán)芳烴類化合物在紫外燈照射下顯熒光的原理，使用Olympus—IX83倒置熒光顯微鏡對OMA形態(tài)進(jìn)行觀察，比較分析OMA尺寸、形態(tài)等參數(shù)。

（4）用移液槍吸取肉眼可見的OMA絮體，并手持移液槍以與液面近乎平行的角度，緩慢將絮體注入含有人工海水的比色管中，拍攝并記錄下其沉降過程，依據(jù)沉降距離和沉降時間，來計算其沉降速率[5]。

（5）TEP含量測定采用阿爾新藍(lán)染色半定量分析法[6]。將阿爾新藍(lán)染色后的樣品置于光學(xué)顯微鏡100×倍觀察，統(tǒng)計相同視野下直徑大于50 μm的TEP的數(shù)量及表面積，總表面積越大TEP含量越高。

2?結(jié)果與討論

2.1?生成速率與形態(tài)

無菌條件下，取培養(yǎng)至第7天的錐形瓶內(nèi)溶液少許，置于熒光顯微鏡下觀察。

如圖1所示，觀察到的OMA大多數(shù)是油滴狀OMA，是由油滴表面包裹一層細(xì)小顆粒物高嶺土或是油滴表面黏附高嶺土的凝聚體構(gòu)成。觀察到的油滴狀OMA有單滴狀OMA，即OMA中只有單個油滴存在（如圖1a所示），單滴狀OMA中油滴直徑在15～30 μm之間;溶液內(nèi)也形成了多滴狀OMA，即OMA中結(jié)合多個油滴形成（如圖1b、c所示），多滴狀OMA中油滴的尺寸較單滴狀OMA中油滴偏小，直徑約在5～20 μm之間。顯微鏡照片中，綠色顯熒光的部分為油滴，油滴周圍包裹的顏色較黑的部分為固體顆粒物高嶺土。無菌條件下OMA在12 h內(nèi)即可生成，尺寸為 μm級。

和無菌條件下形成的油滴狀的OMA相比，細(xì)菌作用下形成的OMA生成速率快，在7 h內(nèi)即可生成，OMA尺寸較大，少數(shù)絮體可達(dá)cm級（實驗過程中觀察到，此處未列出），而且熒光顯微鏡下，OMA的形態(tài)呈多樣性，依據(jù)形態(tài)特征，主要分為以下4種（見圖2）：絲狀OMA、纖維狀OMA、網(wǎng)狀OMA和球狀OMA。如圖2a，絲狀OMA：外形似盤曲的樹枝，形態(tài)纖長，較松散，易破碎。圖2b，纖維狀OMA：結(jié)構(gòu)密實，不易破碎，熒光性強(qiáng)，捕獲油能力強(qiáng)。圖2c，網(wǎng)狀OMA：比絲狀OMA和纖維狀OMA松散，好似一張網(wǎng)將分散的油滴捕獲在其中。圖2d，球狀OMA，形態(tài)相對規(guī)則，長、短徑區(qū)別不大，大小一般在mm級，較網(wǎng)狀OMA密實，較纖維狀OMA松散，不易破碎，熒光性強(qiáng)，捕獲的石油量較多。受水動力等其他因素的影響，由于OMA形態(tài)的易碎性，其形態(tài)會相互轉(zhuǎn)變。

在細(xì)菌作用下，當(dāng)足夠多的高嶺土黏附到油表面時會有一層油膜分離下來，形成尺寸較大的OMA，OMA是由固體顆粒物混合在油里形成，所以其大小、形態(tài)變化很大。絲狀OMA和網(wǎng)狀OMA看起來就像是膜一樣，通常是漂浮或是懸浮在水中，寬度可以達(dá)到數(shù)mm，這種絲狀OMA很容易被強(qiáng)剪切作用破壞。纖維狀OMA和球狀OMA結(jié)構(gòu)緊湊，熒光性強(qiáng)，多沉降于錐形瓶底部。

在加入青島大扁藻藻液的錐形瓶內(nèi)取少許液體置于倒置熒光顯微鏡下觀察。與無菌條件和細(xì)菌作用下形成的OMA相比，大扁藻作用下形成的絮體以絲狀OMA（見圖3）為主。由于礦物顆粒表面黏附石油，在明場下不易觀察。形成的OMA對石油的捕獲比較均勻，且微藻之間的孔隙，可能為分散石油、黏性物質(zhì)及高嶺土提供較好的反應(yīng)場所。與前兩種條件下形成的OMA相比，大扁藻作用下形成的OMA尺寸大，包裹油滴多，形態(tài)也不規(guī)則。實驗觀察到有一些死亡大扁藻包裹在OMA中，一定程度上增大了OMA的尺寸，還有一些大扁藻圍繞在絮體周圍，可能在OMA的聚集過程中發(fā)揮重要作用。

圖4為石油烴降解菌與青島大扁藻作用下形成的OMA在顯微鏡下的圖片。OMA表面黏附少量油滴，周圍分散著一些小絮體。與無菌條件、細(xì)菌和大扁藻單獨作用下相比，細(xì)菌與大扁藻混合作用下OMA形成速率快，3 h內(nèi)即可生成。OMA尺寸更大，顯微鏡明場條件下觀察到OMA結(jié)構(gòu)更緊湊，在水動力條件下不易破碎。在熒光條件下觀察到，OMA內(nèi)裹挾的油滴較多且油滴尺寸大小不一。

細(xì)菌與微藻混合作用下形成的OMA絮體尺寸較大，一方面原因可能是細(xì)菌和微藻都會生成TEP，TEP的高黏性有助于大尺寸OMA的形成。另一方面，RieBeSle等人[7]認(rèn)為，高的浮游植物濃度是大型絮狀物形成的必要條件。當(dāng)微藻暴露在陽光下，光合作用產(chǎn)生的多余有機(jī)碳會以溶解有機(jī)物的形式釋放到周圍水體中[8]，供細(xì)菌生長繁殖并生成更多的TEP，進(jìn)而形成更大尺寸的OMA。此外，Eenennaam等人[9]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)只存在微藻及其與菌混合作用下，都可生成TEP，但后者生成量更多。因此，細(xì)菌與微藻共同作用下有助于OMA的形成。

無菌、細(xì)菌、大扁藻及菌藻混合作用下OMA的生成速率逐步加快，生成時間由最初的12 h減為3 h，原因可能是細(xì)菌與微藻的加入加大了石油與礦物顆粒的碰撞機(jī)率，且菌藻分泌的胞外聚合物進(jìn)一步促進(jìn)了絮體的聚集。

對OMA形成時間的機(jī)理探討：

油滴與礦物顆粒二者碰撞（損失）可由下式描述[10]：

由于微藻和細(xì)菌釋放的胞外聚合物的存在，絮凝效率（α）將具有更高的價值[12]?；钚曰鶊F(tuán)的存在使TEP表現(xiàn)出膠狀特征，為聚集體提供了黏著的基質(zhì)，有利于OMA的絮凝。

2.2?平均沉降速率

如圖5所示，無菌、細(xì)菌、青島大扁藻及菌藻混合條件下生成OMA的沉降速率隨時間延長而增大，在第12天取得最大沉降速率，分別為0.70、5.33、6.13和6.17 mm/s，與第1天相比，沉速分別增大29.63%、38.80%、28.51%和26.58%。無菌條件下生成的OMA絮體的沉降速率較小，與其他3種條件相比，OMA沉速相差一個數(shù)量級。

OMA形成初期，絮體結(jié)構(gòu)比較松散，沉速較小，在水動力條件下，OMA清除和捕獲礦物顆粒，密度變大，沉速加快。OMA的沉降速度可用改進(jìn)的Stokes方程描述[13]。

其中g(shù)是重力加速度;ρa(bǔ)是聚集體的密度;ρw是海水密度;V是聚合體積;CD是阻力系數(shù);A是垂直于沉降方向的聚集體的最大橫截面積。阻力系數(shù)通常與形狀和雷諾數(shù)有關(guān)，在實驗過程中，OMA為自由沉淀，則可考慮其狀態(tài)為層流沉淀。層流狀態(tài)對應(yīng)到圖6所示的關(guān)系中，所處范圍雷諾數(shù)Re<1，則此時阻力系數(shù)與雷諾數(shù)的關(guān)系式為：

因此，OMA的沉降速率與其形狀和尺寸有關(guān)。OMA體積越大，結(jié)構(gòu)密實，沉降速率越大。同時期，無菌條件下生成的OMA尺寸較小，且OMA中油滴尺寸相對較大，OMA密度小，其沉降速率最小。細(xì)菌及微藻單獨作用下，OMA沉速加快，原因可能是細(xì)菌和微藻分泌了一定量的TEP，TEP的高黏性使得OMA黏附了更多的礦物顆粒，同時使絮體更加密實，不易破碎，密度增大，沉降速率加快。細(xì)菌和微藻共同作用下形成OMA的沉速最大，但并非二者單獨作用下OMA沉速之和，原因可能是細(xì)菌與微藻間存在一定的競爭關(guān)系，TEP生成量變化不大，即OMA聚合力相差不大。

2.3?TEP含量

如圖7所示，細(xì)菌、微藻及二者共同作用下經(jīng)阿爾新藍(lán)染色的TEP數(shù)量分別為10個、10個和15個，TEP面積為3.4×108、5.0×108、6.2×108 μm2。

TEP是EPS的部分糖性成分[14]，EPS是由海洋生物分泌，呈凝膠狀的有機(jī)高分子量天然聚合物[15]，具有一定的黏性，在OMA的形成過程中具有重要作用。

大扁藻在培養(yǎng)至第7天時產(chǎn)生的TEP含量比石油烴降解菌產(chǎn)生的TEP含量高，表明大扁藻在TEP的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。細(xì)菌與微藻具有復(fù)雜的相互關(guān)系。微藻在新陳代謝過程中產(chǎn)生并分泌于水體的有機(jī)物質(zhì)，被細(xì)菌攝取后，一部分經(jīng)細(xì)菌代謝后以礦物或其他形式釋放回海洋中，又為微藻提供營養(yǎng)及必須的生長因子[16]，因此微藻與細(xì)菌共存情況下可能更有利于TEP的生成。TEP與絮體的凝聚有關(guān)，TEP含量低，不易形成較大尺寸的OMA，這與菌藻共同作用下TEP生成量高，OMA尺寸更大的實驗結(jié)果相符。

TEP含量不僅對形成OMA的尺寸有影響，也影響著OMA的沉降速率。細(xì)菌與微藻作用下TEP含量高，OMA沉降速率大;細(xì)菌作用下TEP含量較低，OMA沉速較小，即TEP含量越高，OMA結(jié)構(gòu)密實，沉降速率越大，而TEP含量低，生成的OMA較松散，沉降性能差。

在海洋中，大量的TEP通過改變凝聚動力學(xué)，影響著OMA的動態(tài)變化，為海洋環(huán)境的生物化學(xué)組成（包括細(xì)菌、浮游植物、碳以及活性微量元素）提供了重要媒介[17]。

3?結(jié)論

與無菌條件下生成的油滴狀OMA相比，菌、藻作用下生成的OMA有絲狀、纖維狀、網(wǎng)狀和球狀，OMA生成速率加快，最快3 h內(nèi)即生成OMA。

無菌、細(xì)菌、青島大扁藻及菌藻混合條件下生成OMA的沉降速率隨時間延長而增大，在第12天取得最大沉降速率，分別為0.70、5.33、6.13和6.17 mm/s，與第1天相比，沉速分別增大29.63%、38.80%、28.51%和26.58%。

細(xì)菌、微藻及二者共同作用下經(jīng)阿爾新藍(lán)染色的TEP數(shù)量分別為10個、10個和15個，TEP面積為3.4×108、5.0×108、6.2×108 μm2。

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