陳昊，夏正遠

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東湛江524000)

細胞死亡根據(jù)形態(tài)學(xué)改變可分為三種不同的形式：Ⅰ型細胞死亡或凋亡，表現(xiàn)為細胞質(zhì)收縮、核固縮、核碎裂和質(zhì)膜起泡，最終形成明顯的完整小囊泡(俗稱凋亡小體)，囊泡被具有吞噬活性的相鄰細胞吸收并在溶酶體中降解；Ⅱ型細胞死亡或自噬，表現(xiàn)為廣泛的細胞質(zhì)空泡化，同樣最終導(dǎo)致吞噬細胞攝取和隨后的溶酶體降解；Ⅲ型細胞死亡或壞死，表現(xiàn)為細胞脹大、胞膜破裂和細胞內(nèi)容物外溢，引起嚴(yán)重的局部炎癥反應(yīng)。2005年，Degterev等[1]發(fā)現(xiàn)一種新的細胞死亡機制即壞死性凋亡。壞死性凋亡同時具有壞死和凋亡的特征。壞死性凋亡已被證實在心血管疾病(動脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注損傷、心肌梗死、心臟重塑等)發(fā)揮重要作用[2]。靶向壞死性凋亡的信號傳導(dǎo)途徑可為心血管疾病的治療提供新的方向。心血管疾病是目前主要的死亡原因之一[3]。以往研究表明，心肌細胞主要死于壞死和凋亡。Kung等[4]提出壞死性凋亡為一種介導(dǎo)心血管疾病中細胞死亡的新機制。如果機體內(nèi)細胞死亡不受限制，則可能發(fā)生組織損傷和退行性疾病。因此，了解壞死性凋亡參與心肌損傷的機制對于防治心肌損傷及功能衰退有重要意義。本文就壞死性凋亡在心肌細胞損傷中的作用機制作一綜述。

1 細胞壞死性凋亡在心肌損傷中的作用機制

1.1 信號通路及其調(diào)控機制 細胞壞死性凋亡是由特異性死亡受體檢測到細胞外或細胞內(nèi)微環(huán)境紊亂而引發(fā)的調(diào)節(jié)性細胞死亡形式，其死亡受體包括(但不限于)自殺相關(guān)因子(FAS)和1型腫瘤壞死因子受體(TNFR1)[1,5～8]。此外，病原體識別受體如Toll樣受體(TLR)3、TLR4和Z-DNA結(jié)合蛋白1也可介導(dǎo)細胞壞死性凋亡[9～11]。在分子水平上，壞死性凋亡嚴(yán)重依賴于蛋白激酶(RIP)3和混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(MLKL)的順序激活[12,13]。在通過TNFR1啟動壞死性凋亡時，RIP3被RIP1激活(在caspase-8無活性的情況下)，其機制涉及各自的RIP同型互作基序結(jié)構(gòu)域與RIP1催化活性之間的相互作用[14～16]。有活性的RIP3催化MLKL磷酸化，導(dǎo)致MLKL寡聚體(多為三聚體或四聚體)形成并易位至質(zhì)膜，通過翻轉(zhuǎn)機制結(jié)合特定的磷脂酰肌醇磷酸酯類，從而引發(fā)質(zhì)膜透化[13]。

通常細胞因子如RIP1、Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白、cylindromatosis、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(Traf2)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和caspase-8可激活死亡受體而誘導(dǎo)凋亡。然而，當(dāng)細胞凋亡受到抑制或caspase-8的活性減弱導(dǎo)致細胞凋亡未處于最佳狀態(tài)時，可通過RIP1或RIP3介導(dǎo)壞死性凋亡。RIP1和RIP3是壞死性凋亡的特征性蛋白，是負(fù)責(zé)介導(dǎo)細胞死亡的重要激酶[17]。此外，MLKL也是壞死性凋亡的直接劊子手[18]。RIP1、RIP3和MLKL之間存在以下關(guān)系[19]：死亡受體的激活進一步激活RIP1，隨后RIP1轉(zhuǎn)移并結(jié)合RIP3與MLKL，最終形成復(fù)合物；當(dāng)caspase-8被抑制時，RIP3與MLKL形成復(fù)合物誘導(dǎo)壞死性凋亡。

Guo等[20]通過抑制壞死性凋亡確定了Traf2在心肌存活和體內(nèi)平衡中的關(guān)鍵作用。該研究表明，小鼠的心臟特異性缺失Traf2引發(fā)了心肌細胞的壞死性凋亡、病理性重塑和心力衰竭。Traf2缺陷小鼠血漿TNF-α水平升高，并且TNFR1的遺傳消融在很大程度上消除了與Traf2缺失相關(guān)的病理性心臟重塑和功能障礙；從機制上講，Traf2嚴(yán)格調(diào)控RIP1-RIP3-MLKL壞死性信號傳導(dǎo)，腫瘤壞死因子相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白為其上游調(diào)節(jié)因子，轉(zhuǎn)化生長因子激酶1則為下游效應(yīng)物；RIP3的遺傳缺失在很大程度上挽救了由Traf2缺失引發(fā)的心臟重塑和功能障礙，證實了壞死性凋亡在調(diào)節(jié)病理性重塑和心力衰竭中起關(guān)鍵作用。

Luedde等[21]證實，RIP3過表達導(dǎo)致新生大鼠心室肌細胞中的RIP1蛋白水平降低。此外，Oerlemans等[22]證實，RIP1的化學(xué)抑制劑使得由缺血導(dǎo)致的心肌梗死面積減小。Adameova等[23]關(guān)于RIP1與缺血再灌注損傷的研究也得出了相同結(jié)論。說明RIP1參與了心肌梗死的病理生理過程。

除RIP3-MLKL復(fù)合物的構(gòu)成外，RIP3還可以介導(dǎo)心肌中鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的活化以誘導(dǎo)細胞壞死性凋亡。Zhang等[24]的一項研究顯示，RIP3通過激活CaMKⅡ而非通過RIP1和MLKL觸發(fā)心肌壞死性凋亡；RIP3缺乏或CaMKⅡ抑制可改善由缺血再灌注或多柔比星治療誘導(dǎo)的小鼠心肌壞死性凋亡和心力衰竭；RIP3誘導(dǎo)的CaMKⅡ活化觸發(fā)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)的開放和心肌細胞壞死性凋亡。該研究將CaMKⅡ鑒定為新的RIP3底物并詮釋了RIP3-CaMKⅡ-mPTP心肌細胞壞死性凋亡途徑，這將是治療缺血和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌損傷和心力衰竭的有效靶標(biāo)。

總之，心肌缺血再灌注損傷可引發(fā)兩種壞死性凋亡途徑，即RIP3-CaMKⅡ和RIP1-RIP3-MLKL；這些壞死性凋亡途徑參與心肌細胞的初始損失，并且可能有助于過度氧化應(yīng)激和缺血再灌注引起的額外損傷在整個心肌中擴散。

1.2 氧化應(yīng)激 RIP3在心肌細胞中表達并與線粒體共定位，并與幾種代謝酶(糖原磷酸化酶、氨酸-氨連接酶和谷氨酸脫氫酶1)相互作用。這些酶上調(diào)氧化磷酸化的底物，而氧化磷酸化是細胞中活性氧(ROS)的主要來源[25]，意味著氧化應(yīng)激與壞死性凋亡之間存在必然聯(lián)系。

糖尿病性心肌病(DCM)是糖尿病的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，高糖誘導(dǎo)的心肌細胞死亡是DCM發(fā)生的啟動因素，而氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)參與此過程。ROS通過對細胞重要成分的氧化作用促進細胞死亡，提示其可能與壞死性凋亡存在一定聯(lián)系。Liang等[26]在高糖誘導(dǎo)H9C2心肌細胞損傷的模型中證實，特異性阻斷壞死性凋亡能減輕高糖所致的細胞毒性、線粒體損傷及氧化應(yīng)激，而ROS清除劑N乙酰半胱氨酸也明顯抑制高糖引起的細胞毒性及壞死性凋亡的效應(yīng)分子RIP3的表達。

1.3 自噬 自噬對于細胞生存是一把雙刃劍，適量自噬有助于細胞存活，而過度自噬則引起細胞死亡。Ogasawara等[27]研究探討了mPTP和自噬在心肌細胞死亡中的作用，結(jié)果顯示，抑制自噬流有助于RIP1與RIP3相互作用，并促進心肌細胞的壞死性凋亡；p62與RIP1的相互作用可以隔離p62與微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ的相互作用，此為抑制自噬的基礎(chǔ)；然而，mPTP并非引起心肌細胞壞死性凋亡的主要執(zhí)行者。該研究提示RIP1是調(diào)控自噬與壞死性凋亡的關(guān)鍵節(jié)點，說明其可能成為治療心肌損傷的新靶點。

此外，對心肌細胞過度自噬的抑制作用同樣也能抑制壞死性凋亡。在特定條件下，自噬可以直接或間接誘導(dǎo)包括壞死性性凋亡在內(nèi)的細胞死亡。Liu等[28]發(fā)現(xiàn)，抑制熱休克蛋白70(HSP70)表達可促進缺氧/復(fù)氧處理后的心肌細胞自噬和壞死性凋亡，而這種趨勢會被自噬抑制劑3-Methyladenine逆轉(zhuǎn)，表明自噬誘導(dǎo)的壞死性凋亡可被HSP70抑制?？傊?，HSP70通過抑制心肌缺血再灌注期間的自噬來下調(diào)心肌細胞的壞死性凋亡，揭示了HSP70的保護新機制，并為缺血性心臟病的治療提供了新的分子靶點。

1.4 miRNAs miRNAs是一種高度保守的小型非蛋白質(zhì)編碼RNA，具有微調(diào)數(shù)百種基因表達的能力。研究表明，miRNAs在缺血再灌注心臟中失調(diào)，并在缺血再灌注期間積極參與心肌細胞死亡的調(diào)節(jié)[29]。Qin等[30]觀察到miR-223的兩條鏈(5p和3p)在缺血再灌注小鼠的心臟中失調(diào)；與野生型小鼠相比，miR-223前體(pre-miR-223)轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟在離體和體內(nèi)心肌缺血時均表現(xiàn)出更好的再灌注期收縮性能恢復(fù)和更小的心肌壞死，pre-miR-223敲除小鼠心臟則顯示相反的效果；此外，RIP1/RIP3/MLKL壞死性途徑和炎癥反應(yīng)在轉(zhuǎn)基因心臟中被抑制，而在pre-miR-223敲除小鼠心臟缺血再灌注后被激活。上述研究確定了兩個關(guān)鍵細胞死亡受體TNFR1和死亡受體6作為miR-223-5p的直接靶標(biāo)，而miR-223-3p則直接靶向與炎癥和壞死性凋亡相關(guān)的NLRP3和IKKα兩種介質(zhì)。表明miR-223-5p/-3p雙鏈體在多個層面協(xié)同抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌壞死，因此pre-miR-223有潛力作為改善缺血性心臟病的新治療劑。

Yang等[31]使用miRNA組學(xué)分析檢測了硒缺陷心臟的特異性miRNAs。該研究使用硒缺陷雞的心臟組織進行高通量測序，確認(rèn)了差異表達的miR-200a-5p和靶基因環(huán)指蛋白11之間的關(guān)系；并進一步觀察到miR-200a-5p過表達在體內(nèi)和體外激活RIP3依賴的壞死性凋亡。caspase的抑制劑z-VAD-fmk未能誘導(dǎo)壞死性凋亡，而在miR-200a-5p敲低后，其對心肌細胞壞死的抵抗及細胞存活率均有增加。該研究說明，miR-200a-5p及其靶基因的調(diào)節(jié)可能阻斷心肌細胞的壞死性凋亡。

2 壞死性凋亡在心肌損傷治療中的作用

理論上抑制壞死性凋亡對心肌具有保護作用[32～34]。然而，RIP1的化學(xué)抑制劑在高濃度條件下反而誘導(dǎo)心肌損傷[34]。此外，肝細胞生長因子(HGF)通過抑制心肌梗死后細胞凋亡及促進細胞壞死性凋亡和自噬對心肌產(chǎn)生保護作用[35]。源于天然藥物的提取物也對心肌細胞的壞死性凋亡產(chǎn)生影響[36]。

2.1 RIP1抑制劑 RIP1被認(rèn)為是參與動員壞死性凋亡的主要上游激酶，壞死性凋亡抑制劑necrostatin-1(Nec-1)是RIP1的抑制劑，可防止化學(xué)和物理引起的組織損傷。Dmitriev等[32]在大鼠離體心臟模型中研究了Nec-1的心臟保護作用，發(fā)現(xiàn)冠狀動脈內(nèi)注射Nec-1會導(dǎo)致左心室收縮壓升高，產(chǎn)生正性肌力作用，但不會縮小梗死區(qū)域。另有研究表明，在缺血再灌注損傷后給予Nec-1可降低體內(nèi)RIP1/3磷酸化，Nec-1對心肌缺血再灌注后的短期和長期心臟功能有保護作用[22]。Chua等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在缺血前和再灌注后Nec-1均可減少小鼠心肌梗死面積；Nec-1在z-VAD-fmk存在的條件下可降低血漿肌鈣蛋白I的水平并誘導(dǎo)額外的保護作用。說明Nec-1可抑制心肌梗死中心肌細胞的壞死性凋亡，其通過不依賴caspase的機制發(fā)揮心臟保護作用。此外，Nec-1還可減少過氧化物誘導(dǎo)的C2C12成肌細胞和H9C2心肌細胞死亡，該作用機制在于Nec-1延遲了mPTP的開放[34]；但是高濃度的Nec-1還可產(chǎn)生非特異性或毒性作用，促進心肌細胞死亡[34]。

2.2 基因調(diào)控 調(diào)控某些基因的表達也可影響心肌細胞的壞死性凋亡。Liu等[35]研究結(jié)果顯示，心肌梗死后自噬、細胞凋亡和壞死性凋亡的分布在不同的時間和空間各有不同；值得注意的是，腺病毒載體(Ad)-HGF治療通過保留心臟功能，減少瘢痕大小和聚集體來改善心肌梗死后SD大鼠的心臟重塑。進一步研究表明，Ad-HGF促進自噬和壞死性凋亡，并在體內(nèi)和體外抑制細胞凋亡；Ad-HGF降低了caspase-8的蛋白表達及其活性，使細胞在缺氧條件下發(fā)生壞死并阻斷細胞凋亡。因此，調(diào)節(jié)心肌細胞的死亡形式可能比單獨抑制壞死性凋亡更有意義。

2.3 天然化合物 Chtourou等[36]在研究中強調(diào)天然化合物柚皮素(NGEN)對高膽固醇飲食大鼠心臟組織的保護作用及NGEN抑制心肌壞死性凋亡途徑的潛在分子機制。研究發(fā)現(xiàn)，暴露于高膽固醇飲食90 d的動物表現(xiàn)出血清乳酸脫氫酶、肌酸激酶、一氧化氮、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化標(biāo)志物及心臟脂質(zhì)譜水平升高；此外，高膽固醇血癥降低了與線粒體功能障礙相關(guān)的酶類和非酶類抗氧化劑的水平；重要的是，高膽固醇飲食增加ROS和核DNA損傷，并導(dǎo)致TNF-α和RIP3基因表達和激活，說明膽固醇誘導(dǎo)了心肌細胞的壞死性凋亡；對高膽固醇飲食大鼠給予NGEN可改善以上指標(biāo)。

目前大多數(shù)研究未詳細說明在各種原因?qū)е碌男募〖毎劳鲋袎乃佬缘蛲鏊急壤捌渲匾潭?。今后的研究?yīng)關(guān)注壞死性凋亡與其他類型的心肌細胞死亡之間的聯(lián)系，從整體水平探索干預(yù)心肌損傷的防治策略。