陳蕾，李泉，高文風(fēng)，孟潔，王愛紅，王占聚

(濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濰坊261031)

細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)是黏附分子家族重要成員之一，不僅參與免疫細(xì)胞的識(shí)別和活化，還廣泛參與各種炎癥反應(yīng)[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，ICAM-1在多種腫瘤細(xì)胞中也有表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[2]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，ICAM-1在人淋巴瘤Raji細(xì)胞中高表達(dá)。為進(jìn)一步研究ICAM-1在淋巴瘤中的作用，2018年2～6月，我們構(gòu)建了ICAM-1基因慢病毒干擾載體，包裝慢病毒并感染人淋巴瘤Raji細(xì)胞，抑制ICAM-1在Raji細(xì)胞中的表達(dá)，并觀察Raji細(xì)胞遷移及侵襲能力的變化，以期為淋巴瘤的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 質(zhì)粒pLKO.1-ICAM-1shRNA-GFP、psPAX2、pMD2.G、HEK293T細(xì)胞及人淋巴瘤細(xì)胞Raji為濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液科實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存；RPMI-1640培養(yǎng)基以及小牛血清購自杭州四季青公司；RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑、PCR試劑均購自大連TaKaRa公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑、質(zhì)粒提取試劑、小鼠抗人β-actin單克隆抗體以及ECL發(fā)光試劑均購自碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗人ICAM-1單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG購自CST公司；Transwell檢測(cè)小室購自COSTAR公司，Matrigel膠購自BD公司；ICAM-1及β-actin引物由博尚生物技術(shù)公司合成。

1.2 慢病毒包裝及病毒滴度測(cè)定 人ICAM-1慢病毒載體的構(gòu)建參照前期實(shí)驗(yàn)方法[3]。常規(guī)培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，待HEK293T細(xì)胞匯合度達(dá)70%時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒并進(jìn)行慢病毒包裝。慢病毒重組載體pLKO.1-ICAM-1shRNA-GFP質(zhì)粒6 μg、psPAX2質(zhì)粒4 μg、pMD2.G質(zhì)粒2 μg，加入opti-MEM至總體積300 μL，另取opti-MEM加入LipofectamineTM2000 36 μL至總體積300 μL，將上述液體混勻后緩慢加入含HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)皿中，6 h后補(bǔ)足完全培養(yǎng)液至10 mL，48 h后收集細(xì)胞上清液并用0.45 μm濾器過濾，高速離心濃縮后得到ICAM-1慢病毒濃縮液，同法獲得無干擾能力的陰性對(duì)照病毒濃縮液。將HEK293T細(xì)胞接種于96孔板中并調(diào)整細(xì)胞為1×104/孔，將病毒濃縮液倍比稀釋后依次感染HEK293T細(xì)胞，24 h后以完全培養(yǎng)基代替病毒液繼續(xù)培養(yǎng)，觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，計(jì)算病毒滴度(表達(dá)熒光的細(xì)胞數(shù)×稀釋倍數(shù))，并確定最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)。熒光顯微鏡下可見細(xì)胞發(fā)出明亮綠色熒光，48 h后收集富含病毒顆粒的細(xì)胞上清液。測(cè)定病毒液感染HEK293T細(xì)胞的病毒滴度，計(jì)算病毒滴度為2×108TU/mL。取MOI為5、10、20的慢病毒液感染HEK293T細(xì)胞，熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞發(fā)出明亮綠色熒光，表明慢病毒成功感染靶細(xì)胞。

1.3 Raji細(xì)胞內(nèi)ICAM-1基因沉默 常規(guī)培養(yǎng)Raji細(xì)胞并按照1×105/孔的密度接種于6孔板中，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、NC組及干擾組。培養(yǎng)24 h后進(jìn)行病毒感染，空白對(duì)照組不加處理，另兩組加入相應(yīng)病毒液。將所制備慢病毒以5×MOI進(jìn)行感染，加入終濃度為8 mg/L的聚凝胺以提高感染效率。感染8 h后換液并繼續(xù)培養(yǎng)，3 d后得到穩(wěn)定感染的細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞內(nèi)ICAM-1 mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR技術(shù)。TRIzol抽提Raji細(xì)胞總RNA并合成cDNA，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL行PCR 擴(kuò)增。引物序列：ICAM-1上游引物5′-ATGCCCAGACATCTGTGTCC-3′、下游引物5′-GGGGTCTCTATGCCCAACAA-3′；β-actin上游引物5′-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3′、下游引物5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，ICAM-1擴(kuò)增長(zhǎng)度為112 bp，β-actin擴(kuò)增長(zhǎng)度為416 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳并拍照，用凝膠成像系統(tǒng)與Quantity one軟件進(jìn)行圖像分析，以β-actin做內(nèi)參照，以目的基因與β-actin的灰度比值計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞內(nèi)ICAM-1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。離心收集Raji細(xì)胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解1 h，離心收集蛋白并測(cè)定濃度，蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉溶液室溫孵育封閉2 h，加入兔抗人ICAM-1抗體(1∶1 000)和小鼠抗人β-actin抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶1 000)和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)，室溫孵育2 h，TPST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，顯影定影后將膠片拍照，Image J軟件行灰度值分析，以ICAM-1與內(nèi)參β-actin蛋白灰度值比值計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。以1×105/mL的細(xì)胞密度將各組Raji細(xì)胞接種于包被有Matrigel的96孔板中，內(nèi)含10%胎牛血清的培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，直至形成細(xì)胞單層。采用無菌槍頭在培養(yǎng)板底部單層培養(yǎng)細(xì)胞上劃痕，洗滌3次后加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，加入10 g/mL絲裂霉素排除細(xì)胞增殖干擾，細(xì)胞劃痕后48 h在顯微鏡下觀察并測(cè)量細(xì)胞平均遷移距離，與0 h的初始距離作對(duì)比，計(jì)算細(xì)胞平均遷移率。細(xì)胞劃痕遷移率=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.7 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell實(shí)驗(yàn)。Transwell小室內(nèi)膜加入Matrigel膠并置于24孔板中，待膠凝固后實(shí)驗(yàn)。取Raji細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，200 μL/孔將細(xì)胞懸液加入Transwell小室，同時(shí)在Transwell下室中加入含10%小牛血清的培養(yǎng)基800 μL，37 ℃培養(yǎng)24 h后取出小室，用棉簽擦拭內(nèi)膜上的細(xì)胞，預(yù)冷甲醇固定30 min后棄掉甲醇，1%結(jié)晶紫染色20 min，倒置顯微鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)視野并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組ICAM-1 mRNA表達(dá)比較 干擾組、NC組及空白對(duì)照組ICAM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.29±0.06、1.12±0.05、1.05±0.02，干擾組ICAM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于NC組、空白對(duì)照組(P均<0.05)。

2.2 各組ICAM-1蛋白表達(dá)比較 干擾組、NC組及空白對(duì)照組ICAM-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.35±0.06、1.07±0.01、1.01±0.04，干擾組ICAM-1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于NC組、空白對(duì)照組(P均<0.05)。

2.3 ICAM-1基因沉默對(duì)Raji細(xì)胞遷移能力的影響 干擾組、NC組及空白對(duì)照組細(xì)胞遷移率分別為為35.92%±3.73%、64.25%±3.18%、61.25%±5.01%，干擾組細(xì)胞遷移率低于NC組、空白對(duì)照組(P均<0.05)。

2.4 ICAM-1基因沉默對(duì)Raji細(xì)胞侵襲能力的影響 干擾組、NC組及空白對(duì)照組細(xì)胞穿膜數(shù)分別為(63.40±6.54)、(74.20±4.09)、(78.60±1.52)個(gè)/視野，干擾組細(xì)胞穿膜數(shù)少于NC組、空白對(duì)照組(P均<0.05)。

3 討論

淋巴瘤是血液系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其在中國(guó)的發(fā)病率遠(yuǎn)高于西方國(guó)家，嚴(yán)重危害人們的健康。雖然近年來對(duì)淋巴瘤的治療有了長(zhǎng)足進(jìn)步，但每年仍有大量患者死于淋巴瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[4]。目前研究表明，淋巴瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移與細(xì)胞黏附分子有密切關(guān)系，細(xì)胞黏附分子通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞的黏附，在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[5,6]。

ICAM-1是細(xì)胞黏附分子家族中的重要成員，其配體是淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1，參與各種細(xì)胞之間的黏附與識(shí)別[1,7,8]。有研究證實(shí)，ICAM-1在多種腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)，ICAM-1通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞吸附于血管內(nèi)皮細(xì)胞或淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表面，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。ICAM-1在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)，且ICAM-1高表達(dá)的腫瘤患者多數(shù)預(yù)后較差[9～13]。有研究證實(shí)原癌基因Kras可促進(jìn)胰腺腺泡細(xì)胞中ICAM-1表達(dá)，通過募集巨噬細(xì)胞在炎癥部位聚集促進(jìn)癌前病變的形成[14]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)可提高ICAM-1表達(dá)促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[15]。下調(diào)ICAM-1表達(dá)或阻斷ICAM-1信號(hào)通路，可降低小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移能力[16,17]。有研究表明ICAM-1在淋巴瘤患者中呈高表達(dá)，并且與腫瘤細(xì)胞自分泌和血管內(nèi)皮細(xì)胞旁分泌有關(guān)。ICAM-1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞通過血液系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，并促進(jìn)淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展[18,19]。有研究表明，ICAM-1可增強(qiáng)B細(xì)胞向脾和結(jié)外組織的遷移、極化和歸巢，最終通過激活核因子κB(NF-κB)和磷脂酰肌醇3激酶-絲/蘇氨酸蛋白激酶信號(hào)途徑促進(jìn)B細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化。ICAM-1還可介導(dǎo)中性粒細(xì)胞對(duì)各種淋巴瘤細(xì)胞的殺傷作用。T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞可通過病毒調(diào)節(jié)蛋白Tax和NF-κB信號(hào)通路降低ICAM-1的表達(dá)，從而逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的識(shí)別與殺傷，阻斷ICAM-1的表達(dá)可有效抑制淋巴瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[20～23]。提示ICAM-1在淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展過程中也起關(guān)鍵作用。

慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，能特異而有效地干擾靶基因的表達(dá)，具有轉(zhuǎn)染率高、穩(wěn)定性高及特異性強(qiáng)等特點(diǎn)[24]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，ICAM-1在人淋巴瘤Raji細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，為進(jìn)一步研究并探討ICAM-1在淋巴瘤轉(zhuǎn)移中的作用，我們利用前期構(gòu)建成功的ICAM-1慢病毒干擾載體[3]，用三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)進(jìn)行慢病毒包裝并感染人淋巴瘤Raji細(xì)胞，抑制ICAM-1在Raji細(xì)胞中的表達(dá)并觀察細(xì)胞遷移侵襲能力的變化。結(jié)果證實(shí)ICAM-1慢病毒可有效下調(diào)Raji細(xì)胞中ICAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)下調(diào)ICAM-1表達(dá)后腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲能力均下降。提示靶向沉默ICAM-1基因表達(dá)可抑制人淋巴瘤Raji細(xì)胞的遷移與侵襲，研究結(jié)果有望為淋巴瘤的臨床治療提供新的思路與靶點(diǎn)。

綜上所述，沉默ICAM-1基因可抑制人淋巴瘤Raji細(xì)胞的遷移與侵襲。但本研究尚未明確具體的分子作用機(jī)制，將在今后的研究中進(jìn)一步探討。