王淑紅，王耀春

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院,西安710061)

Notch信號途徑在多種生物體中高度保守，并且廣泛參與脊椎動物和非脊椎動物細胞的發(fā)育過程。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中Notch信號途徑也被證實發(fā)揮了重要調(diào)控作用，是多種腫瘤的重要成因之一，參與膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[1]。結(jié)腸癌是胃腸道中常見的惡性腫瘤，目前其發(fā)生機制尚不完全明確。Notch信號途徑在結(jié)腸癌組織中表達升高已經(jīng)得到廣泛證實[2],但多數(shù)研究僅是圍繞Notch信號途徑的某單一配/受體探討Notch信號途徑的功能[3，4]，無法排除Notch信號途徑其他配/受體之間的功能互補，可能造成所得結(jié)論存在片面性。本研究通過敲除Notch信號途徑中的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子RBP-JK，構(gòu)建了RBP-JK基因敲除CT-26細胞株模型，從而實現(xiàn)對于Notch信號途徑的徹底阻斷，并觀察了此細胞模型在小鼠體外的增殖能力及體內(nèi)的成瘤能力，為最終闡明Notch信號途徑在結(jié)腸癌發(fā)病機制中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞、動物、重組慢病毒、試劑、儀器 結(jié)腸癌細胞株CT-26購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。Balb/c小鼠購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，飼養(yǎng)于SPF級別飼養(yǎng)室中。重組慢病毒購自于上海吉碼制藥有限公司，敲除RBP-JK靶序列為5′-GGGAAGCTATGCGAAATTA-3′。5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)購自Sigma 公司。RAPA細胞裂解液，RNA 提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV)、TaqDNA 聚合酶、RNA 酶抑制劑等均為TaKaRa 公司產(chǎn)品。SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司，細胞培養(yǎng)液、血清及抗生素等均購自Gibico公司。Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution KiT和MatrigelTM購自美國BD公司。抗RBP-J、HES-1和actin抗體購自Abclone公司。 Calibur流式細胞儀購自BD公司，NanoDrop 2000超微量分光光度計購自Thermo Scientific公司， ChemiDoc化學(xué)發(fā)光成像儀購自BIO-RAD公司。

1.2 RBP-JK基因敲除CT-26細胞株模型的構(gòu)建、鑒定 將CT-26細胞株以1×105/孔鋪到24孔板中，調(diào)整細胞數(shù)量在慢病毒轉(zhuǎn)染時為2×105/孔左右。第2天，用含有6 μg/mL Polybrene的2 mL新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，加入適量慢病毒懸液。37 ℃孵育。4 h后加入2 mL新鮮培養(yǎng)基以稀釋Polybrene。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基。48 h更換為含有潮霉素的全培養(yǎng)液。流式細胞儀檢測表達綠色熒光細胞比率大于95%后用于后續(xù)實驗。結(jié)果顯示小鼠結(jié)腸癌細胞株CT-26感染慢病毒1周后，表達EGFP的細胞比例超過95%，說明慢病毒載體已經(jīng)將目的基因整合入細胞內(nèi)。采用Wetern blotting法檢測RBP-JK基因敲除CT-26細胞株中RBP-JK和Notch下游分子HES-1的表達，結(jié)果與對照CT-26細胞株比較，其水平顯著下降。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，與對照CT-26細胞株相比，RBP-JK基因敲除CT-26細胞株中HES-1( 1.106±0.116 VS 0.123±0.004)、Hey-1(0.951±0.105 VS 0.304±0.006)、Hey-2(0.990±0.176 VS 0.242±0.080)表達水平顯著下降。說明在CT26細胞中抑制RBP-JK的表達可以有效阻斷Notch信號途徑。

1.3 RBP-JK基因敲除CT-26細胞株增殖能力觀察 ① RBP-JK基因敲除CT-26細胞株體外增殖能力觀察：采用BrdU摻入法。細胞以2×105/mL細胞數(shù)接種于直徑60 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)1 d，用含0.4% FCS培養(yǎng)液同步化3 d，使絕大多數(shù)細胞處于G0期。終止細胞培養(yǎng)前，加入BrdU(終濃度為30 μg/L)，37 ℃，孵育1 h或3 h。細胞消化后，根據(jù)說明書固定破膜，給予FITC標記的抗BrdU抗體 (1∶50)避光室溫染色30 min，細胞洗滌3遍后，應(yīng)用流式細胞儀測算摻入BrdU的細胞百分比。② RBP-JK基因敲除CT-26細胞株體內(nèi)成瘤能力觀察：采用小鼠體內(nèi)成瘤實驗。小鼠麻醉后仰臥位固定于操作臺上，動脈夾夾于肛門側(cè)壁，沿肛門直腸方向切開7 mm 左右，使用29號針頭將0.1 mL含有1×106個RBP-JK基因敲除CT-26細胞株和MatrigelTM(500 μg/mL)的PBS懸液注射于直腸黏膜下層，觀察腫瘤的生長情況,注射15 d后使用游標卡尺測量腫瘤的大小，每3 天測量1次，分別記錄腫瘤的長徑(L)和短徑(S)。腫瘤體積=L×S2×0.51。

2 結(jié)果

2.1 RBP-JK基因敲除CT-26細胞株體外增殖能力觀察 RBP-JK基因敲除CT-26細胞株、對照CT-26細胞株在培養(yǎng)1 h時摻入BrdU的細胞比例分別為15.21%±0.242%、10.78%±0.251%,二者比較，t=31.10，P<0.01;在培養(yǎng)3 h時摻入BrdU的細胞比例分別為25.46%±0.316%、13.26%±0.284%,二者比較，t=70.26，P<0.01。

2.2 RBP-JK基因敲除CT-26細胞株在小鼠體內(nèi)的成瘤能力觀察 RBP-JK基因敲除CT-26細胞株接種后第24、27、30 天，小鼠直腸原位腫瘤體積分別為(0.351±0.014)、(0.422±0.011)、(0.737±0.021)mm3，對照CT-26細胞株接種后第24、27、30天，小鼠直腸原位腫瘤體積分別為(0.513±0.013)、(1.161±0.114)、(1.848±0.016)mm3，二者同時間比較，t分別為25.61、15.84、101.10,P均<0.01。

3 討論

Notch信號途徑是體內(nèi)較為保守的信號途徑之一，通過細胞與細胞間的相互作用，參與調(diào)節(jié)脊椎和無脊椎動物細胞的分化、增殖和發(fā)育過程，是維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。目前，已有大量研究表明，體內(nèi)Notch信號途徑的過度活化或缺失可以導(dǎo)致多種腫瘤發(fā)生。

Notch信號途徑有多種配體，在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)了Notch的4種受體和5種配體[5]。這些受體/配體均為跨膜蛋白，在結(jié)構(gòu)上具有高度同源性。當鄰近細胞表面上的Notch配體與受體結(jié)合后，釋放的Notch信號途徑胞內(nèi)段可直接進核，通過其RAM 結(jié)構(gòu)域與關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子CSL 相互作用，并募集GCN5、P300、SKIP 和MAML1 等分子共同組成轉(zhuǎn)錄共激活復(fù)合物，使CSL由轉(zhuǎn)錄抑制作用轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)錄激活作用，從而調(diào)節(jié)下游基因的表達[6]。

CSL蛋白在哺乳動物中稱為RBP-JK，是Notch信號途徑中的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,是介導(dǎo)信號傳導(dǎo)的必需組分。由于Notch信號途徑的配體有4種，在組織表達和功能上存在著較大的交叉和互補。為了實現(xiàn)對于Notch途徑的完全阻斷，本研究則以Notch信號途徑的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子RBP-JK作為阻斷對象。通過病毒干擾抑制RBP-JK的表達水平， Notch信號途徑下游主要基因HES-1和Hey-1,2的表達水平受到了明顯的抑制，提示Notch信號途徑發(fā)生徹底阻斷，說明針對RBP-JK表達的干擾和抑制可以較好地彌補Notch信號途徑不同配/受體間的相互影響，是研究Notch信號途徑功能的理想模型。

Notch信號途徑參與調(diào)控結(jié)直腸的生理性發(fā)育過程，能夠促進腸道正常結(jié)構(gòu)和組織極性的生成，是其維持結(jié)直腸穩(wěn)態(tài)和發(fā)揮功能所必需的關(guān)鍵性調(diào)控途徑。Notch信號途徑在結(jié)直腸組織的異常表達必將引起其干祖細胞的發(fā)育分化異常，導(dǎo)致腸道結(jié)構(gòu)紊亂和功能失調(diào)，最終誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生。在結(jié)腸癌的研究[7]中發(fā)現(xiàn), Notch信號途徑的基因呈現(xiàn)高表達狀態(tài), 提示在結(jié)腸癌的發(fā)生中Notch信號途徑作為促癌基因發(fā)揮作用。Qiao等[8]研究表明，結(jié)腸癌組織中Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3、DLL4以及Notch信號途徑的多種受體和下游靶分子的表達水平都高于對照組，說明其參與調(diào)控腫瘤形成和轉(zhuǎn)歸的過程。Miyamoto等[9]研究顯示，Notch信號途徑的抑制劑GSI可以顯著減少AOM誘導(dǎo)形成的小鼠結(jié)腸腫瘤數(shù)量，腫瘤組織中KLF4和p21表達水平顯著升高，Ki67表達減弱，細胞增殖受到抑制。Meng等[10]研究表明，在原位結(jié)腸癌發(fā)生的過程中Notch信號途徑被顯著激活，但在結(jié)腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移時作用并不明顯，提示Notch信號途徑對于結(jié)腸癌發(fā)生和進展的調(diào)控作用主要在結(jié)腸癌發(fā)生的早期。然而，在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移瘤組織中Notch1和HES-1的表達水平高于正常組織和原位結(jié)腸癌組織，說明Notch信號途徑在結(jié)腸癌的進展期和晚期也發(fā)揮了十分重要的調(diào)控作用[11]。Notch3通過調(diào)節(jié)Numb抑制分子Msi-1的表達可以促進小鼠體內(nèi)結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生和進展[12]，在結(jié)腸癌細胞系中抑制Notch3表達，細胞在小鼠體內(nèi)形成腫瘤的能力明顯減弱[13]。本實驗結(jié)果也顯示，通過抑制RBP-JK的表達實現(xiàn)完全阻斷Notch信號途徑后，摻入BrdU的CT-26細胞百分比無論是培養(yǎng)1 h還是3 h均有顯著的下降，說明Notch信號途徑是CT-26細胞體外增殖所必需的信號通路。進一步的體內(nèi)成瘤實驗結(jié)果表明，阻斷Notch信號途徑的CT-26細胞在小鼠體內(nèi)成瘤速度較慢,說明Notch信號途徑參與CT-26細胞體內(nèi)外增殖的調(diào)控。

綜上所述，Notch信號途徑阻斷后結(jié)腸癌細胞株CT-26增殖能力減弱。Notch信號途徑與結(jié)腸癌細胞株CT-26增殖有關(guān)，是結(jié)腸癌細胞體內(nèi)外增殖的重要調(diào)控元件。但本研究只在細胞層面探討了Notch信號途徑在直腸癌發(fā)生中的作用，更加深入的分子機制需要在實驗動物模型和臨床樣本中加以探討和驗證。