袁曉艷，張書(shū)山，王明陽(yáng)，唐 穎，陳 萍

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院分析化學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550000)

靈芝(Ganodermalucidum)，別名芝草、瑞草，泛指真菌門(mén)(Eumycota)靈芝菌科(Ganodermataceae)靈芝屬(Ganoderma)的所有種類(lèi)[1]。靈芝在我國(guó)有2 000多年的藥用歷史，具有增強(qiáng)人體免疫力、控制血壓、調(diào)節(jié)血糖、保肝護(hù)肝以及改善睡眠等作用[2-3]。靈芝中含有多糖、三萜、核苷、生物堿等化學(xué)成分，其中靈芝多糖具有提高免疫力、抗腫瘤、降血脂等功效，三萜類(lèi)化合物具有保肝、抗腫瘤、抗HIV-1等作用[4-7]。目前對(duì)靈芝中的三萜類(lèi)及多糖的含量測(cè)定已有文獻(xiàn)報(bào)道[8]，但無(wú)法全面評(píng)價(jià)靈芝的質(zhì)量。

我國(guó)靈芝資源豐富，分布于浙江、江西、貴州、云南、福建、海南等省，多為野生，生于櫟樹(shù)及其它闊葉樹(shù)木樁上。近年來(lái)，隨著靈芝需求的不斷擴(kuò)大，野生靈芝遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求，許多省區(qū)已開(kāi)始人工栽培[9]，目前，椴木栽培和袋料栽培是我國(guó)主流的兩種靈芝栽培技術(shù)[10-14]。貴州省因具有特殊的高原地貌、涼爽的氣候和茂密的森林植被等自然環(huán)境優(yōu)勢(shì)，是我國(guó)靈芝的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)。研究前期精選不同品種的6個(gè)靈芝菌株，并優(yōu)選出其中靈芝多糖含量最高的靈芝菌株繼續(xù)培養(yǎng)。為實(shí)現(xiàn)獼猴桃修剪枝生態(tài)循環(huán)利用，促進(jìn)貴州靈芝生產(chǎn)向綠色環(huán)保方向發(fā)展，以修文獼猴桃樹(shù)枝屑及櫟樹(shù)闊葉木屑為主料培養(yǎng)基按不同配比進(jìn)行培養(yǎng)，培育出7個(gè)貴州靈芝菌株的子實(shí)體。前期研究表明不同品種及不同培養(yǎng)方式的靈芝多糖含量差異較大，其多糖含量在干靈芝中最低不足1.0%，最高可達(dá)5.9%。為了對(duì)靈芝進(jìn)行更為全面的質(zhì)量評(píng)價(jià)，本研究將對(duì)不同來(lái)源及不同培養(yǎng)條件下所獲得13個(gè)貴州產(chǎn)靈芝進(jìn)行HPLC指紋圖譜分析，以期為貴州人工栽培靈芝提供質(zhì)量評(píng)價(jià)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑 T9雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；FA2004N分析天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；粉碎機(jī)(杭州九陽(yáng)生活電器股份有限公司)；SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；HPLC-Agilent 1100(美國(guó)安捷倫)。

乙酸、乙酸乙酯(分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司)；無(wú)水乙醇(成都市科龍化工試劑廠)；乙腈(色譜純，美國(guó)TEDIA公司)；所用水為艾柯實(shí)驗(yàn)室超純水。

1.2 材料 實(shí)驗(yàn)所用6個(gè)不同品種的靈芝菌株(F1-F6)均為貴州產(chǎn)靈芝，其名稱(chēng)及來(lái)源見(jiàn)表1，6個(gè)靈芝菌株均經(jīng)過(guò)張玉金博士(遵義醫(yī)科大學(xué)，生藥學(xué)教研室)鑒定為靈芝樣本。

表1 靈芝菌株編號(hào)與來(lái)源

實(shí)驗(yàn)所用獼猴桃修剪屑及櫟樹(shù)闊葉木屑培養(yǎng)的靈芝(1-7)由表1中的貴州產(chǎn)靈芝F2(S9)繼續(xù)培養(yǎng)，獼猴桃樹(shù)枝是由修文縣谷堡園區(qū)提供的獼猴桃修剪樹(shù)枝，用粉碎機(jī)粉碎成直徑≤5 mm 的屑狀顆粒備用；靈芝栽培袋規(guī)格為15 cm×32 cm×0.05 cm；闊葉木屑、麥麩、糖、過(guò)磷酸鈣、石膏等材料在當(dāng)?shù)刭?gòu)買(mǎi)；所用原料中麥麩、糖、過(guò)磷酸鈣、石膏原材料比例為定量比例(麥麩∶糖∶過(guò)磷酸鈣∶石膏原=25∶1∶1∶1)，木屑和獼猴桃樹(shù)枝屑為變量組合成7個(gè)試驗(yàn)配方培養(yǎng)出的靈芝(1-7)見(jiàn)表2。

表2 菌株編號(hào)1-7栽培料配方比例

2 方法

2.1 靈芝供試樣品溶液的制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取粉碎后的靈芝10 g，以乙酸乙酯作為溶劑，乙酸乙酯(v)：靈芝(m)=10∶1浸泡過(guò)夜后，超聲提取3次，合并提取液，過(guò)濾后減壓濃縮得粗提物，粗提物以乙酸乙酯溶解后定容于25 mL容量瓶中，過(guò)0.22 μm濾膜備用。

2.2 色譜條件 Agilent HC-C18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm)；以0.5%乙酸水溶液(A)和乙腈(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～15 min，5%～32% B；15～40 min，32%～57% B；40～60 min，57%～73% B；60～61 min，73%～75% B；61～71 min，保持在5% B)；柱溫：25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：300 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密稱(chēng)取靈芝樣品F2(即S9)樣品，按“2.1”項(xiàng)下方法制備靈芝供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)下色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.0%，相對(duì)峰面積RSD<3.0%，表明儀器的精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取靈芝樣品F2(即S9)樣品6份，按“2.1”項(xiàng)下方法平行制備靈芝供試品溶液6份，在“2.2”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.0%，相對(duì)峰面積的RSD<3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取F2(即S9)樣品，按“2.1”項(xiàng)下方法制備靈芝供試品溶液，以“2.2”項(xiàng)下色譜條件下分別于0、6、12、18、24 h進(jìn)樣，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.0%，相對(duì)峰面積RSD<3.0%，表明供試品溶液的各共有成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3 結(jié)果

3.1 貴州產(chǎn)靈芝HPLC指紋圖譜的建立

3.1.1 HPLC指紋圖譜 將不同來(lái)源及不同培養(yǎng)方式所獲得的13個(gè)貴州產(chǎn)靈芝樣品分別按照“2.1”項(xiàng)下方法制備靈芝供試品溶液，并按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄各樣品色譜圖，得到13個(gè)靈芝樣本的的指紋圖譜見(jiàn)圖1，其中S1-S7分別為櫟樹(shù)闊葉木屑和獼猴桃枝屑不同比例培養(yǎng)所得的貴州產(chǎn)靈芝1-7號(hào)樣品(見(jiàn)表2)，S8-S13分別為不同來(lái)源的貴州產(chǎn)靈芝F1-F6(見(jiàn)表1)。

圖1 13批貴州產(chǎn)靈芝樣品HPLC指紋圖譜

3.1.2 相似度分析 以13批次的貴州產(chǎn)靈芝樣本的HPLC指紋圖譜為基礎(chǔ)，導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)(2012版)》進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以靈芝F2(即S9)為參照?qǐng)D譜，時(shí)間寬度設(shè)為0.20，進(jìn)行多點(diǎn)校正后，建立共有模式，共確定29個(gè)共有峰，并生成貴州產(chǎn)靈芝的共有對(duì)照指紋圖譜R，見(jiàn)圖1。22號(hào)峰(保留時(shí)間45.364min)與其它相鄰峰分離度較好，峰面積較大，故以其為參照峰S(見(jiàn)圖1)，計(jì)算其它共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果分別見(jiàn)表3～4。將波動(dòng)較大的保留時(shí)間轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定性較好的相對(duì)保留時(shí)間，有助于建立各樣品統(tǒng)一的定性依據(jù)，本研究中，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間偏差均很小，其RSD值在0.000%～0.333%。相對(duì)峰面積是色譜指紋圖譜定量的依據(jù)，本研究中，13批貴州產(chǎn)靈芝的29個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積分布在一個(gè)相對(duì)較寬的范圍內(nèi)，最大RSD值達(dá)到63.12%。其中14號(hào)和20號(hào)峰變化幅度較大，相對(duì)峰面積的變化客觀反映了化學(xué)成分的批間差異。

表3 13批貴州產(chǎn)靈芝樣本共有峰的相對(duì)峰面積

表4 13批貴州產(chǎn)靈芝樣本共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

將對(duì)照?qǐng)D譜和13批次樣品色譜圖導(dǎo)入“2012版中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”，以各批次貴州產(chǎn)靈芝樣品色譜圖與對(duì)照指紋圖譜R進(jìn)行相似度比較，相似度結(jié)果見(jiàn)表5。由相似度結(jié)果可知，13個(gè)貴州產(chǎn)靈芝樣本間的差異較小，均大于0.90，表明不同來(lái)源及不同培養(yǎng)方式的靈芝質(zhì)量具有較高的一致性，人工培育的靈芝樣本與野生靈芝樣本并無(wú)明顯差別。不同品種靈芝樣本中，F(xiàn)6(S13)與其它靈芝品種差異較大，其相似度為0.937，說(shuō)明大紅巨芝與其它靈芝樣本之間差異略大。人工栽培靈芝樣本中，僅靈芝1(S1)相似度略低，為0.915，說(shuō)明，靈芝人工培育過(guò)程中，不添加獼猴桃枝屑培育的靈芝樣本與添加獼猴桃枝屑培育的靈芝樣本之間有較大的差異。

表5 13批貴州產(chǎn)靈芝樣品指紋圖譜相似度

3.2 聚類(lèi)分析 聚類(lèi)分析能夠從樣本數(shù)據(jù)出發(fā)，自動(dòng)進(jìn)行分類(lèi)。本研究以HPLC 批紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積作為特征指標(biāo)，采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件中的組間連接法，以?shī)A角余弦作為度量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，當(dāng)類(lèi)間距離為30時(shí)，13批貴州產(chǎn)靈芝被分為2大類(lèi)：F6(S13)為一類(lèi)，其余12個(gè)靈芝樣本聚為一類(lèi)，當(dāng)類(lèi)間距離為20時(shí)，13批貴州產(chǎn)靈芝可分為三類(lèi)，F(xiàn)6(S13)為一類(lèi)，以不同培養(yǎng)料培養(yǎng)的靈芝1(S1)為一類(lèi)，其余11個(gè)樣本聚為一類(lèi)，這與相似度計(jì)算結(jié)果基本一致，可以相互驗(yàn)證。

圖2 13批貴州產(chǎn)靈芝樣品的聚類(lèi)分析結(jié)果

4 討論

簡(jiǎn)單的測(cè)定一個(gè)或幾個(gè)有效成分含量為主的傳統(tǒng)的質(zhì)量分析方法不能真正地反映靈芝的品質(zhì)。因此，建立全面、系統(tǒng)而又特征地反應(yīng)靈芝的化學(xué)成分的指紋圖譜，可以為貴州靈芝的質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制提供一個(gè)有效的參考方法，更有利于推廣貴州省優(yōu)質(zhì)的道地靈芝栽培研究。本研究建立了13批不同來(lái)源及不同培養(yǎng)方式的貴州產(chǎn)靈芝的HPLC指紋圖譜，共標(biāo)定29個(gè)共有峰，并利用相似度評(píng)價(jià)和聚類(lèi)分析對(duì)靈芝的HPLC指紋圖譜進(jìn)行研究。13種靈芝間的相似度均高于0.90，表明不同來(lái)源的野生靈芝之間差異不大，人工培養(yǎng)的靈芝與野生靈芝間品質(zhì)具有良好的一致性。聚類(lèi)分析結(jié)果表明，野生靈芝F6及人工培養(yǎng)的靈芝1分別歸為一類(lèi)，其它11種靈芝歸為一類(lèi)，該結(jié)果與相似度計(jì)算結(jié)果基本保持一致，可能是靈芝生長(zhǎng)環(huán)境不同及培養(yǎng)方式不同產(chǎn)生的差異。本研究為貴州靈芝的質(zhì)量控制提供了依據(jù)，將更有利于推廣貴州省優(yōu)質(zhì)的道地靈芝栽培研究，為創(chuàng)建貴州靈芝品牌提供依據(jù)。