李曉彤，曾凡群，任星橋，李葉麗，高 楊，楊丹莉

(遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099)

肺動脈高壓(Pulmonary artery hypertension,PAH)是一種頑固性疾病，其特征是肺血管重構(gòu)、肺血管阻力和肺動脈壓逐漸升高，升高的肺動脈壓會引起心臟結(jié)構(gòu)的變化，接著是右心衰，最終死亡，其發(fā)生發(fā)展過程與肺血管重構(gòu)密切相關(guān)[1]。肺動脈平滑肌細胞(Pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)的異常增殖是肺血管重構(gòu)的主要因素[2]，因此抑制PASMCs增殖已經(jīng)成為藥物改善PAH的策略之一。

鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin,CaN)是一種Ca2+和鈣調(diào)蛋白依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶。活化的CaN促進PASMCs的增殖、遷移，促進PAH的發(fā)生、發(fā)展[3-4]。而增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是DNA聚合酶δ的輔助蛋白,其水平與細胞增長率呈正比，在調(diào)節(jié)細胞增殖中起重要作用[5-6]。血小板源性生長因子-BB(PDGF-BB)能誘導(dǎo)PASMCs增殖、遷移。蛇床子素(Osthole,Ost)是一種天然香豆素化合物，從傘形科蛇床屬植物蛇床的果實中提取的，其化學(xué)名為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素[7]。已被證明具有多種有益的藥理特性，如抗增殖、抗炎、擴張血管、抑制血栓形成、抗血小板聚集等[8-9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：對野百合堿誘導(dǎo)的大鼠PAH模型，Ost具有降低肺動脈壓和改善肺動脈重構(gòu)、肺動脈周圍及肺間質(zhì)炎癥等作用[7]。故本研究以原代培養(yǎng)的大鼠PASMCs為研究對象，基于CaN探討Ost抑制PDGF-BB所致的PASMCs增殖作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠，體重180～200g，采購于陸軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心(許可證：SCXK-(軍)2012-0011)。

1.2 藥品、試劑和儀器 蛇床子素(純度≥99.90%，MCE)；PDGF-BB(美國，R&D公司)；胎牛血清、0.25%胰酶、DMEM-F12(美國，Gibco公司)； CCK-8增殖檢測試劑盒(日本，同仁化學(xué))；FITC標記的山羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠α-SMA(武漢，博士德公司)；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)、PCNA兔抗大鼠抗體(武漢，三鷹生物)；CaN兔抗大鼠抗體(美國，Abcam公司)；牛血清白蛋白、二硫蘇糖醇、Ⅰ型膠原酶、木瓜蛋白酶(美國，Sigma公司)；超凈工作臺(蘇州，凈化設(shè)備廠)、倒置熒光顯微鏡(日本，OLYMPUS公司)、Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(美國，BIO-RAD公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠PASMCs的原代培養(yǎng) 參考文獻[2]方法，SD大鼠采用頸椎脫臼法處死，無菌條件下游離心肺組織，快速分離肺動脈血管中層，用眼科剪將肺動脈剪成小碎塊，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，加入聯(lián)合消化酶，放置37℃水浴搖床，消化約40 min， 1000 rpm離心7 min，棄培養(yǎng)基收集沉淀，加入含20% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液，置于37℃、體積分數(shù)5% CO2孵箱培養(yǎng)。

1.3.2 PASMCs的鑒定 收集處于對數(shù)生長期的第三代PASMCs；以1×105/mL個細胞接種于6孔板，24 h后細胞貼壁生長良好，棄掉培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS清洗，3 min×3次；4 %多聚甲醛室溫固定20 min，預(yù)冷的PBS清洗，3 min×3次；0.3% Triton-X-100室溫透化破膜10 min，預(yù)冷的PBS清洗，3 min×3次；山羊血清室溫封閉30 min，棄去山羊血清，加兔抗小鼠α-SMA抗體在4℃孵育過夜，預(yù)冷的PBS清洗，3 min×3次；避光加入FITC標記山羊抗小鼠室溫1 h，預(yù)冷的PBS清洗，3 min×3次；DAPI 室溫10 min避光進行復(fù)染核，預(yù)冷的PBS清洗，3 min×3次，倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果并拍照。

1.3.3 實驗分組及給藥 將生長狀態(tài)良好的PASMCs分為5組：①正常對照組(Control組)：不加藥物；②模型組(Model組)：加入25 ng/mL 的PDGF-BB；③Ost-L組：同時加入25 ng/mL的 PDGF-BB和5 μM的Ost；④Ost-M組：同時加入25 ng/mL的PDGF-BB 和10 μM的Ost；⑤Ost-H組：同時加入25 ng/mL的PDGF-BB+20 μM的Ost，共同作用24 h。

1.3.4 CCK-8法檢測細胞增殖活力 收集處于對數(shù)生長期的PASMCs(6×104/mL)接種于96孔板，每孔100 μL。培養(yǎng)過夜，去除培養(yǎng)基，用1% FBS培養(yǎng)基同步12 h，按照實驗分組處理24 h。將10 μL CCK-8試劑加入每個孔中，放置37℃孵育1.5 h，使用酶標儀測量450 nm處的吸光度，每組設(shè)置5個復(fù)孔，實驗重復(fù)5次。

1.3.5 蛋白免疫印跡法檢測PCNA、CaN蛋白的表達 收集處于對數(shù)生長期的PASMCs(1×105/mL)接種于6孔板，待細胞貼壁，用1% FBS培養(yǎng)基同步12 h化，按照實驗分組處理24 h，棄培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS洗滌3次，加RIPA裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5 %脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入稀釋一抗(PCNA 1∶2 000，CaN 1∶2 000，β-actin 1∶5 000，GAPDH 1∶10 000)4 ℃孵育過夜，室溫TBST洗3次，每次10 min。加入結(jié)合了HRP的二抗室溫孵育1 h，室溫TBST洗3次，每次10 min。使用ECL底物觀察條帶，Bio-Rad化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍取圖片。每組設(shè)置5個復(fù)孔，實驗重復(fù)4次。

2 結(jié)果

2.1 PASMCs的形態(tài)觀察 在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)第3天的原代PASMCs，可見少許細胞貼壁，第7天可見細胞交織成網(wǎng)為長梭形、三角形或多角形，呈典型的“峰-谷”狀排列生長(見圖1)。

A：原代PASMCs第3天；B：原代PASMCs第7天呈現(xiàn)“峰-谷”樣生長狀態(tài)(×100)。圖1 原代PASMCs培養(yǎng)生長情況

2.2 PASMCs的鑒定 傳代后的原代PASMCs，選對數(shù)生長期的第三代細胞進行免疫熒光鑒定，倒置熒光顯微鏡下觀察有較強的綠色熒光在細胞胞漿中，α-SMA呈陽性反應(yīng)，表明培養(yǎng)的細胞為PASMCs，細胞核在DAPI標記后呈橢圓形藍色熒光(見圖2)。

A:α-SMA;B:DAPI;C:Merge。圖2 PASMCs免疫熒光法染色(×200)

2.3 Ost對PASMCs增殖活力的影響 CCK-8法檢測各組PASMCs增殖活力，與Control組比較，Model組細胞增殖活力明顯升高(P<0.05)，與模型組比較， Ost-M、Ost-H組細胞增殖活力則有不同程度的降低(P<0.05)，以O(shè)st-H組效果更明顯(見圖3)。

*：P<0.05 vs Control； #：P<0.05 vs 圖3 Ost對PDGF-BB所致PASMCs增殖的影響

2.4 Ost對PASMCs中PCNA表達的影響 與Control組比較，Model組PDGF-BB明顯增加PASMCs中PCNA蛋白的表達(P<0.05)；表明PDGF-BB促進了PASMCs的增殖；與Model組比，Ost-M、Ost-H組降低PASMCs中PCNA蛋白的表達(P<0.05)，以O(shè)st-H組效果更明顯，表明Ost對PDGF-BB誘導(dǎo)PASMCs增殖具有抑制作用(見圖4)。

*：P<0.05 vs Control； #：P<0.05 vs 圖4 Ost對PDGF-BB所致PASMCs中PCNA蛋白表達的影響

2.5 Ost對PASMCs中CaN表達的影響 與Control組比較，Model組PDGF-BB明顯上調(diào)PASMCs中CaN蛋白的表達(P<0.05)。與Model組比，Ost-M、Ost-H濃度組顯著抑制PDGF-BB所致PASMCs中CaN蛋白表達上調(diào)(P<0.05)，以O(shè)st-H濃度組抑制作用更明顯(見圖5)。

*：P<0.05 vs Control；#：P<0.05 vs 圖5 Ost對PDGF-BB所致PASMCs中CaN蛋白表達的影響

3 討論

PAH是發(fā)病機制復(fù)雜、預(yù)后差的心肺血管疾病。肺小動脈重構(gòu)是導(dǎo)致PAH產(chǎn)生的重要原因[10]。其中，PASMCs的過度增殖所致的肺血管阻力增加，是導(dǎo)致肺動脈重構(gòu)的重要因素[9]。平滑肌α-SMA蛋白是PASMCs表達的特征蛋白，通過倒置熒光顯微鏡觀察，本實驗條件下培養(yǎng)的PASMCs胞漿中α-SMA呈綠色熒光陽性反應(yīng)，細胞形態(tài)為長梭形、三角形或多角形，呈典型的“峰-谷”狀排列生長提示原代大鼠PASMCs培養(yǎng)成功。

PDGF-BB是血小板衍生生長因子(PDGF)家族成員之一，是有效的促細胞分裂因子，與血小板衍生生長因子受體(PDGFR)結(jié)合發(fā)揮起作用，參與細胞增殖和遷移。在PAH患者和動物的肺組織中發(fā)現(xiàn)了PDGF和PDGFR的表達增加[11]。PDGF-BB能誘導(dǎo)PASMCs的增殖和遷移，促進肺動脈重構(gòu)[12]，故本研究中用PDGF-BB誘導(dǎo)原代PASMCs的增殖。PCNA是DNA聚合酶δ的輔助蛋白,是細胞增殖的標志性蛋白[5-6]。本研究中，與Control組相比，Model組細胞增殖活力明顯增加，PCNA蛋白表達顯著上調(diào)，表明PDGF-BB誘導(dǎo)的PASMCs增殖模型成功。而給予中、高濃度Ost處理，可明顯抑制PDGF-BB所誘導(dǎo)的PASMCs的增殖活力的增加和PCNA蛋白表達的上調(diào)。此外，本課題組流式細胞儀檢測細胞周期，發(fā)現(xiàn)PDGF-BB使PASMCs增殖指數(shù)增高，Ost抑制其增殖。以上結(jié)果均說明Ost具有抑制PASMCs的增殖作用。

CaN是異二聚體，由其催化亞基CaNA和調(diào)節(jié)亞基CaNB組成的。在病理因素的影響下，細胞質(zhì)中鈣含量增加，調(diào)節(jié)亞基CaNB的鈣結(jié)合位點與鈣發(fā)生結(jié)合，進而引起CaNA構(gòu)象變化，使其磷酸酶活性位點暴露出來，并與CaM結(jié)合牢固，進而激活CaN[13]?；罨腃aN在參與細胞增殖、分化過程中，以及PAH的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。有趣的是，在慢性缺氧和野百合堿誘導(dǎo)的PASMCs增殖模型中，CaN的激活刺激PASMCs的增殖，從而加劇了肺小動脈重構(gòu)[4,14]。本實驗給予PDGF-BB干預(yù)原代培養(yǎng)的PASMCs 24h后，發(fā)現(xiàn)PDGF-BB可上調(diào)CaN蛋白表達水平，而中、高濃度的Ost可顯著抑制PDGF-BB所致的CaN蛋白表達水平的上調(diào)。

結(jié)合以上分析，提示Ost抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的PASMCs增殖與其下調(diào)CaN蛋白的表達相關(guān)。