喬莉，楊志業(yè)，李華，周穎儀，劉瀟瀟

(廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510663)

感冒清片是常見的治療風(fēng)熱感冒的中西藥復(fù)方制劑，由南板藍(lán)根、大青葉、崗梅、金盞銀盤、山芝麻、穿心蓮葉、對(duì)乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏、鹽酸嗎啉胍組方而成。其中對(duì)乙酰氨基酚具有解熱鎮(zhèn)痛作用；氯苯那敏能減輕微血管擴(kuò)張和降低毛細(xì)血管通透性，能緩解流涕、流淚、打噴嚏的癥狀；鹽酸嗎啉胍對(duì)多種病毒(如甲、乙型流感病毒，副流感病毒等)有抑制作用。中藥南板藍(lán)根和大青葉性寒、味苦，均具有清熱解毒，涼血消斑之功效；金盞銀盤具有清熱解毒，散瘀活血之功效[1]；崗梅具有清熱解毒，生津止渴，利咽消腫，散瘀止痛之功效[2]；山芝麻具有解表清熱，解毒消腫之功效[3]；穿心蓮葉具有清熱解毒，涼血，消腫之功效[4]。處方藥味中西合璧，協(xié)同發(fā)揮藥效，常用于感冒引起的發(fā)燒、頭痛、鼻塞流涕、噴嚏、咽喉腫痛、全身酸痛等癥狀[5]。但現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第十九冊(WS3-B-3716-98)，檢驗(yàn)項(xiàng)目僅包含了一個(gè)化學(xué)反應(yīng)、馬來酸氯苯那敏和鹽酸嗎啉胍的薄層色譜鑒別、對(duì)乙酰氨基酚的液相色譜鑒別和含量測定，缺乏對(duì)其中6味中藥的專屬性鑒別和有效成分的含量測定。特別是處方中的主要藥味南板藍(lán)根由于其生長年限長，野生資源匱乏，人工種植量少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場需求，導(dǎo)致藥材市場流通中出現(xiàn)了以同科植物球花馬藍(lán)[StrobilanthesPentstemonoides(Nees)T.Ander]、廣西馬藍(lán)(S.guangxiensisS.Z.Huang)、少花馬藍(lán)(S.oliganthusMiq.)和疏花馬藍(lán)[S.divaricatus(Nees)Ander]等作為南板藍(lán)根混用的現(xiàn)象[6]。因此，建立感冒清片中南板藍(lán)根的定性分析方法對(duì)完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、保證其有效性具有積極的意義。

南板藍(lán)根為爵床科植物馬藍(lán)[BaphicacanthusCusia(Nees) Bremek.]的干燥根莖和根，為抗病毒的常用中草藥，廣泛分布于我國華南、華東及西南地區(qū)，其化合物主要有生物堿類、黃酮類、有機(jī)酸類、苷類、甾醇類、五環(huán)三萜類等[7]?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國藥典》2015年版(一部)，檢驗(yàn)項(xiàng)目包括：橫切面的顯微鑒別；以靛藍(lán)、靛玉紅對(duì)照品為參照的薄層鑒別；水分、總灰分的檢查；浸出物的測定。有文獻(xiàn)報(bào)道以靛藍(lán)、靛玉紅作為專屬性指標(biāo)成分能有效地對(duì)馬藍(lán)和其混淆品球化馬藍(lán)、廣西馬藍(lán)、少花馬藍(lán)和疏花馬藍(lán)進(jìn)行鑒定[8-9]，但由于本品處方藥味大青葉亦含有靛藍(lán)和靛玉紅[10]，因此該方法不適用于本品中南板藍(lán)根的定性分析。另有Gu等[11-12]從南板藍(lán)根中分離得到2-苯并噁唑啉酮，該化合物的含量較高，且具有抗流感病毒(H1N1)的活性，與南板藍(lán)根的現(xiàn)代藥理作用基本相符。本研究以此為依據(jù)，首先通過對(duì)25批次的南板藍(lán)根正品、偽品和混淆品樣本進(jìn)行比較，結(jié)果顯示2-苯并噁唑啉酮為南板藍(lán)根的專屬性化學(xué)成分；然后以2-苯并噁唑啉酮作為感冒清片中南板藍(lán)根藥味的指標(biāo)成分，建立定性分析方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20AT液相色譜儀(包括四元泵、柱溫箱、SPD-M20A二極管陣列檢測器、自動(dòng)進(jìn)樣器、Lab Solution色譜數(shù)據(jù)處理軟件，美國安捷倫公司)；1290 Infinity超高效液相色譜儀(包括四元泵、柱溫箱、G4212A二極管陣列檢測器、自動(dòng)進(jìn)樣器，美國安捷倫公司)；6540 UHD Accurate- Mass- Q- TOF高分辨四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(配ESI源、Mass Hunter Acquisition色譜工作站和Qualitative Analysis數(shù)據(jù)處理軟件，德國優(yōu)萊博公司)；Julabo E19恒溫水浴箱(德國賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；CP225D(d=0.01 mg)、CP224S(d=0.1 mg)電子天平(德國艾爾瑪公司)；S300H超聲波清洗儀。

1.2 試藥 對(duì)照藥材南板藍(lán)根(批號(hào)：120971-201105和120971-201306)、對(duì)照品靛玉紅(批號(hào)：110717-200204)均購于中國食品藥品檢定研究院，對(duì)照品2-苯并噁唑啉酮(批號(hào)：C10040722)購于上海麥克林生化科技有限公司。市售南板藍(lán)根正品、南板藍(lán)根偽品、板藍(lán)根樣品共25批次(樣本編號(hào)為YC001～YC025)，經(jīng)廣東省藥品檢驗(yàn)所中成藥室/中藥材(飲片)室楊志業(yè)主任藥師采用生物分子測序的方法鑒定：其中YC001～YC005為南板藍(lán)根偽品；YC006為十字化科植物菘藍(lán)(IsatisindigoticaFort.)的干燥根；YC007～YC025為爵床科植物馬藍(lán)[BaphicacanthusCusia(Nees) Bremek.]的干燥根莖和根。感冒清片樣品共56批次涉及9家生產(chǎn)企業(yè)，均為2017年國家藥品抽驗(yàn)計(jì)劃抽檢樣品，詳見表1。感冒清片的標(biāo)準(zhǔn)制劑、缺南板藍(lán)根陰性樣品，均按感冒清片工藝制法在實(shí)驗(yàn)室模擬制備。甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 取2-苯并噁唑啉酮對(duì)照品適量，加甲醇-二氯甲烷(8∶2)制成每1 mL含10 μg的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液 取本品8片，除去包衣，研細(xì)，置錐形瓶中，加二氯甲烷50 mL，60 ℃水浴回流90 min，放冷，濾過，用二氯甲烷分次洗滌濾渣及容器，合并濾液及洗液，蒸干，殘?jiān)蛹状?二氯甲烷(8∶2)的混合溶液使溶解，并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇-二氯甲烷(8∶2)的混合溶液稀釋至刻度，即得。

2.1.3 南板藍(lán)根溶液 取南板藍(lán)根藥材粉末(過5號(hào)篩)約2 g，按“2.1.2”項(xiàng)下的方法操作，即得。

2.1.4 南板藍(lán)根水煎浸膏提取溶液 取南板藍(lán)根藥材粉末(過5號(hào)篩)約2 g，加水煎煮2次，第一次2 h，第二次1 h，過濾，合并濾液，濃縮至適量，加無水乙醇使含醇量達(dá)50%以上，靜置，濾過，濾液回收乙醇并濃縮至近干(按感冒清片工藝制法)，按“2.1.2”項(xiàng)下的方法操作，即得。

2.1.5 南板藍(lán)根陰性樣品溶液 取南板藍(lán)根陰性樣品適量(相當(dāng)于感冒清片8片的量)，按“2.1.2”項(xiàng)下的方法操作，即得。

2.2 HPLC-DAD法初篩

2.2.1 色譜條件 采用Agilent Ecilpse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；以甲醇為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫(0～40 min，20%A；40～60 min，20%A→70%A；60～80 min，70%A)；流速為1 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長為271 nm，并進(jìn)行200～400 nm全波長掃描；進(jìn)樣量為20 μL 。

2.2.2 儀器精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(標(biāo)準(zhǔn)制劑)，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果：2-苯并噁唑啉酮峰面積的RSD為0.3%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.2.3 專屬性試驗(yàn)

2.2.3.1 南板藍(lán)根藥材中2-苯并噁唑啉酮的專屬性試驗(yàn) 取收集的南板藍(lán)根正品、偽品和混淆品樣本共25批次和南板藍(lán)根對(duì)照藥材2批次，分別按“2.1.3”和“2.1.4”項(xiàng)下的方法操作，制成南板藍(lán)根對(duì)照藥材、正品、偽品和混淆品溶液和各自的水煎浸膏提取溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果：樣本YC001～YC006的溶液和其水煎浸膏提取溶液均未檢出2-苯并噁唑啉酮；樣本YC007～YC025的溶液、對(duì)照藥材的溶液和其水煎浸膏提取溶液均檢出2-苯并噁唑啉酮。說明2-苯并噁唑啉酮為南板藍(lán)根的專屬性化學(xué)成分。

2.2.3.2 感冒清片制劑的專屬性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液與南板藍(lán)根陰性樣品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1，表明缺南板藍(lán)根陰性樣品無干擾。

A.對(duì)照品；B.供試品；C.缺南板藍(lán)根陰性樣品 1.2-苯并噁唑啉酮

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(標(biāo)準(zhǔn)制劑)，研細(xì)，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按 “2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果：2-苯并噁唑啉酮單位峰面積的RSD為0.7%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批樣品(標(biāo)準(zhǔn)制劑)，按 “2.1.2”項(xiàng)下的方法制成供試品溶液，精密吸取10 μL，按 “2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件，分別在0、2、4、8、12、18和24 h，注入液相色譜儀，記錄峰面積。結(jié)果：2-苯并噁唑啉酮峰面積的RSD為0.2%(n=6)，表明樣品在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.6 檢測限 用2-苯并噁唑啉酮對(duì)照品溶液進(jìn)行逐級(jí)稀釋，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定，結(jié)果得檢測限為2.142 ng(S/N=3.3)。

2.2.7 樣本測定結(jié)果的判定 分別取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液和“2.1.2”項(xiàng)下的供試品溶液，按“2.2.1” 項(xiàng)下的色譜條件，記錄色譜圖：若供試品色譜中呈現(xiàn)與2-苯并噁唑啉酮對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間相同的色譜峰，且相應(yīng)的色譜峰在200～400 nm波長范圍的紫外吸收光譜相同，認(rèn)定為陽性樣本。若供試品色譜中未呈現(xiàn)與2-苯并噁唑啉酮對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間相同的色譜峰，或供試品色譜中呈現(xiàn)與2-苯并噁唑啉酮對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間相同的色譜峰，但相應(yīng)的色譜峰在200～400 nm波長范圍的紫外吸收光譜與對(duì)照品不相同，則需要采用超高效液相色譜-四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間-質(zhì)譜法確認(rèn)。

2.3 UPLC-Q-TOF-MS法確證

2.3.1 液相色譜條件 采用Agilent Poroshell 120 EC- C18(4.6 mm×50 mm，2.7 μm)色譜柱，以乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～20 min，20%A→60%A；20～25 min，60%A)，流速為0.2 mL·min-1，檢測波長為271 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量2 μL

2.3.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式采集數(shù)據(jù)；離子源溫度為150 ℃；毛細(xì)管電壓為3.5 kV；霧化器壓力為20 psi；干燥氣流速為8 L·min-1；干燥氣溫度為350 ℃；錐孔電壓65 V；掃描范圍為m/z：50～300；碰撞能為30 V。

2.3.3 檢出限 用2-苯并噁唑啉酮對(duì)照品溶液進(jìn)行逐級(jí)稀釋，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定，結(jié)果得檢測限為0.16 ng(S/N=3.0)。

2.3.4 樣本測定結(jié)果的判定 分別取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液和“2.1.2”項(xiàng)下的供試品溶液，按“2.3.1”和“2.3.2”項(xiàng)下超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜條件，記錄一級(jí)質(zhì)譜圖(見圖2)，2-苯并噁唑啉酮在負(fù)離子模式下，保留時(shí)間為7.799 min，獲得m/z:134.024 4的[M-H]-分子離子峰。若以質(zhì)荷比(m/z)134.02提取的供試品離子流色譜中，呈現(xiàn)與2-苯并噁唑啉酮對(duì)照品色譜保留時(shí)間相同的色譜峰，且相應(yīng)的色譜峰一級(jí)質(zhì)譜相同，認(rèn)定為陽性樣本。若以質(zhì)荷比(m/z)134.02提取的供試品離子流色譜中，未呈現(xiàn)與2-苯并噁唑啉酮對(duì)照品色譜保留時(shí)間相同的色譜峰，或供試品色譜中呈現(xiàn)與2-苯并噁唑啉酮對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間相同的色譜峰，但相應(yīng)相應(yīng)的色譜峰一級(jí)質(zhì)譜不相同，則認(rèn)定為陰性樣本。

A.對(duì)照品；B.供試品

2.4 結(jié)果 按擬定的南板藍(lán)根定性分析方法，對(duì)2017年國家藥品抽驗(yàn)計(jì)劃抽檢的9家生產(chǎn)企業(yè)共56批次感冒清片樣本進(jìn)行了測定，結(jié)果僅19批次的樣本檢出了2-苯并噁唑啉酮，檢出率為34%，詳見表2。

表2 樣品的檢測結(jié)果

3 討論

3.1 樣品前處理?xiàng)l件的選擇 提取溶劑的選擇上比較了無水乙醇、甲醇、乙酸乙酯和二氯甲烷，結(jié)果以二氯甲烷為提取溶劑時(shí)提取的效果最佳。提取方法的選擇上比較了超聲提取15、30、60 min和水浴回流提取30、60、90、120 min，水浴回流提取較超聲提取更完全，且水浴回流90 min后，測得2-苯并噁唑啉酮的含量無明顯增長，故選擇水浴回流提取的方式。

另外對(duì)2-苯并噁唑啉酮的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)該成分在80 ℃以上的環(huán)境中含量會(huì)有所降低，但是并未影響處方工藝條件下制得的本品及標(biāo)準(zhǔn)制劑的檢測結(jié)果。為了避免高溫條件對(duì)2-苯并噁唑啉酮的熱穩(wěn)定性影響，提取、干燥等前處理過程均采用溫度在80 ℃以下的方法。

3.2 色譜條件的選擇 流動(dòng)相選擇上比較了乙腈-水系統(tǒng)和甲醇-水系統(tǒng)，結(jié)果在采用甲醇-水系統(tǒng)時(shí)樣品中2-苯并噁唑啉酮能達(dá)到基線分離的要求。檢測波長的選擇上，對(duì)照品溶液在200～400 nm范圍內(nèi)經(jīng)二極管陣列檢測器掃描，結(jié)果2-苯并噁唑啉酮在223、271 nm處有最大吸收，且在271 nm處色譜基線較平穩(wěn)，雜質(zhì)峰較少，故選擇271 nm作為檢測波長。另外曾使用3個(gè)不同品牌的色譜柱，即Agilent Ecilpse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Phenomenex Luna C18(2)(4.6 mm×250 mm，5 μm)、資生堂 MGⅡ C18(4.6 mm ×150 mm，5 μm)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果均能滿足分離要求，且2-苯并噁唑啉酮的保留時(shí)間適中，峰形佳。

3.3 檢測方法的選擇 HPLC-DAD法檢出限為2.142 ng，UPLC-Q-TOF-MS法檢出限為0.16 ng。由于HPLC-DAD法的靈敏度較UPLC-Q-TOF-MS法低，當(dāng)采用HPLC-DAD法出現(xiàn)陰性結(jié)果時(shí)，建議采用UPLC-Q-TOF-MS法進(jìn)行結(jié)果確證。

3.4 小結(jié) 本研究建立了感冒清片中南板藍(lán)根的定性分析方法，該方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為感冒清片的質(zhì)量控制提供了技術(shù)支持，同時(shí)為南板藍(lán)根的質(zhì)量控制奠定了研究基礎(chǔ)。