藍保強，陸霞，農(nóng)云開，饒偉源,2

(1.廣西中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530022；2.廣西中藥質(zhì)量標準研究重點實驗室，廣西 南寧 530022)

冠通方來源于有多年臨床使用的民間驗方，立足“胸痹心痛”的中醫(yī)辨證理論而擬定，由桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎等藥材組成，具有理氣化痰，溫通經(jīng)絡(luò)，活血止痛之功效，用于痰瘀阻絡(luò)型胸痹心痛。

廣西中醫(yī)藥研究院和玉林市中醫(yī)醫(yī)院進行科技合作，對冠通方進行系統(tǒng)研究，將其開發(fā)成醫(yī)療機構(gòu)制劑——冠通顆粒，為了有效地控制藥品質(zhì)量，本文采用高效液相色譜法對冠通顆粒進行研究，選定方中君藥桃仁中的主要活性成分苦杏仁苷作為含量測定指標，建含量測定方法，為完善其質(zhì)量標準提供了科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-20AT型高效液相色譜儀(日本島津公司)；SPD-20A型紫外檢測器；AUW220D 型十萬分之一電子天平(日本島津公司)；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)?？嘈尤受諏φ掌?中國食品藥品檢定研究院提供，供含量測定用，批號：110820-201607，含量以90.7%計)，冠通顆粒及缺桃仁的陰性樣品由玉林市中醫(yī)醫(yī)院制劑室。水為重蒸水，甲醇為色譜純試劑，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取苦杏仁苷對照品適量，加甲醇制成濃度為50 μg·mL-1的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取冠通顆粒適量，研細，混勻，取細粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，置水浴上加熱回流60 min，放至室溫，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備 取缺桃仁的冠通顆粒陰性樣品適量，研細，混勻，取細粉約0.5 g，照“2.1.2”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱： Shimadzu VP-ODS色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：甲醇-水 (20∶80)；檢測波長：210 nm；柱溫：25 ℃，進樣量為10 μL。在此色譜條件下，苦杏仁苷峰分離度大于1.5，理論板數(shù)按苦杏仁苷峰計算不低于4 000。陰性樣品溶液、供試品溶液及對照品的色譜圖見圖1。

A.陰性樣品溶液；B.供試品溶液；C.對照品

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密稱取苦杏仁苷對照品8.27 mg(含量以90.7%計)，置100 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液(濃度為75.0 μg·mL-1)。按正文擬訂的色譜條件,分別進樣2、5、10、15、20 μL對照品溶液,以苦杏仁苷對照品進樣量(X，μg)為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線并計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)，得回歸方程為：Y=2.05×106X-1.87×104(r=0.999 9)。結(jié)果表明：當(dāng)苦杏仁苷進樣量在0.15～1.50 μg范圍內(nèi)時，線性關(guān)系良好。

2.3.2 專屬性試驗 取“2.1.3”項下陰性樣品溶液，照“2.2”項下的色譜條件，進樣10 μL測定，結(jié)果在苦杏仁苷出峰位置未出峰，說明陰性無干擾。陰性樣品溶液的色譜圖見圖1。

2.3.3 精密度試驗 取同一份供試品溶液，照“2.2”項下的色譜條件，連續(xù)進樣10 μL測定6次，記錄苦杏仁苷峰面積并計算RSD， 6次測定結(jié)果峰面積的RSD為1.40%(n=6)，說明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一供份試品溶液，照“2.2”項下的色譜條件，于0、1、2、3、6、12、24 h分別進樣10 μL測定，結(jié)果穩(wěn)定性試驗測定苦杏仁苷峰面積的RSD為1.53%(n=7)，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗 取同一批樣品(批號：180801)，研細，混勻，取細粉約0.5 g，共6份，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，平行測定，結(jié)果6份樣品測定苦杏仁苷含量的平均值為:3.618 mg·g-1，RSD=1.67%(n=6)。結(jié)果表明，本法的重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密稱取苦杏仁苷對照品9.76 mg(含量以90.7%計)，置250 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用(濃度為35.41 μg·mL-1)。稱取冠通顆粒(批號：180801，苦杏仁苷含量為3.618 mg·g-1)約0.25 g，平行取6份樣，分別精密加入上述濃度為35.41 μg·mL-1的對照品溶液25 mL，按 “2.1.2”項下方法制備加樣回收供試品溶液，測定，計算回收率，結(jié)果平均回收率為97.18%，RSD=1.95%(n=6)。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果(mg，n=6)

2.4 樣品測定 按本文建立的含量測定方法，測定了本品7批小試樣品和3批中試樣品中的苦杏仁苷含量，結(jié)果10批樣品含量在2.69～3.77 mg·g-1之間，平均含量3.28 mg·g-1。

3 討論

3.1 測定指標的選擇 桃仁為冠通顆粒方中君藥，為薔薇科植物桃[Prunuspersica(L.) Batsch]或山桃[P.davidiana(Carr.) Franch.]的干燥成熟種子[1]，具有活血祛瘀、止咳、平喘潤腸通便等功效[2-5]，苦杏仁苷(amygdalin)是桃仁的主要有效成分之一，其不僅有祛痰止咳的功效，研究顯示苦杏仁苷和其降解物還有抗動脈粥樣硬化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎等作用[6-7]，此外，苦杏仁苷本身雖然無毒，但通過酶解有可能產(chǎn)生有毒的氰化物[8]，所以測定苦杏仁苷的含量對控制冠通顆粒的安全有效具有重要意義。

3.2 供試品溶液的制備提取方法的比較 研究中對比了樣品分別精密加入甲醇25 mL，分別按超聲處理(功率240 W，頻率40 kHz)30 min、超聲處理(功率240 W，頻率40 kHz)60 min和加熱回流60 min處理，制得供試品溶液后，分別進樣測定。

表2 提取方法考察結(jié)果

從表2的結(jié)果可以看出本品加熱回流效率遠大于超聲提取，這明顯有別于多數(shù)中藥指標性成分超聲提取效率和加熱回流提取效率較接近的情況[9-10]，本文選擇提取較完全的加熱回流作為提取方法。

3.3 為了避免對醫(yī)院原冠通方的提取工藝發(fā)生質(zhì)的改變，在開發(fā)成醫(yī)院制劑時，保留其傳統(tǒng)的煎煮工藝，用采用L9(34)正交設(shè)計，進行正交試驗優(yōu)選工藝參數(shù)，10批試制樣品中苦杏仁苷轉(zhuǎn)移率35.2%～46.4%，保持比較穩(wěn)定的水平。