王桂平，梁杰聰，張彥燾 ，李智斌

(1.廣州衛(wèi)生職業(yè)技術學院藥學系，廣東 廣州 510180；2.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心外科，廣東 廣州 510623)

肺腺癌是常見的肺癌類型，約占原發(fā)性肺癌的40%，嚴重危害人類健康。手術切除仍是最有效的早期肺腺癌治療手段，但不幸的是，大多數(shù)肺癌發(fā)現(xiàn)時均進入晚期，已喪失手術最佳治療時間。近年來，靶向藥物如吉非替尼、克唑替尼等明顯改善肺癌的生存率，然后，由于大多數(shù)已為晚期腫瘤患者，以及某些患者體內(nèi)存在不同的基因突變及遺傳異質(zhì)性致使化療耐藥產(chǎn)生，目前數(shù)據(jù)顯示化療的有效率僅為20%～40%，肺癌總體生存率仍然非常低[1]。

吉西他濱(Gemcitabine)是一種新型胞嘧啶核苷衍生物，也是目前晚期(Ⅳ期)肺腺癌等非小細胞肺癌的一線用藥。隨著吉西他濱在臨床的廣泛應用，腫瘤耐藥性也成為制約吉西他濱臨床療效的關鍵問題[2]。目前，已發(fā)現(xiàn)ENT1、RRM1及CDA等基因可能是導致吉西他濱耐藥性產(chǎn)生的重要因子，但這些因子是否可以作為個體化治療生物標志物，仍需進一步研究。腫瘤化療耐藥性產(chǎn)生機制相當復雜，涉及較多基因及生物信號轉(zhuǎn)導過程。本研究中，我們將基于TCGA、GEO數(shù)據(jù)平臺，采用系統(tǒng)生物學模式，構建吉西他濱肺腺癌耐藥蛋白調(diào)控網(wǎng)絡，從調(diào)控網(wǎng)絡中挖掘可能的耐藥因子，尋找具有臨床應用前景的個體化治療標志物。

1 材料與方法

1.1 基因表達譜數(shù)據(jù)集獲取及差異基因表達分析 從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中獲得基因表達譜數(shù)據(jù)集(No:GSE6914)。該數(shù)據(jù)集采用GPL96芯片平臺([HG-U133A]Affymetrix Human Genome U133A Array)，包括20個配對樣本，本研究選擇其中的8個樣本進行研究，即4個Calu3正常細胞樣本和4個gemcitabine耐藥Calu3細胞樣本。采用dChip分析軟件進行差異基因分析，獲得gemcitabine耐藥的差異表達基因(DEGs),具體操作方法按dChip操作指南進行(http:// www.dchip.org )，2-fold change的基因被選擇為差異表達基因。

1.2 差異表達基因的go和pathway聚類分析[3]采用DAVID在線分析軟件(https://david.ncifcrf.gov/)對差異基因進行基因注釋、生物信號通路功能聚類分析，選擇P<0.05,且富聚數(shù)量基因≥10的聚類結果。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡構建及hub基因發(fā)現(xiàn)[4]采用STRING軟件(https://string-db.org/)構建gemcitabine耐藥蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡，然后，應用cytohubb APP 分析蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡，獲得排列前10位的10個hub基因。

1.4 hub基因的在腫瘤組織中表達分析[5]Oncomine數(shù)據(jù)庫已經(jīng)收集了729個基因表達數(shù)據(jù)集，90 000多個癌癥組織和正常組織的樣本數(shù)據(jù)，是目前世界上最大的癌基因芯片數(shù)據(jù)庫和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺，可用于比較主要癌癥類型和各自正常組織的差異表達分析，也可以用于探索各種癌癥亞型以及基于臨床和病理學的分析。本項目應用Oncomine 數(shù)據(jù)庫，比較hub基因在肺腺癌等腫瘤與相應正常組織中的表達水平。

1.5 ADCY9基因表達及預后分析 基于Oncomine 數(shù)據(jù)庫，系統(tǒng)分析ADCY9在肺腺癌與癌旁正常組織中的表達差異；采用GEPIA分析工具(http://gepia.cancer-pku.cn)，分析ADCY9 mRNA表達水平與肺腺癌總體生存率的關系。

1.6 ADCY9共表達基因分析 基于GSE6914數(shù)據(jù)集中gemcitabine耐藥和敏感的樣本，通過Oncomine數(shù)據(jù)庫分析ADCY9的共表達基因，并采用DAVID分析工具對共表達基因進行基因與信號通路的聚類分析。

2 結果

2.1 吉西他濱誘導肺腺癌耐藥的差異表達基因 本研究采用dChip分析軟件對GSE6914數(shù)據(jù)集中8個樣本進行差異基因分析，最終獲得差異表達基因391個，其中上調(diào)基因80個，下調(diào)基因311個(數(shù)據(jù)未提供)。信號通路富集分析顯示，RAP1、RAS及PI3K-AKT等通路顯著下調(diào)(見圖1)；而基因生物學功能富集顯示，正向調(diào)控細胞轉(zhuǎn)移、細胞增殖等過程基因表達顯著上調(diào)，而炎癥反應相關免疫因子、正向調(diào)控鈣離子活動及細胞外間隙等生物過程中的基因則顯著下調(diào)表達(見圖2)。

圖1 吉西他濱肺腺癌耐藥差異表達基因KEGG通路富集分析

圖2 吉西他濱肺腺癌耐藥差異表達基因GO富集分析

2.2 吉西他濱誘導肺腺癌耐藥的hub基因篩選 吉西他濱誘導的肺腺癌耐藥差異表達基因，經(jīng)基因生物功能及信號通路富集后，將顯著富集基因輸入STRING軟件進行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡構建，獲得162個結點，126條邊,平均節(jié)點度為1.56，PPI網(wǎng)絡富集具有顯著性(P=0.019 5)。應用cytohubba APP對網(wǎng)絡進行分析，獲得排列前10的hub基因，即BDKRB2、BDKRB1、POMC、ADCY9、SSTR3、CXCR1、CCL13、PTGER3、 HRH3 及INSL5(如圖3)。

圖3 吉西他濱耐藥肺腺癌蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡及hub基因

2.3 hub基因在肺腺癌及其他腫瘤組織中的表達分析 基于TCGA和Oncomine庫分析，結果顯示10個hub基因在肺癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、白血病等人類腫瘤中主要以下調(diào)表達為主，其中，ADCY9、CCL13及OTGER3基因在肺腺癌存在明顯表達下調(diào)，而其他hub基因則出現(xiàn)較大的腫瘤異質(zhì)性，其表達情況不明確(見圖4)。

2.4 ADCY9基因在肺腺癌中表達及預后分析 在所有hub基因中，ADCY9的表達與肺腺癌關系最為顯著，該基因在肺腺癌中明顯表達下調(diào)，生存分析也發(fā)現(xiàn)ADCY9基因高水平表達可降低肺腺癌總體死亡風險(log rankP=0.014)，如圖5所示。

2.5 ADCY9基因介導吉西他濱肺腺癌耐藥機制 ADCY9基因可能是影響肺腺癌發(fā)生進展的重要因子，該基因的異常表達是否與吉西他濱肺腺癌耐藥有關。ADCY9基因在吉西他濱肺腺癌耐藥中的表達情況分析結果顯示(見圖6)：ADCY9基因在吉西他濱耐藥的肺腺癌樣本中表達下調(diào)，而對吉西他濱敏感的肺腺癌樣本中則上調(diào)表達。基因共表達分析發(fā)現(xiàn)，ADCY9基因與SMAD6存在相似的表達，相關性分析也顯示ADCY9與SMAD6基因具有顯著相關性(P=5.6×10-27,R=0.44，見圖7)。對獲得的ADCY9共表達基因進行基因功能與信號通路聚類分析發(fā)現(xiàn)，共表達基因主要涉及肌醇磷酸化、MAPKK活化、鈣離子負性轉(zhuǎn)運、蛋白磷酸化負性調(diào)控、細胞生長負性調(diào)控等生物學過程，以及Rho蛋白及G蛋白信號等信號通路(見圖8)。

圖4 hub基因在人類常見腫瘤中的表達分析

1.吉西他濱耐藥組；2.吉西他濱敏感組

圖7 ADCY9與SMAD6基因相關性分析結果

圖8 ADCY9共表達基因KEGG 通路及基因GO富集結果

3 討論

吉西他濱是一種新型人工合成嘧啶核苷類似物，主要通過抑制DNA，干擾癌細胞的復制產(chǎn)生抗腫瘤效應，是晚期非小細胞肺癌等腫瘤治療的重要藥物。然而，較多的患者仍然對其產(chǎn)生了耐藥性，最終導致治療失敗，因此，探索吉西他濱耐藥的分子機制，一直以來是科學家研究的重點。本研究獲得吉西他濱耐藥的肺腺癌差異表達基因譜，該表達譜主要以下調(diào)基因表達(311個下調(diào)基因)為主，主要表現(xiàn)為RAP1、RAS及PI3K-AKT、鈣離子活動正向調(diào)控等通路顯著下調(diào)表達。接著，基于生物過程及信號通路富集結果，我們構建了吉西他濱耐藥的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡，并獲得BDKRB2、BDKRB1、POMC、ADCY9等10個hub基因，其中ADCY9基因在肺腺癌組織中明顯下調(diào)表達，并且與肺腺癌的預后有關。

ADCY9基因主要催化信號分子cAMP的形成，其作用主要受 GPCRs、鈣等調(diào)控。ADCY9基因在肺腺癌組織中明顯低表達，該基因是否也與吉西他濱所致肺腺癌耐藥有關？本研究進一步分析ADCY9基因與吉西他濱耐藥的關系，發(fā)現(xiàn)ADCY9基因在吉西他濱耐藥的肺腺癌樣本中明顯低表達，而在吉西他濱敏感的肺腺癌樣本中則高表達，此說明ADCY9基因的低表達可能與吉西他濱耐藥相關。為分析ADCY9基因介導引起吉西他濱耐藥的機制，我們獲得了ADCY9基因的共表達基因，發(fā)現(xiàn)該基因與SMAD6基因存在相似的表達，并且相關性分析也顯示ADCY9與SMAD6基因具有顯著相關性(P=5.6×10-27,R=0.44)。SMAD6作為一種重要的信號轉(zhuǎn)導因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，主要負性調(diào)控TGF-β信號通路的激活。TGF-β信號通路具有抑癌和促癌雙重作用，近年來的研究表明，該信號通路與腫瘤耐藥性密切相關，MED12蛋白的缺失導致TGF-β信號通 路活化，從而導致癌細胞對TKIs類耐藥性產(chǎn)生，而TGF-β抑制劑聯(lián)合TKIs藥物，則可對抗癌細胞的TKIs耐藥[6-7]。此外，TGF-β信號通 路還可通過上調(diào)PKCa的表達增強耐藥，也可通過誘導ET-1、OCT4等因子的表達，促進EMT而產(chǎn)生耐藥[8]。綜上，我們推測ADCY9基因的低表達可能是介導吉西他濱肺腺癌耐藥的重要分子之一，低表達的ADCY9基因是否也是通過活化TGF-β信號通 路產(chǎn)生耐藥，此需要進一步的實驗證實。

為進一步明確ADCY9介導吉西他濱肺腺癌耐藥的分子機制，本項目對獲得的共表達基因，進行基因功能與信號通路聚類分析，結果發(fā)現(xiàn)ADCY9基因的功能可能涉及肌醇磷酸化、放射反應、MAPKK活化、鈣離子負性轉(zhuǎn)運、蛋白磷酸化負性調(diào)控、細胞生長負性調(diào)控等生物學過程，以及Rho蛋白及G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)等信號通路。上述共表達基因聚類生物過程事件中，許多均與腫瘤耐藥有關，例如MAPKK(Raf)的激活可削弱化療藥的抗腫瘤 效果,成為產(chǎn)生耐藥的一個重要原因[9]；Rho蛋白家族中RhoA、RhoB及RhoE等均與腫瘤耐藥的產(chǎn)生有關[10-11]； GPCR則是目前最為成功的藥物靶標家族，目前40%以上的上市藥物以GPCR為靶點，PI3K/Akt 是GPCR下游的主要效應因子，而PI3K/Akt 信號通路 可通過多種機制引起腫瘤的多藥耐藥[12-13]?；谏鲜龉脖磉_基因分析，我們推測吉西他濱肺腺癌耐藥機制可能與Rho蛋白、G蛋白偶聯(lián)受體介導的MAPKK(Raf)、PI3K/Akt等信號通路相關，ADCY9基因的下調(diào)表達在Rho、Raf、PI3K/Akt等因素介導的耐藥機制中究竟扮演什么角色？此需要進一步的實驗證實。