譚國(guó)耀，洪偉鵬，張蕾，曹霖，王黛菲，金晶

(中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

肺癌是一種起源于支氣管黏膜或腺體的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率居高不下，且增長(zhǎng)迅速，對(duì)人類的生存和健康構(gòu)成巨大威脅。雖然目前肺癌的檢測(cè)和治療手段在不斷進(jìn)步，但是據(jù)統(tǒng)計(jì)，患者的5年生存率仍然不足15%[1]。目前，肺癌的常用治療手段包括化療、放療、手術(shù)和分子靶向治療，其中以順鉑等為代表的傳統(tǒng)化療藥物仍然是治療肺癌各個(gè)階段的重要藥物[2]。但是隨著患者疾病的進(jìn)展，患者往往會(huì)對(duì)這些化療藥物產(chǎn)生一定的耐藥性。因此，尋找有效的逆轉(zhuǎn)耐藥、增加患者對(duì)化療藥物敏感性的治療方式顯得非常重要。

磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway，PPP)是葡萄糖代謝的主要途徑之一，由氧化分支和非氧化分支構(gòu)成，主要產(chǎn)物包括NADPH、磷酸核糖以及其他四碳、五碳、七碳化合物，影響細(xì)胞的脂質(zhì)、核酸的合成以及其他代謝途徑，是一條具有多功能的重要代謝途徑[3]。大量的研究表明，多數(shù)腫瘤細(xì)胞中PPP的活性異常，PPP的異常改變直接影響了腫瘤細(xì)胞的存活、增殖和衰老。除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)PPP受到包括癌基因蛋白、腫瘤抑制因子和細(xì)胞內(nèi)代謝物等多種因素的影響[4]。因此PPP對(duì)于腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有非常重要的作用。

隱丹參酮(cryptotanshinone,CTS)是傳統(tǒng)中藥丹參中的一種脂溶性的有效成分，最初因其抗心血管疾病的功效引起研究者的關(guān)注。而近年來(lái)，關(guān)于CTS抗腫瘤的研究逐漸增多，大量研究發(fā)現(xiàn)，CTS可以通過(guò)引起癌細(xì)胞周期阻滯、抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤血管生成和遷移等機(jī)制來(lái)發(fā)揮抗腫瘤效果。因此，CTS在抗癌上有著廣闊的應(yīng)用前景。

本研究初步探討CTS對(duì)A549/CDDP細(xì)胞PPP相關(guān)蛋白表達(dá)的影響及其可能的機(jī)制，為進(jìn)一步開(kāi)展CTS的抗腫瘤作用機(jī)制研究提供思路，并為CTS用于肺癌治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 CTS(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；青霉素鏈霉素溶液、DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶-EDTA(美國(guó)Hyclone公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄、SYBR green試劑(日本Takara公司)；RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher公司)；ECL化學(xué)發(fā)光液(北京Engreen公司)；兔抗G6PD、PGD、TKT、GAPDH抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；兔抗TALDO1(上海生工生物工程股份有限公司)；兔抗NRF2抗體(美國(guó)Abcam公司)。

1.2 細(xì)胞 人肺癌A549細(xì)胞和順鉑耐藥A549/CDDP細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所饋贈(zèng)。

1.3 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher公司)；低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(美國(guó)Applied Biosystems公司)；電泳、電轉(zhuǎn)系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；ImageQuant LAS 4000曝光成像儀(美國(guó)General Electric公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)。

1.4 方法

1.4.1 A549細(xì)胞和A549/CDDP細(xì)胞的培養(yǎng) A549細(xì)胞和A549/CDDP細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，可用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 CCK-8法測(cè)細(xì)胞存活率 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞分別接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。給藥分組如下：空白對(duì)照組，50 μmol·L-1CDDP組，2.5 μmol·L-1CTS組，2.5 μmol·L-1CTS合用50 μmol·L-1CDDP組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μL。用不含血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋藥物，使其終濃度分別為上述分組所示，空白對(duì)照組為含相同濃度DMSO的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，將孔中液體吸出，另設(shè)4個(gè)空白復(fù)孔，每孔加入100 μL含10% CCK-8的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)1 h后，置于搖床上低速震蕩30 s，使孔內(nèi)顏色分布均勻。檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm的吸光度值(optical density，OD)，細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD - 空白孔OD)/(對(duì)照組OD-空白孔OD)×100%。

1.4.3 qPCR檢測(cè)mRNA表達(dá) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞和A549/CDDP細(xì)胞接種于12孔板，待細(xì)胞融合度為90%左右終止細(xì)胞培養(yǎng)。分別提取兩種細(xì)胞的總RNA，按照說(shuō)明書的步驟逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，qPCR檢測(cè)PPP相關(guān)的G6PD、PGD、TKT、TALDO1的mRNA表達(dá)水平，以ACTB作為內(nèi)參。引物序列見(jiàn)表1。

1.4.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) A549細(xì)胞和A549/CDDP細(xì)胞不經(jīng)藥物處理或經(jīng)不同濃度CTS處理48 h后，終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，棄去殘余的PBS，每孔加入100 μL裂解液，置于冰上裂解30 min，刮取孔內(nèi)細(xì)胞及裂解液收集于1.5 mL EP管中，超聲10 s，于4 ℃ 16 000 g離心20 min，獲得細(xì)胞總蛋白。進(jìn)行蛋白定量后，加入適量的5×SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水浴變性10 min。按每孔25 μg總蛋白計(jì)算上樣量，進(jìn)行電泳操作，電泳分離后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗G6PD、PGD、TKT、TALDO1、NRF2、AKT和GAPDH ，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次7 min，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次7 min，顯影。使用Image J軟件分析結(jié)果。

表1 qPCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 A549細(xì)胞和A549/CDDP細(xì)胞PPP相關(guān)基因mRNA及蛋白表達(dá)水平的差異 如圖1所示，與A549細(xì)胞相比，順鉑耐藥A549/CDDP細(xì)胞G6PD、GPD、TKT和TALDO1的mRNA水平明顯升高(P<0.001)；而如圖2所示，G6PD(P<0.001)、PGD(P<0.001)和TALDO1(P<0.05)的蛋白表達(dá)水平明顯上升，表明兩種細(xì)胞在PPP代謝上存在著差異，A549/CDDP細(xì)胞PPP代謝可能更加旺盛。

圖1 A549細(xì)胞和A549/CDDP細(xì)胞PPP相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平

圖2 A549細(xì)胞和A549/CDDP細(xì)胞PPP相關(guān)蛋白表達(dá)水平

2.2 CTS對(duì)順鉑處理A549/CDDP細(xì)胞后細(xì)胞存活率的影響 如圖3所示，CTS能夠明顯降低順鉑處理A549/CDDP細(xì)胞后細(xì)胞的存活率(P<0.05)，而對(duì)順鉑處理A549細(xì)胞后的存活率影響不明顯，表明CTS能增加A549/CDDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，從而增加順鉑對(duì)A549/CDDP細(xì)胞的殺傷效果。

圖3 CTS對(duì)順鉑處理后細(xì)胞存活率的影響

2.3 CTS對(duì)A549/CDDP細(xì)胞PPP相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 如圖4所示，CTS處理后，A549/CDDP細(xì)胞內(nèi)TKT蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.001)，且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，而G6PD、PGD和TALDO1蛋白表達(dá)水平變化不明顯，表明CTS對(duì)A549/CDDP細(xì)胞中PPP相關(guān)蛋白TKT的表達(dá)具有一定的抑制作用。

圖4 CTS對(duì)A549/CDDP細(xì)胞PPP相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.4 CTS對(duì)A549/CDDP細(xì)胞AKT、NRF2蛋白表達(dá)水平的影響 如圖5所示，CTS能夠明顯下調(diào)A549/CDDP細(xì)胞AKT的蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，且這種調(diào)節(jié)作用具有一定的劑量依賴性；此外，當(dāng)CTS濃度超過(guò)2.5 μmol·L-1時(shí)，能夠明顯下調(diào)A549/CDDP細(xì)胞NRF2的蛋白表達(dá)水平(P<0.001)。

圖5 CTS對(duì)A549/CDDP細(xì)胞AKT、NRF2蛋白表達(dá)的影響

3 討論

磷酸戊糖途徑，也稱為磷酸葡萄糖酸途徑，是葡萄糖分解代謝的主要途徑之一。大量的研究表明，PPP對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖具有重要的調(diào)控作用[5]。PPP主要包含氧化分支和非氧化分支，G6PD是葡萄糖進(jìn)入PPP氧化分支中的第一個(gè)限速酶，也是控制PPP速率和活性的關(guān)鍵酶，PGD則催化G6PD的催化產(chǎn)物氧化脫羧，生成核酮糖-5-磷酸進(jìn)入非氧化分支。而TKT和TALDO1是非氧化分支中的兩個(gè)關(guān)鍵酶，調(diào)節(jié)PPP兩個(gè)分支的活性和速率平衡[6]。而研究發(fā)現(xiàn)，順鉑耐藥A549/CDDP細(xì)胞中上述PPP相關(guān)蛋白表達(dá)升高，提示順鉑耐藥的產(chǎn)生可能與PPP相關(guān)蛋白的表達(dá)升高有關(guān)。

CTS是傳統(tǒng)中藥丹參中的一種有效成分，在抗炎、抗氧化和抗心血管疾病中均有較好的藥理作用。在腫瘤治療方面，研究發(fā)現(xiàn)，CTS可以通過(guò)上游靶點(diǎn)影響細(xì)胞增殖，引起周期阻滯或者誘導(dǎo)凋亡[7-8]；另外，CTS可以抑制腫瘤血管的生成并抑制腫瘤的遷移[9-10]。除此之外，CTS在逆轉(zhuǎn)耐藥或者抗癌藥物的增敏上也具有一定的作用，研究發(fā)現(xiàn)，CTS可以通過(guò)下調(diào)腫瘤細(xì)胞中P-gp的表達(dá)，是細(xì)胞內(nèi)的藥物外排減弱，從而增強(qiáng)化療藥物如阿霉素等的治療效果，有效逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞株的耐藥性[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，CTS可以增加順鉑耐藥A549/CDDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，從而使細(xì)胞的存活率降低。

近年來(lái)的研究表明，多種致癌途徑參與了癌細(xì)胞代謝調(diào)控。PI3K/AKT通路調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和生存，NRF2是維持氧化還原穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)控因子，對(duì)包括侵襲性增殖在內(nèi)的癌癥的惡性表型的維持具有重要的調(diào)控作用。研究表明，活躍的PI3K/AKT通路增強(qiáng)NRF2的核累積，激活PPP相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞代謝活動(dòng)從而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖[12]。此外，AKT還能通過(guò)磷酸化TKT，顯著增強(qiáng)其酶活性，增強(qiáng)PPP非氧化分支代謝PPP，從而對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有非常重要的作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)，CTS可以顯著下調(diào)A549/CDDP細(xì)胞中TKT的蛋白表達(dá)水平，同時(shí)CTS還可以顯著下調(diào)A549/CDDP細(xì)胞中AKT和NRF2的蛋白表達(dá)水平，提示CTS很有可能通過(guò)下調(diào)AKT和NRF的表達(dá)，從而抑制PPP相關(guān)蛋白TKT的表達(dá)，抑制耐藥細(xì)胞相關(guān)的代謝途徑，從而使耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性增加，從而對(duì)耐藥細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖起到抑制作用。

綜上所述，CTS能夠增加順鉑耐藥A549/CDDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，其機(jī)制可能通過(guò)抑制AKT和NRF2的表達(dá)從而抑制PPP相關(guān)蛋白TKT的表達(dá)，抑制細(xì)胞的PPP代謝，從而增加細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，使細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。本研究為開(kāi)展CTS的抗腫瘤相關(guān)機(jī)制研究提供思路，并為CTS用于肺癌治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。