鄭曉敏 楊芳遠(yuǎn) 劉翠平 楊金奎*

(1．清華大學(xué)附屬垂楊柳醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100022；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100730；3.糖尿病防治研究北京市重點實驗室，北京 100730；4.北京市糖尿病研究所，北京 100730)

糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease, DKD)是糖尿病的重要合并癥，是造成慢性腎臟病和終末期腎病的主要原因[1-3]。DKD的早期確診是預(yù)防和早期干預(yù)的基礎(chǔ)。腎活檢對各種類型的慢性腎病最有鑒別診斷價值，但因其有創(chuàng)程度高，不推薦常規(guī)檢測，目前推薦采用隨機尿測定尿白蛋白/肌酐(urine albumin to creatinine ratio，UACR)早期篩查DKD[4]，但由于其水平受多種因素影響，且長期觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，微量白蛋白尿的患者在10年中僅有30%～45%轉(zhuǎn)變?yōu)榇罅堪椎鞍啄?，?0%轉(zhuǎn)變?yōu)槟虬椎鞍钻幮?，該現(xiàn)象在2型糖尿病患者中更為顯著[5]。因此，尿白蛋白對診斷2型糖尿病腎病的特異性不足，對預(yù)測病情的轉(zhuǎn)歸也存在局限性。近年來研究[6-9]顯示的某些尿中生物標(biāo)志物也可用于診斷DKD，包括其他腎小球生物標(biāo)志物如轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，TRF)、銅藍(lán)蛋白(ceruloplasmin, CP)、Ⅳ型膠原蛋白(type Ⅳ collagen, Co-Ⅳ)、層粘連蛋白(laminin,LN)、糖胺聚糖(glycosaminoglycans, GAG)等;腎小管生物標(biāo)志物如中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)的脂質(zhì)運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)、α1-微球蛋白(α1-microglobulin，α1-MG)、β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)、腎臟損傷分子-1 (kidney injury molecule-1，KIM-1)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D glucosaminidase，NAG)、血管緊張素原(angiotensinogen,AGT)等；炎性反應(yīng)因子如腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α, TNF-α)、類黏蛋白(orosomucoid)等；氧化應(yīng)激相關(guān)分子如心臟脂肪酸結(jié)合蛋白(heart-fatty acid binding protein,H-FABP)、高級糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGE)等;足細(xì)胞生物標(biāo)志物(podocalyxin、nephrine等)和血管生物標(biāo)志物如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等來評估早期DKD。但其可靠性、特異性、敏感性仍需更多研究證實，目前尚未作為診斷依據(jù)。DKD的早期診斷仍是最具挑戰(zhàn)性的公共健康問題[4]。

近年隨著組學(xué)技術(shù)的進(jìn)展，尿蛋白組學(xué)研究在糖尿病腎病早期診斷方面進(jìn)展較多。通過對不同糖尿病患者尿蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)尿觸珠蛋白(haptoglobin，Hp)在早期DKD中可預(yù)測腎功能的進(jìn)展，尿觸珠蛋白/肌酐比(haptoglobin to creatinine ratio，HCR)可以作為糖尿病患者腎功能受損的早期標(biāo)志物[10-12]。本文就Hp對早期糖尿病腎病患者腎功能損害的預(yù)測作用及相關(guān)機制進(jìn)行綜述。

1 觸珠蛋白的生物學(xué)特征

1.1 Hp的結(jié)構(gòu)

Hp又稱結(jié)合珠蛋白，基因位于人類染色體16q22。Hp分子是由兩條β鏈和兩條α鏈通過二硫鍵連接組成的四聚體[13]。其中β鏈?zhǔn)窍嗤模琀p的多態(tài)性主要是α鏈的遺傳變異造成。α鏈有兩種等位基因Hp1和Hp2，形成3種不同的基因型，分別是Hp1-1、Hp2-1及Hp2-2。α鏈有a1和a2兩種，其中a1又有a1S和a1F兩種亞型，二者僅相差1個氨基酸，第54位氨基酸a1F為賴氨酸，a1S為谷氨酸。α1鏈含83個氨基酸，相對分子質(zhì)量約9 100。α2含有1.7kb的內(nèi)部重復(fù)，含有142個氨基酸，相對分子質(zhì)量約16 000。純合Hp1等位基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物Hp1-1是單價體,相對分子質(zhì)量86 000。Hp2等位基因產(chǎn)物雜合(Hp2-1)或純合(Hp2-2)則形成多個Hp分子的多聚體：Hp2-1為各種線性同源二聚體和多聚體，Hp2-2形成環(huán)狀聚合物。

1.2 Hp的分布和表達(dá)

Hp是血清α2球蛋白組分中的一種酸性糖蛋白，廣泛存在于人類和許多哺乳動物的血液和其他體液中。在人血漿循環(huán)中的濃度為0.3～3 g/L。Hp最初是在肝臟中作為炎性反應(yīng)的急性期反應(yīng)蛋白被分離，合成的主要部位為肝臟，后來發(fā)現(xiàn)它也存在于包括中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞中[14]。另外有研究[15-16]證實腎近曲小管上皮細(xì)胞在炎性反應(yīng)因子刺激下可以合成和分泌Hp,白色脂肪組織及其他的一些組織(胃、腸、腎上腺、肌肉、腦、附睪、食道、胎盤、卵巢、輸尿管等)也有Hp的mRNA表達(dá)。

1.3 Hp的功能

Hp最主要的功能是與血漿中的游離血紅蛋白(hemoglobin，Hb)結(jié)合并被清除，從而阻止游離Hb進(jìn)一步的氧化還原反應(yīng)和相應(yīng)的組織損傷[17-18]。臨床上很多造成紅細(xì)胞破壞的原因如溶血、創(chuàng)傷等，均可引起血中游離Hb明顯升高，游離Hb是一種強效氧化蛋白，其中的亞鐵血紅素成分被氧化后會導(dǎo)致細(xì)胞損傷和組織損傷[19-20]。Hp分子的每個β鏈上的Hb結(jié)合位點可以與血漿中的游離Hb結(jié)合，形成高親和力、不可逆Hp-Hb復(fù)合物，進(jìn)而被清除受體CD163識別并在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行消除，防止游離Hb對組織的損傷。此外，游離Hb可穿過腎小球濾過膜，導(dǎo)致腎臟氧化性損傷，而血漿中Hp可迅速與游離Hb結(jié)合并被清除，從而阻止游離Hb從腎小球濾過，防止Hb可能導(dǎo)致的腎小管損傷[21-22]。另外，Hp長期以來被認(rèn)為是炎性反應(yīng)的標(biāo)志物[23]，具有抗氧化作用，它在抗感染、修復(fù)損傷組織以及保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的過程中起著重要作用。其血清含量在感染、創(chuàng)傷、炎性反應(yīng)、腫瘤、心肌梗死等病理狀態(tài)時顯著升高[24]。在炎性反應(yīng)和血管損傷時，血清中Hp增加，血流的持續(xù)變化也會誘導(dǎo)動脈壁中的Hp表達(dá)，并且通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移參與血管重建和修復(fù)[25]。Hp在移植后炎性反應(yīng)中也起重要作用，啟動了移植物排斥過程[26]。此外，Hp尚有抗氧化活性、抑制前列腺素合成、抑制細(xì)菌、參與細(xì)胞凋亡及免疫反應(yīng)。在許多情況下，Hp上調(diào)是為了應(yīng)對潛在的有害狀態(tài)，這通?？梢栽缙谔崾炯膊』蚱渌±砀淖僛16,27]。

2 Hp與DKD的臨床研究

很長時間以來，研究者不斷探索DKD的早期診斷，但仍不能確定靈敏度和特異度均理想的指標(biāo)。近年來，隨著組學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，關(guān)于尿蛋白質(zhì)組學(xué)在DKD早期診斷方面的研究取得了顯著進(jìn)展。通過對不同糖尿病患者尿蛋白質(zhì)組的研究[10-11]證實尿Hp在早期DKD中可預(yù)測腎功能的進(jìn)展。

Yang等[10]利用尿液蛋白質(zhì)組學(xué)對糖尿病視網(wǎng)膜病變極端病例進(jìn)行前瞻性分析研究。從1 544例2型糖尿病患者中篩出112例增生期視網(wǎng)膜病變和105例糖尿病病程大于10年而無任何程度糖尿病視網(wǎng)膜病變的對照組，選擇其中微量白蛋白尿的患者應(yīng)用尿蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)病例組與對照組比差異有統(tǒng)計學(xué)意義的前兩位尿蛋白為Hp和α2-巨球蛋白。在此隊列研究中，210例估算腎小球濾過率(estimate glomerular filtration rate，eGFR)≥80 mL·min-1·1.73 m-2的2型糖尿病患者，基線尿Hp≥20 ng/min者，有較高的慢性腎功能不全(chronic renal insufficiency，CRI)發(fā)生率。尿Hp和微量白蛋白都低的患者CRI的發(fā)生率僅為3.2%，有微量白蛋白尿的患者CRI的發(fā)生率是9.5%，而尿Hp增高的患者CRI的發(fā)生率是13.3%。CRI發(fā)生率最高的是尿微量白蛋白和Hp均高(22.4%)的患者。該研究顯示尿Hp是一種新的生物標(biāo)志物，可作為尿微量白蛋白的補充，預(yù)測2型糖尿病患者的腎損害。

Bhensdadia等[11]使用液相色譜/質(zhì)譜法分析8例正常白蛋白尿的2型糖尿病患者的尿液以確定預(yù)測腎功能下降的候選標(biāo)志物。進(jìn)一步對30例患者尿液中的7個標(biāo)志物：集聚蛋白(agrin)、Hp、甘露聚糖結(jié)合凝集素-絲氨酸蛋白酶2(mannan-binding lectin serine protease 2，MBLSP-2)、溶酶體膜蛋白2(lysosomal membrane proteins 2，LAMP-2)、AGT、NGAL和尿調(diào)節(jié)素(uromodulin)進(jìn)行驗證，結(jié)果表明Hp是早期腎功能下降的最佳預(yù)測因子。對204例沒有顯著腎臟受損(eGFR≥60 mL·min-1·1.73 m-2，UACR<300 mg/g)的2型糖尿病患者的尿液進(jìn)行了測定，在校正治療組和使用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme，ACEI)后，比較每種指標(biāo)的最高和最低三分位數(shù)，以HCR作為預(yù)測指標(biāo)的早期腎功能下降的OR值為2.70(CI1.15，6.32)，以ACR作為預(yù)測指標(biāo)的OR值為2.50(CI1.14，5.48)。將HCR結(jié)合ACR來預(yù)測早期腎功能下降的模型改善了預(yù)測性能。因此，HCR有助于預(yù)測2型糖尿病患者在發(fā)生大量蛋白尿或減少GFR之前患腎病的風(fēng)險。

Liu等[12]對包括269 例腎功能不進(jìn)展[每年eGFR 0.2(-0.7～1.0)mL·min-1·1.73 m-2]和 153 例腎功能進(jìn)展[每年eGFR -7.1(-10.6～-5.1)mL·min-1·1.73 m-2]的2型糖尿病患者進(jìn)行了前瞻性研究，證明尿Hp可預(yù)測2型糖尿病和早期腎臟疾病患者的腎功能快速下降。以eGFR每年下降≥3 mL·min-1·1.73 m-2為主要終點。基線時，與腎功能無進(jìn)展者相比，進(jìn)展者中尿Hp濃度增加了11倍。與最低四分位的患者相比，Hp第三和第四分位的患者腎功能進(jìn)展OR分別為-2.25(1.11～-4.59)和-5.41(2.63～-11.1)倍，而白蛋白第三和第四分位的患者腎功能進(jìn)展OR為-2.53(1.17～-5.51)和-9.01(4.00～-20.5)倍。Hp明顯增加了蛋白尿的預(yù)測能力，優(yōu)于傳統(tǒng)危險因素。在慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)3期亞群中，尿Hp優(yōu)于白蛋白尿，以預(yù)測腎功能的快速下降。

目前關(guān)于尿Hp的研究不僅局限于DKD，關(guān)于其他腎臟疾病與Hp的關(guān)系也有很多相關(guān)研究。Aggarwal等[28]對88名系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)患者和20例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、20例糖尿病和20例健康人進(jìn)行研究，平均隨訪1.5年，根據(jù)SLE疾病活動指數(shù)(SLE disease activity index，SLEDAI)，患者被分類為活動性腎病(active renal, AR)，活動性非腎病(active nonrenal, ANR)或非活動性疾病(inactive disease, ID)。使用雙向凝膠電泳，通過基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)對尿樣進(jìn)行鑒定并使用酶聯(lián)免疫吸附測定進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示3種尿蛋白α-1抗胰凝乳蛋白酶(alpha-1 anti-chymotrypsin, ACT)、Hp和視黃醇結(jié)合蛋白(retinol binding protein, RBP)是狼瘡性腎炎活動的潛在生物標(biāo)志物。尿HCR在AR組最高，為2.6(0.02～338.5)ng/mg，糖尿病組的HCR為0.55 (0～4.99) ng/mg，雖然低于AR組，但顯著高于ANR組[0.14(0～5.43) ng/mg]、ID組[0.17(0.01～20.62) ng/mg]、類風(fēng)濕組[0.12(0.04～1.37)ng/mg]和健康對照組[0.11(0～0.71)ng/mg]。Zager等[29]比較了16名急性腎功能損傷患者的尿液樣本和正常受試者或來自15名患有慢性腎病的患者的尿液樣本，發(fā)現(xiàn)急性腎功能損傷的患者尿Hp濃度顯著增高。

綜合以上臨床的相關(guān)研究結(jié)果，目前認(rèn)為尿Hp濃度增高與腎臟的急性損傷及活動性炎性反應(yīng)有關(guān)，在糖尿病患者中尿Hp濃度增高可能是早期DKD的生物標(biāo)志物，具有在糖尿病患者中早期預(yù)測腎功能進(jìn)展的臨床價值。

3 Hp與DKD的機制探討

人們曾經(jīng)普遍認(rèn)為DKD患者的主要病變在腎小球，DKD早期主要是腎小球濾過膜(包括腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球基底膜成分和足細(xì)胞)的改變，而近些年關(guān)于DKD中腎小管間質(zhì)的病變也引起研究者的重視。一般認(rèn)為尿中小分子蛋白質(zhì)(相對分子質(zhì)量小于白蛋白)主要來源是通過了正常腎小球過濾屏障并逃脫了腎小管攝取，而較大分子蛋白(相對分子質(zhì)量大于白蛋白)的主要來源是腎小球濾過膜的改變而漏出[4]。但目前關(guān)于Hp研究[29-35]的結(jié)果表明傳統(tǒng)觀點可能夸大了腎小球受損或滲漏的作用，尿Hp的一部分來源可能是腎小管近曲小管上皮細(xì)胞自身合成和分泌。因此，關(guān)于尿Hp可能是早期預(yù)測DKD腎功能進(jìn)展的生物標(biāo)志物的相關(guān)機制的研究目前尚無一致結(jié)論。

目前較多證據(jù)證明尿中Hp來源于腎臟近曲小管細(xì)胞。首先多個動物水平的研究[29-33]證明Hp定位于腎臟近曲小管上皮細(xì)胞。Zager等[29]對6種急性腎功能損傷模型(缺血再灌注、甘油注射、順鉑腎毒性、肌紅蛋白尿、內(nèi)毒素血癥和雙側(cè)輸尿管梗阻)小鼠用免疫組織化學(xué)和分離的近端小管的方法檢測Hp mRNA和蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)近端小管是腎臟Hp增加的主要部位。急性腎功能損傷引起近端小管上皮細(xì)胞Hp基因發(fā)生快速、顯著和持續(xù)的表達(dá)。Hp是腎損傷反應(yīng)的參與者。Hp用于防止血紅蛋白誘導(dǎo)的氧化組織損傷，主要是退化的溶酶體吞噬Hp-Hb復(fù)合物[30]，溶酶體內(nèi)有過量的鐵沉積，并且鐵沉積僅出現(xiàn)在近曲小管上皮細(xì)胞而不出現(xiàn)在腎小球及其組成細(xì)胞或其他管狀或間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)[31]。其次，目前已有研究者[32-33]在糖尿病早期腎病患者腎臟活檢中證實了近端腎小管溶酶體內(nèi)鐵沉積顯著增多，且鐵沉積數(shù)量與患者腎功能下降程度相關(guān)。另外，Zhao等[15]對腎近端小管上皮細(xì)胞系(HK-2細(xì)胞)進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明，即使在靜息狀態(tài)下，HK-2細(xì)胞也表達(dá)包括Hp在內(nèi)的多種血漿蛋白的mRNA。ELISA法檢測合成的蛋白主要分泌到細(xì)胞頂側(cè)。當(dāng)在外源細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6、TNF-α、骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)或轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)存在下培養(yǎng)時， HK-2細(xì)胞血漿蛋白的mRNA表達(dá)受到不同程度的影響,基底膜外側(cè)蛋白分泌量增高?；虮磉_(dá)結(jié)果證明蛋白質(zhì)的翻譯、生物合成和個體血漿的分泌發(fā)生在HK-2細(xì)胞中。 該研究證明腎近端小管上皮細(xì)胞不僅可以重吸收原尿中的血漿蛋白，在正常條件下和急慢性腎病中也可以分泌蛋白質(zhì)，是尿蛋白的來源。上述研究結(jié)果支持尿Hp主要來源于腎近曲小管上皮細(xì)胞合成和分泌的假設(shè)。另外，Aggarwal等[28]的研究結(jié)果證明腎臟疾病患者血清和尿液Hp濃度之間缺乏相關(guān)性，提示尿Hp可能來源于腎臟。除腎小管細(xì)胞合成分泌Hp外，腎小管細(xì)胞損傷還可能導(dǎo)致Hp從管周毛細(xì)血管滲漏到腎小管中。含有Hp的腎小管細(xì)胞損傷脫落到尿液也可能是尿中Hp增高的原因。

另一方面，有關(guān)Hp與DKD患者腎小球病變的研究[32,34-35]也有相關(guān)證據(jù)。糖尿病患者由于血糖濃度的增高通過氧化應(yīng)激致內(nèi)皮功能障礙及出現(xiàn)溶血，從而引起細(xì)胞外Hb濃度升高[36]，游離Hb與Hp結(jié)合形成的Hb-Hp復(fù)合物被清道夫受體CD163內(nèi)吞于巨噬細(xì)胞內(nèi)，并最終被血紅素氧化酶-1分解代謝。此外，在糖尿病患者的腎臟活組織檢查和動物模型研究[37]也顯示異常新血管形成可能參與DKD的發(fā)病機制。而Hp參與包括新生血管形成、內(nèi)皮細(xì)胞增生和分化的生物過程[38]。在慢性炎性反應(yīng)和(或)缺血應(yīng)激中，升高的Hp可刺激組織修復(fù)和側(cè)支血管生長。此外，動脈血流剪切力和氧化應(yīng)激損傷會促進(jìn)Hp大量合成和釋放，進(jìn)而促進(jìn)血管壁內(nèi)皮細(xì)胞遷移和動脈的重建[39]。組織損傷、修復(fù)和微血管重塑預(yù)示著快速腎功能惡化的高風(fēng)險。因此，糖尿病患者血漿Hp濃度明顯增高，由于DKD患者腎小球濾過屏障包括內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接、腎小球基底膜以及腎小球上皮細(xì)胞(足細(xì)胞)發(fā)生病理改變，導(dǎo)致腎小球濾過屏障不穩(wěn)定[34-35]，可能造成Hp及Hb-Hp復(fù)合物通過其屏障[32]。

在通過在線參考數(shù)據(jù)庫Nephromine(www.nephromine.org)發(fā)表的全基因組表達(dá)數(shù)據(jù)分析[40]中，對照組腎小球和腎小管間質(zhì)中均有Hp mRNA表達(dá)，并且在進(jìn)展性DKD患者腎小球和腎小管間質(zhì)中的Hp mRNA表達(dá)均有增加，因此DKD中，Hp在腎臟的代謝可能同時受到腎小球及腎小管的影響。綜上所述，DKD患者尿Hp的來源包括以下幾種可能性：①炎性反應(yīng)或高血糖刺激腎近曲小管上皮細(xì)胞合成及分泌Hp；②腎近曲小管上皮細(xì)胞合成Hp，腎小管細(xì)胞受損后小管細(xì)胞內(nèi)Hp漏出或Hp隨脫落的腎小管細(xì)胞排入尿液中；③高血糖及炎性反應(yīng)導(dǎo)致血Hp濃度增高，腎小球濾過膜不穩(wěn)定，造成Hp漏出。但目前關(guān)于Hp在腎臟代謝的機制尚未明確，需進(jìn)一步深入研究。

4 展望

DKD起病隱匿，一旦進(jìn)入大量蛋白尿期后，進(jìn)展至終末期腎病的速度大約為其他腎臟病變的14倍。早期強化血糖、血壓的控制及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)抑制劑的有效治療可延緩腎功能的進(jìn)展[41]。因此，在糖尿病患者進(jìn)行DKD早期篩查和預(yù)測其進(jìn)展對于能夠早期確定目標(biāo)人群并給予相應(yīng)的干預(yù)措施具有十分重要的臨床意義。目前研究[10-12，28]顯示尿Hp可以在糖尿病早期預(yù)測DKD發(fā)生發(fā)展，可能可以成為DKD早期診斷的生物標(biāo)志物。這一結(jié)論尚需更多更大規(guī)模的樣本研究來驗證。Hp在DKD患者中在腎臟病變進(jìn)展中的作用和機制也需要進(jìn)一步探索。