高博鈺，楊小波，李英英，李東海，張 麗，宋佳昱

(海南大學 生命科學與藥學院， ?？?570228)

地衣是真菌與藻類經(jīng)過長期演化而形成的共生聯(lián)合體，是生物多樣性的重要組成部分[1]。能與藻共生形成地衣的特殊真菌稱為地衣化真菌(lichenized fungi)[2]，其中真菌形態(tài)決定了地衣的形態(tài)特征。地衣的生長基物非常廣泛，人們常把生長在樹木上的地衣稱為樹生地衣[3]。樹生地衣又分為樹干地衣和樹冠地衣。在寒冷地區(qū)的森林里，以大型的枝、葉狀地衣為主，雖然種類較少，但個體的量相對較多；在熱帶、亞熱帶的森林里，常見的地衣多為殼狀地衣，雖然種類豐富，但個體的量相對較少[4]，而且在不同地區(qū)或同一地區(qū)不同海拔或不同森林類型中，種類也有較大的差別。鐵軍等[5]的研究結果表明，在神農(nóng)架千家坪川金絲猴棲息地的森林中，海拔1 850～2 000 m間的樹干地衣物種多樣性最高；艾尼瓦爾·吐米爾等的研究結果表明，在阿勒泰東部山區(qū)森林中，樹干地衣種類豐富度最大的海拔范圍在1 650～1 800 m之間[6]。樹皮的理化性質也能影響地衣的豐富度，BATES等[7]的研究結果表明，英格蘭西南部沿海地區(qū)樹干地衣分布偏好性主要由樹皮酸度決定?？偠灾?，森林中樹干地衣的分布和群落組成與濕度、郁閉度、光照強度和海拔高度[5-6,8-12]等諸多環(huán)境因素有關，也與森林樹木的年齡和樹皮的理化性質等宿主因素有關[5-7,9-11,13-18]。因此，仍需要更多的研究案例，從不同角度來解釋地衣與各項因素間錯綜復雜的關系。筆者在海南東北部沿海低丘陵地區(qū)的銅鼓嶺，選擇同一坡向、同一海拔的自然森林樣地，通過定位采樣采集森林群落重要值較大的前20個樹種的樹干地衣，并通過真菌DNA條形碼技術對地衣進行物種鑒定，旨在了解以銅鼓嶺為代表的熱帶濱海森林樹干地衣的種類組成、水平分布特點以及它們與宿主種類、宿主樹干高度之間的相互關系，為全面了解森林群落樹干地衣多樣性的形成機制及其與生境或宿主之間的相互作用等研究提供參考。

1 研究區(qū)概況與研究方法

1.1 研究區(qū)概況銅鼓嶺國家級自然保護區(qū)地處海南島東北部文昌市境內(nèi)的濱海低丘陵基巖海岸地帶[19]，位于19°37′20″～19°41′10″N，111°00′00″～111°02′30″E之間，處熱帶北緣地區(qū)。保護區(qū)內(nèi)有18座山峰，主峰海拔338 m[20]，保護區(qū)面積1 050 hm2，其中核心區(qū)面積500 hm2。由于受熱帶季風性氣候和熱帶海洋性氣候的雙重影響，保護區(qū)云霧多，風速大(月平均風速為8～10 m·s-1)的氣候特點；年均氣溫23～24 ℃，年均降水量1 721.6 mm，年均蒸發(fā)量1 872.7 mm，全年日照時數(shù)2 137 h[19]。

銅鼓嶺山地坡度大多陡峭，土壤以磚紅壤為主，土層淺薄，土壤發(fā)育程度低[19-21]；分布有熱帶濱海森林(喬木林和灌木林)和海岸草叢等自然植被，其中，熱帶濱海森林為該保護區(qū)的主要植被類型，也是保護區(qū)的重點保護對象之一。該森林群落內(nèi)部物種豐富，多數(shù)植株胸徑和高度都較小，分層不明顯，因此也被稱為“矮林”[22]。

1.2 樣品采集在銅鼓嶺向海側坡面的森林中，建立160 m×160 m的固定樣地，將大樣地劃分為64個20 m×20 m的小樣方(圖1)，選擇了大樣地內(nèi)重要值較大的前20個樹種的樹干地衣為對象(重要值前20的立木株數(shù)占據(jù)了95.9 %)，樣地內(nèi)森林群落樹木組成重要值計算結果見表1。樹干地衣的取樣位置集中于樹干距地面0～2.0 m的位置。將采集到的地衣分裝在干凈的封口袋，記錄編號、采集地點的坐標、海拔數(shù)據(jù)。帶回實驗室共217份樣品，將樣品存放于-80 ℃的冰箱內(nèi)，作為后期分子檢測的材料。

表1 銅鼓嶺熱帶基巖海岸丘陵森林前20個群落物種的重要值

1.3 主要儀器和試劑儀器：超低溫冰箱(NBS公司)、冰箱(海爾)、制冰機(GRANT)、電子天秤(奧豪斯)、HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)、5415R冷凍離心機(德國Eppendorf)、生化培養(yǎng)箱MP-160B型(上海?，攲嶒炘O備有限公司)、梯度PCR擴增儀(Biometra)、電泳儀DYY-11型(北京市六一儀器廠)、電泳槽(BAYGENE)、凝膠成像儀(GAS740Ⅸ)、超凈工作臺BCM-1300A型(蘇州安泰空氣技術有限公司)、滅菌器(日本HIRAYAMA)等。

試劑：CTAB緩沖液、10×TAE緩沖液、TaqDNA聚合酶、DNTP、10×TaqBuffer、D2000 DNA Ladder、X-gal(200 g·L-1)、IPTG(500 mmol·L-1)、胰蛋白胨、瓊脂糖均購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司，其他：液氮、β-疏基乙醇(>98%)、氯仿-異戊醇(V氯仿︰V異戊醇=24︰1)等。

1.4 地衣內(nèi)生真菌檢測

1.4.1 DNA提取利用改良CTAB方法提取地衣內(nèi)生真菌的DNA，從超低溫水箱取約0.1 g地衣樣品，迅速在經(jīng)預冷的研缽中加入適量液氮進行研磨，研磨成粉狀后加1 mL 2×CTAB提取液，經(jīng)水浴、抽提、漂洗等環(huán)節(jié)得到DNA樣品。具體步驟見文獻[23]。

1.4.2 ITS擴增采用PCR法擴增真菌的內(nèi)轉錄間隔區(qū)，擴增引物為ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。每25 μL PCR反應體系分別含有1 μL模板DNA，0.5 μL(2.5 mmol·L-1)dNTPs，2.5 μL 10×PCR緩沖液(Takara，Otsu，Japan)，ITS1F與ITS4引物各0.5 μL(10 μmol·L-1)，0.5 μLTaqDNA聚合酶(Takara，Otsu，Japan)，2 μL BSA溶液。PCR反應程序： 94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 55 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將ITS-PCR產(chǎn)物在w=1 %的瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像儀觀察、拍照。

1.4.3 PCR產(chǎn)物克隆及測序根據(jù)電泳結果選取條帶單一、明亮清晰的PCR產(chǎn)物進行割膠回收，割膠回收試劑盒選取TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA extraction Kit Ver.4.0，將回收的PCR產(chǎn)物作為外源DNA，克隆到pMD19-T Vector (Takara，Otsu，Japan)，在16 ℃下連接1過夜，用E.coliDH5α感受態(tài)細胞(Takara，Otsu，Japan)轉化。利用藍白斑法，篩選出生長良好的陽性克隆，用引物ITS1F和ITS4擴增；PCR產(chǎn)物在w=1 %的瓊脂糖凝膠上電泳檢測。電泳檢測呈陽性的PCR產(chǎn)物委托北京諾賽基因進行測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析對測序公司返回的測序結果進行處理和修正，用BioEdit建立本地數(shù)據(jù)庫，把比對結果的相似性≥97%的序列視為同一物種，劃分OTU(operational taxonomic unit, OTU)。把劃分好的序列在NCBI中的GenBank數(shù)據(jù)庫序列進行檢索，選出地衣型真菌和與其同源性較高的參考序列，通過MEGA6.06共同構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 地衣內(nèi)生真菌的種類組成與發(fā)育樹檢測結果可以劃分為31個OTUs(以后統(tǒng)稱為物種)，又可以劃分擔子菌門和子囊菌門2個大類，其中，8種隸屬于擔子菌門(圖2)，23種隸屬于子囊菌門(圖3)。

圖2 擔子菌門內(nèi)生真菌進化樹

圖3 子囊菌門內(nèi)生真菌進化樹

2.2 地衣型真菌群落物種的水平空間分布擔子菌門地衣內(nèi)生菌的地衣宿主有9種，分別為鴨腳木、方枝蒲桃、異株木犀欖、白茶、海南大風子、子凌蒲桃、粗毛野桐、輪葉木姜子和糙果油茶，分布的樣地有12個(圖4)，分別為P00-1，P04-14，P11-2，P22-3，P25-12，P33-4，P52-17，P55-6，P61-18，P66-7，P74-20和P77-8。

子囊菌門地衣內(nèi)生菌的地衣宿主有14種，分別為：鴨腳木、方枝蒲桃、異株木犀欖、瓊刺欖、白茶、濱木患、海南大風子、赤楠蒲桃、粗毛野桐、假蘋婆、黃椿木姜、拱脈核果木、肖蒲桃和毛茶。分布的樣地有18個(圖4)，分別為P00-1，P07-10，P11-2，P16-11，P22-3，P25-12，P33-4，P34-13，P47-9，P40-15，P43-16，P44-5，P55-6，P61-18，P66-7，P70-19，P74-20和P77-8。

本實驗共檢測到26種地衣型真菌，每種地衣在樣地內(nèi)的分布狀況如表2所示。

表2 20個樣方中檢測到的26種地衣型真菌的分布狀況

注：樣地從右上角起，從上至下從左到右分別指代為1～20號，如1號代表P00-1，2號代表P4-14，4號代表P11-2。依此類推，“1”代表地衣在樣地內(nèi)有分布，“0”代表無分布

Note: Quadrats from top to bottom and from left to right at the right corner refer to No. 1-20. For example, No. 1 refers to P00-1, No. 2 refers to P4-14, No. 4 refers to P11-2. The rest can be deduced as such.“1” means that lichens are distributed in the quadrats, and “0” means no distribution

由圖4所示，樣地色塊顏色越深，說明地衣越豐富，樹干地衣在樣地的分布基本均勻且廣泛。由表2可知，大多數(shù)樣方普遍出現(xiàn)6～12種，19號樣方中僅出現(xiàn)了1種，7號樣方中出現(xiàn)了18種。較為普遍的情況是每種地衣可以在4～7個樣方中找到，OTU1出現(xiàn)最頻繁，在15個樣方中出現(xiàn)。總體來看，地衣型真菌在銅鼓嶺大型樣地的分布在空間中是隨機的、沒有明顯的規(guī)律，或者說它們的群落組成并不集中。

2.3 地衣內(nèi)生真菌群落物種組成與宿主的關系從表1和表3中可知，在銅鼓嶺重要值前20的樹種中，只有17種有地衣附生，在重要值大小排序為第4的貢甲、第8的假赤楠蒲桃和第15的九節(jié)的樹干(0～2.0 m)上未采集到地衣。海南大風子(重要值第9、相對密度第5、相對頻度第6、相對顯著度第14、個體數(shù)第5，下同)的樹干地衣豐富度最大，白茶(6，3，3，13，3)次之，方枝蒲桃(2，1，1，5，1)排第3，肖蒲桃(18，19，20，9，18)排第4，而瓊刺欖(5，4，2，13，4)，輪葉木姜子(13，8，9，20，8)，赤楠蒲桃(10，13，12，6，13)，子凌蒲桃(11，17，14，7，12)的樹干地衣豐富度最小，分別都僅出現(xiàn)1種。因此，初步認為樹干地衣豐富度與宿主在群落中的重要值、相對密度、相對頻度、相對顯著度及個體數(shù)關系不大，而可能是與宿主本身形成較復雜的關系，有待深入研究。

綜合分析表3和表4可知，子囊菌門的地衣內(nèi)生真菌分布較多且宿主較廣泛，分布范圍沒有明顯的規(guī)律，有8種是廣泛分布的，13種是專一分布的；擔子菌門的地衣內(nèi)生真菌分布較少且宿主較少，分布范圍沒有明顯的規(guī)律，其中，有2種僅從鴨腳木樹干上的地衣分離出來，1種僅從糙果油茶樹干上的地衣分離出來，1種僅從方枝蒲桃樹干上的地衣分離出來。因此，無論是子囊菌門的樹干地衣還是擔子菌門的樹干地衣都可能具有專一分布性，對宿主的喜好或許與宿主的樹皮綜合性質有關，還有待進一步通過實驗驗證。

表3 20種宿主中檢測到的地衣內(nèi)生真菌的的分布狀況

表4 宿主中檢測到的地衣內(nèi)生真菌的物種組成及分布狀況

3 討 論

3.1 海南熱帶濱海森林地衣內(nèi)生真菌的種類組成與豐富度在銅鼓嶺地衣調(diào)查的記載中，只有根據(jù)形態(tài)學辨別判斷為象形霜盤衣(Diorygmahieroglyphicum)[27-29]的相關記錄，本次調(diào)查豐富了銅鼓嶺保護區(qū)樹干地衣的記錄。

森林類型、環(huán)境條件不同，造成森林樹干地衣的物種組成與豐富度的差異，如在澳大利亞塔斯馬尼亞島西部的雨林中，從1株伐倒的淚柏(Lagarostrobosfranklinii)上就采集到多達76種的地衣[25]；泰國北部調(diào)查到的樹干地衣在山地栲類林中有107種、季節(jié)性常綠林中有86種、干旱龍腦香林中有62種[26]，鐵軍等[5]在神農(nóng)架千家坪落葉闊葉林和針葉混交林調(diào)查到52種地衣，均高于銅鼓嶺自然保護區(qū)固定樣地所調(diào)查的樹干地衣豐富度。HAUCK等[30]在德國哈爾茨山50株挪威云杉(Piceaabies)樹干處收集到21種地衣，略低于銅鼓嶺。李蘇等[24]對云南哀牢山地區(qū)的亞熱帶山地濕性常綠闊葉林開展的相關研究中，找到5種樹干地衣，低于銅鼓嶺。銅鼓嶺地衣的種類組成與豐富度可能與其獨特地理位置、氣候環(huán)境等因素有關，也與研究方法、技術水平、實驗條件等因素有關，仍需進一步探索。

3.2 海南熱帶濱海森林地衣的種類的分布特點

3.2.1 熱帶森林中樹干地衣分布與宿主在群落中的地位的關系本研究結果表明，樹干地衣最多的是海南大風子，最少的是子凌蒲桃等4個種，地衣的分布與宿主在群落中的重要值、個體數(shù)、相對密度、相對頻度及相對顯著度關系不大，即與其宿主在群落中的地位關系不大。

有研究發(fā)現(xiàn)，在優(yōu)勢種相對單一的受溫帶大陸性季風氣候影響的溫帶森林中，地衣的分布與優(yōu)勢種沒有必然聯(lián)系。陳健斌等[11]在對北京東靈山小龍門地區(qū)樹干地衣的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，以華北落葉松(Larixprincipisrupprechtii)為優(yōu)勢種的落葉松林中華北落葉松樹干上未見到樹干地衣，人工油松林中油松(Pinustabuliformis)上地衣覆蓋度在10%以下；在優(yōu)勢種相對于熱帶森林較顯著的亞熱帶森林中，樹干地衣主要集中分布在優(yōu)勢度較大的幾種樹木上，如LOPPI等[31]在意大利中部森林研究群落中3種優(yōu)勢樹種苦櫟(Quercuscerris)、冬青櫟(Quercus.ilex)、歐洲水青岡(Fagussylvatica)樹干地衣數(shù)量最多，神農(nóng)架地區(qū)的次生針闊混交林樹干地衣及分布的研究中，10種優(yōu)勢樹種均有地衣附生[13]。從樹干地衣和其附生的樹木種類來看，地衣的分布與宿主本身有一定的關系，在亞熱帶森林中，優(yōu)勢樹種相對熱帶森林較顯著，優(yōu)勢樹種種類相對較少，個體數(shù)量相對較多，其他樹種多呈零星分布，樹干地衣自然分布在少數(shù)幾種優(yōu)勢樹種樹干上；然而在熱帶地區(qū)多優(yōu)群落的森林中，優(yōu)勢物種多且彼此之間差距極小，樹干地衣的分布與宿主在群落中的地位無明顯關系。筆者發(fā)現(xiàn)，地衣的附生和分布情況與其對宿主本身的偏好有關，例如宿主樹皮的理化性質，元素含量，宿主的樹齡等，這還有待于進一步的探索。

3.2.2 樹干地衣在宿主樹干上的分部高度李蘇等[24]在云南哀牢山地區(qū)的熱帶季雨林原生林中獲得附生于0～2.0 m的樹干地衣5種。楊林等[13]對神農(nóng)架地區(qū)的次生針闊混交林樹干1.3 m處共獲得樹干地衣51種。LOPPI S等[31]在意大利中部森林的3種優(yōu)勢樹種苦櫟、冬青櫟、歐洲水青岡的樹干(1.2～1.7 m處)，分別發(fā)現(xiàn)了36，18，20種樹干地衣。本研究結果表明，銅鼓嶺樹干地衣優(yōu)先分布在0.6～1.4 m的樹干上，且物種數(shù)量相對于其他地區(qū)較少。同時，樹干上還有其他附生生物，地衣的競爭優(yōu)勢和生態(tài)位可能是決定地衣優(yōu)先分布高度的重要原因[32]。

3.2.3 銅鼓嶺樹干地衣海拔分布規(guī)律當前的樹干地衣研究多針對海拔高度進行比較[6，9-11]，如艾尼瓦爾[9]發(fā)現(xiàn)，地衣的分布規(guī)律成曲線分布，在800～1 100 m發(fā)生量穩(wěn)定，在海拔1 100～1 850 m范圍內(nèi)逐漸增多，于1 650～1 800 m達到最高，然后又隨著海拔升高地衣發(fā)生量逐漸下降；艾尼瓦爾在對阿勒泰東部山區(qū)的調(diào)查中，也得到相似結論[6]；姜山[10]在貴州的地衣調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，高海拔的分布多于低海拔；但是，在北京東靈山地衣的發(fā)生量卻隨海拔的升高而顯著增加[11]。

目前，地衣水平分布規(guī)律的研究相對較少。銅鼓嶺固定樣地的地勢有利于探索樹干地衣的水平分布特點。本研究結果說明，樹干地衣的分布格局隨其偏好的宿主的分布而分布，在本研究設計選擇的樣方內(nèi)，地衣宿主多呈隨機分布，因此，地衣在森林群落中的水平分布是隨機的。RUSSELL[33]測定了不同海拔森林內(nèi)濕度的日變化，認為影響樹干地衣垂直分布規(guī)律的重要因素是空氣相對濕度，銅鼓嶺樹干地衣分布隨機無明顯規(guī)律的原因可能與空氣相對濕度有關，仍需進一步研究。

本次調(diào)查豐富了銅鼓嶺的樹干地衣記錄，樹干地衣由歷史記錄中的1種豐富至26種，遺憾的是，由于實驗條件的限制，采樣過程中地衣物種的遺漏、鑒定過程中的困難以及銅鼓嶺地區(qū)地衣名錄的缺乏，還需進一步的研究才能全面地了解銅鼓嶺樹干地衣的分布與組成；銅鼓嶺熱帶濱海森林大型樣地內(nèi)，地衣在同一個海拔高度水平里，呈隨機分布的狀態(tài)；當樹干地衣取樣高度在2.0 m以下時，樹干地衣主要分布高度為0.6～1.4 m，由于條件所限，筆者無法調(diào)查林冠層附生地衣的分布和組成，今后還有待進一步研究樹干地衣在單株樹木上的分布規(guī)律。本調(diào)查結果表明，在熱帶多優(yōu)群落的森林中，樹干地衣豐富度及其分布與宿主在群落中的生態(tài)地位無關，這一點需要在熱帶地區(qū)更多不同的森林類型和環(huán)境中進一步研究證實。