賴瑞強 李榮華 夏巖石 郭培國 袁清華 趙偉才 張振臣

摘 ?要：選用“粵煙98”ד118-3”構(gòu)建的133份F7代單粒傳重組自交系（RIL）群體和94份煙草種質(zhì)組成的自然群體作為研究材料，運用253個SSR和293個InDel標(biāo)記對這些材料進行基因分型，并針對煙草青枯病抗性開展連鎖和連鎖不平衡聯(lián)合作圖分析。結(jié)果顯示，基于RIL群體的連鎖分析在4個環(huán)境中共發(fā)現(xiàn)4個解釋率介于12.00% ～ 30.10%之間的QTLs，利用自然群體的關(guān)聯(lián)分析在3個環(huán)境中發(fā)現(xiàn)解釋率在8.78%～11.42%之間的8個單倍型與抗病性密切相關(guān)，利用RIL群體和自然群體開展的連鎖-連鎖不平衡的整合作圖分析發(fā)現(xiàn)8個解釋率介于4.95%～6.93%之間的單倍型與抗病性密切相關(guān)。兩種或以上分析方法均探測到與煙草青枯病抗性密切相關(guān)的單倍型有4個，分別為具正表型效應(yīng)的Hap227和Hap368及負表型效應(yīng)的Hap289和Hap370。所得結(jié)果表明連鎖和連鎖不平衡聯(lián)合作圖策略能較準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)與煙草青枯病抗性相關(guān)的QTLs，該結(jié)果可為煙草青枯病抗性相關(guān)研究及后續(xù)煙草青枯病抗性材料的輔助篩選提供參考。

關(guān)鍵詞：煙草;青枯病抗性;連鎖分析;關(guān)聯(lián)分析;連鎖和連鎖不平衡聯(lián)合作圖

中圖分類號：S572.03 ?????????文章編號：1007-5119（2019）06-0001-10 ?????DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.06.001

Dissection of Genetic Variations for Tobacco Bacterial Wilt Resistance Based on Joint Linkage and Linkage Disequilibrium Mapping

LAI Ruiqiang¹， LI Ronghua¹， XIA Yanshi¹， GUO Peiguo^1*， YUAN Qinghua²，

ZHAO Weicai³， ZHANG Zhenchen²

（1. School of Life Sciences， Guangzhou University， Guangzhou 510006， China; 2. Guangdong Academy of Agricultural Sciences Institute of Crops， Guangzhou 510643， China; 3. Guangdong Tobacco Nanxiong Research Institute， Nanxiong， Guangdong 512400， China）

Abstract：A population with 133 F7 recombinant inbred lines （RIL） derived from the cross of “Yueyan 98” × “118-3” and a natural population with 94 tobacco accessions were used?as materials， and joint linkage and linkage disequilibrium （LD） mapping analysis for tobacco bacterial wilt （TBW） resistance was?carried out by using 253 SSR and 293 InDel markers. Four QTLs with 12%-30.10% of the explanation rate were detected by linkage analysis of the RIL population in four environments; and 8 haplotypes were found to be closely related to TBW resistance in three environments and explained 8.78%-11.42% of phenotypic variation by LD mapping with natural population. The integrated linkage-LD mapping of the RIL and natural populations was carried out and 8 haplotypes were detected to be closely associated with TBW resistance and explained 4.95%-6.93% of phenotypic variation. Four haplotypes were found to be associated with TBW resistance in at least two of the three analytical methods，?two （Hap227?and?Hap370） of them are with positive phenotypic effect， and the other two （Hap289， Hap368）?are with negative effect.?The results indicate that the strategy of joint linkage-LD mapping could accurately detect QTLs related to TBW resistance， and these haplotypes could provide reference for TBW resistance research and screening of TBW resistance materials.

Keywords：tobacco; bacterial wilt resistance; linkage analysis; association analysis; joint linkage and linkage disequilibrium mapping

煙草生長期間常常遭受到青枯病的危害，導(dǎo)致煙草減產(chǎn)和品質(zhì)變劣^[1]，種植抗青枯病煙草品種是減少該病危害的有效途徑，而挖掘出與青枯病抗性相關(guān)的分子標(biāo)記用于輔助抗病材料的篩選，可加速青枯病抗病品種的選育進程。

選用家系群體開展連鎖作圖的QTL定位分析和利用自然群體開展的連鎖不平衡作圖分析是目前挖掘煙草青枯病抗病性狀相關(guān)分子標(biāo)記的兩種有效方法。NISHI等^[2]通過DH系群體構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，首次對煙草青枯病抗性進行QTL定位，并發(fā)現(xiàn)1個與青枯病抗病性相關(guān)的QTL;隨后，多位研究者通過構(gòu)建遺傳連鎖圖譜研究煙草青枯病抗性遺傳，發(fā)現(xiàn)多個與青枯病抗病相關(guān)的QTLs^[1，3-5];雖然這些利用連鎖作圖的QTL定位分析方法在研究青枯病抗性遺傳方面已取得了一些成績，但由于連鎖分析是利用兩個親本所構(gòu)建群體材料進行的研究，所涉及的僅限于同一基因座上的兩個等位基因，研究的遺傳背景較狹窄，且由于分離群體雜交或自交的次數(shù)有限，導(dǎo)致重組的次數(shù)較少，所以作圖精度較低、分辨率較差^[6-7]。而關(guān)聯(lián)分析能克服連鎖分析的這一缺點，它通過選用遺傳背景差異大的種質(zhì)即自然群體作為研究對象，不需構(gòu)建作圖群體，所花費的時間短、精力少^[8]，涵蓋的遺傳背景大，且利用了種質(zhì)材料中多世代的重組事件，因此具有較高的分辨率^[6]。目前，已有利用該方法對煙草青枯病抗性進行研究的報道^[9-10]。但關(guān)聯(lián)分析同樣存在局限性，如對遺傳多樣性較低的群體其作圖效果不如連鎖分析，且關(guān)聯(lián)分析不能確定QTL的具體位置及其加性效應(yīng);另外，關(guān)聯(lián)分析不僅對稀有等位基因變異的發(fā)現(xiàn)能力較低，而且容易出現(xiàn)假陽性^[11];而連鎖分析能克服關(guān)聯(lián)分析存在的這些不足^[12]。所以，連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析兩種方法相結(jié)合的分析策略，可以揚長避短，提高目標(biāo)性狀QTL定位的準(zhǔn)確性和精度^[11，13]。基于連鎖與連鎖不平衡作圖聯(lián)合分析的方法已經(jīng)在楊樹^[14]、水稻^[15]和玉米^[16]等植物中開展，且取得了不少成績，但未見利用這種方法挖掘煙草青枯病抗性相關(guān)分子標(biāo)記的報道。

據(jù)此，本研究選用“粵煙98”ד118-3”構(gòu)建的133份單粒傳重組自交系（RIL）和含有94份煙草種質(zhì)的自然群體作材料，對這些材料的青枯病病情指數(shù)進行連鎖與連鎖不平衡聯(lián)合作圖分析。通過構(gòu)建連鎖圖譜的QTL定位和連鎖不平衡作圖平行及整合作圖分析，挖掘出與煙草青枯病抗性相關(guān)的分子標(biāo)記，為分子標(biāo)記輔助選擇煙草青枯病抗性材料奠定理論基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

133份F7代單粒傳重組自交系（RIL）由“粵煙98”（母本）ד118-3”（父本）衍生而來，其中“118-3”為高抗青枯病材料^[10]，而“粵煙98”為感病材料。94份煙草種質(zhì)涵蓋烤煙、雪茄煙、曬煙和白肋煙4種類型，來源地包括美國、日本、加拿大、索馬里、澳大利亞、津巴布韋以及中國^[10，17]。以上兩個群體均由廣東省煙草南雄科學(xué)研究所提供。

1.2 ?試驗設(shè)計

2015年2月26日和2018年3月6日將供試材料的煙苗移栽至廣東省煙草南雄科學(xué)研究所試驗田，株距0.5 m，行距1.2 m，每份材料種植20株，田間管理按當(dāng)?shù)厣a(chǎn)實際。以“巖煙97”和“紅花大金元”分別作為抗病和感病對照。其中，RIL群體兩年包括4個種植環(huán)境（E1～E4）;自然群體兩年包括3個種植環(huán)境（Ea～Ec）。此外，2015年的RIL群體（E1）和自然群體（Ea），2018年的RIL群體（E3）和自然群體（Eb）均種植于同一塊試驗田，環(huán)境變量一致，表型差異主要來源于材料的抗性差異，而環(huán)境代號不一致（如E1和Ea）僅為區(qū)分RIL群體和自然群體而設(shè)定。

1.3??青枯病病情調(diào)查

2015年5月4日和2018年5月6日按申莉莉^[18]的方法使用致病小種1/生化型III的青枯病菌（Ralstonia solanacoarum）對處于旺長期的煙草進行莖部穿刺接種。于2015年6月6日和2018年6月5日進行病情等級調(diào)查，此時“紅花大金元”的病情指數(shù)均接近100，調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)參照GB/T 23222—2008 煙草病蟲害分級及調(diào)查方法。并根據(jù)煙草病害等級計算病情指數(shù)（病指，Disease index，DI）^[19]，

用于后續(xù)的連鎖/關(guān)聯(lián)分析。

病指=∑（各級病株數(shù)×該病級值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級值）×100

1.4 ?DNA提取及基因分型

采取煙草新鮮葉片，使用李榮華等^[20]改良的CTAB法進行DNA提取，并檢測DNA的質(zhì)量及濃度，隨后將其稀釋至20 ng/L，作為PCR擴增模板。

利用已報道的煙草SSR標(biāo)記^[21-25]及本實驗室利用“118-3”和“粵煙98”進行RAD-seq（Restriction-site associated DNA sequence）開發(fā)的SSR和InDel標(biāo)記，從中篩選出在“巖煙97”、“紅花大金元”、“118-3”和“粵煙98”4份材料中擴增條帶清晰易辨、特異性良好且具有多態(tài)性標(biāo)記546個（其中SSR標(biāo)記253個、InDel標(biāo)記293個），用于群體基因分型。

SSR及InDel標(biāo)記擴增的PCR反應(yīng)體系及擴增程序詳見文獻[10]。采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染法^[26]檢測PCR擴增產(chǎn)物，最后使用BenQ M800掃描儀掃描凝膠電泳圖譜，通過GelBuddy軟件^[27]判讀凝膠電泳圖譜中的條帶，根據(jù)條帶的有無，確定等位變異位點，并構(gòu)建1、0二元數(shù)據(jù)矩陣，完成群體基因分型。所用試劑均購自于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.5 ?數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 19.0對煙草青枯病病指進行統(tǒng)計分析，包括平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)及方差分析等;參考劉凱等^[28]的方法計算廣義遺傳力。

1.6 ?遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建和QTL定位

根據(jù)RIL群體基因分型數(shù)據(jù)，將與“118-3”相同的帶型記為“A”，與“粵煙98”相同的帶型記為“B”制成數(shù)據(jù)矩陣，并應(yīng)用JoinMap 3.0軟件構(gòu)建煙草遺傳連鎖圖譜，設(shè)置LOD≥3.0，重組率=0.4，選用Kosambi函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)換為圖距單位（cM）并設(shè)置錯誤檢測水平為1%。連鎖群命名及順序參考BINDLER等^[21-22]的“LG+數(shù)字”命名方式和順序;如果在圖譜的構(gòu)建過程中，少數(shù)連鎖群因標(biāo)記間遺傳距離過大出現(xiàn)連鎖群斷點，但與BINDLER等^[21-22]所建連鎖群的標(biāo)記相比仍屬于同一連鎖群時，則記為該連鎖群A或B。

利用MapQTL 5.0軟件進行QTL定位。首先，設(shè)置置換測驗（Permutation Test）為1000，并在α=0.05的水平上預(yù)估每個連鎖群的LOD閾值^[29]，結(jié)果以LOD≥2.6作為判斷QTL存在的標(biāo)準(zhǔn);然后，設(shè)置掃描各個連鎖群的步移速度為1 cM，并進行區(qū)間作圖（Interval mapping， IM），檢測QTL的置信區(qū)間、加性效應(yīng)及解釋率。以LOD最高峰值的位置作為QTL的位置，而與之最近的左右標(biāo)記分別稱為左翼標(biāo)記和右翼標(biāo)記。

1.7 ?單倍型的構(gòu)建及關(guān)聯(lián)分析

分別利用Haploview軟件^[30]、SPAGeDi1.3d軟件^[31]和Structure 2.3軟件進行單倍型構(gòu)建、煙草材料間的親緣系數(shù)分析和群體結(jié)構(gòu)分析，而參數(shù)設(shè)置和數(shù)據(jù)處理方式均按賴瑞強等^[10]的方法。隨后，利用TASSEL軟件中的混合線性模型（Mixed Linear Model，MLM）進行青枯病病情指數(shù)的關(guān)聯(lián)分析。最后，采用BENJAMINI等^[32]的方法，對p<0.01的顯著關(guān)聯(lián)單倍型進行控制錯誤發(fā)生率（False discovery rat，F(xiàn)DR）的假陽性驗證;當(dāng)FDR值也小于0.01時，表明對應(yīng)的關(guān)聯(lián)單倍型可靠性更高。

1.8 ?連鎖與連鎖不平衡聯(lián)合作圖及表型效應(yīng)分析

依據(jù)LU等^[33]連鎖與連鎖不平衡聯(lián)合作圖的分析方法。對連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果進行比較，開展連鎖與連鎖不平衡平行作圖分析;整合作圖分析則是利用共同的標(biāo)記位點將133份RIL群體及親本和94份自然群體整合為一個群體（含材料數(shù)228份），進行關(guān)聯(lián)分析;其中，228份材料，前94個號（1～94）對應(yīng)94份煙草種質(zhì)的編號，后133個號（95～227）對應(yīng)RIL群體的株系編號（1～133），而“粵煙98”的編號為228。

依據(jù)ZHANG等^[34]的方法進行表型效應(yīng)值計算。具體計算公式如下：

A_i=∑X_ij/n_i-∑N_k/nk

式中，A_i代表第_i個單倍型的表型效應(yīng)值，X_ij為攜帶第_i個單倍型的第_j個材料表型的測定值，n_i

則為具有第_i個單倍型的材料數(shù);∑N_k/n_k代表所有材料表型測定值的平均值。

2??結(jié) ?果

2.1 ?煙草青枯病病情指數(shù)

RIL群體和自然群體的青枯病病情指數(shù)鑒定結(jié)果如表1。RIL群體中，“118-3”的病情指數(shù)均明顯低于“粵煙98”，表明親本間的青枯病抗性差異大;其中，除了E4，E1～E3的病情指數(shù)偏度和峰度絕對值均小于1，符合正態(tài)分布的特點，且病情指數(shù)變異系數(shù)介于30.73%～94.49%，平均為63.14%，變異系數(shù)大，表明該性狀的改良潛力大。而自然群體中，環(huán)境Ea中的病情指數(shù)變異系數(shù)為36.75%，其偏度和峰度的絕對值均小于1，符合正態(tài)分布的特征;而在環(huán)境Eb和Ec中變異系數(shù)和偏度均大于1，表明在這兩個環(huán)境中材料表現(xiàn)出的抗性差異較大。

對同一環(huán)境下的RIL群體各株系間和自然群體各種質(zhì)間的青枯病病情指數(shù)進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)其F值介于1.69～16.91之間，且均達到極顯著水平，表明在同一環(huán)境中兩個作圖群體的各材料間的青枯病抗性存在顯著差異;此外，兩個群體的青枯病病情指數(shù)的廣義遺傳率均超過60%，表明基因?qū)υ撔誀钜泊嬖谳^大的影響。因此，煙草材料間的青枯病病情指數(shù)差異明顯，有利于進行QTL定位/關(guān)聯(lián)分析。

2.2??連鎖圖譜的構(gòu)建及青枯病抗性的QTL定位

利用546個標(biāo)記對RIL群體進行基因分型，共發(fā)現(xiàn)1043個變異位點;利用這些變異位點數(shù)據(jù)進行連鎖作圖分析，構(gòu)建了一張包括24個連鎖群的遺傳圖譜。該圖譜包含463個標(biāo)記，占總標(biāo)記數(shù)的84.62%，覆蓋基因組總長度為1230.72 cM，兩標(biāo)記間的平均遺傳距離為2.66 cM。

基于該遺傳圖譜，對RIL群體2015年和2018年的青枯病病情指數(shù)進行QTL定位。兩年間共發(fā)現(xiàn)qTBWR-6-E4、qTBWR-11-E3、qTBWR-17-E1和qTBWR-18-E2等4個QTLs（圖1，表2），這些QTLs分別位于LG6、LG11、LG17和LG18上，貢獻率介于12%～30.10%之間;其中qTBWR-17-E1的加性效應(yīng)為負值，表明此效應(yīng)來自抗性親本“118-3”，可能關(guān)聯(lián)到抗病的等位基因;其余3個QTL的加性效應(yīng)為正值，表明此加性效應(yīng)來源于感病親本“粵煙98”，可能關(guān)聯(lián)到與青枯病感病相關(guān)的等位基因。

2.3??連鎖不平衡分析和單倍型構(gòu)建

R²值是衡量兩個位點連鎖不平衡程度的重要指標(biāo)，與關(guān)聯(lián)分析的效力有關(guān)^[35]。因此，對利用546個分子標(biāo)記對94份自然群體進行基因分型獲得的1503個變異位點兩兩之間（共1128753個組合）的R²值進行計算，發(fā)現(xiàn)它們之間的R²值范圍為0～1，具較強的連鎖不平衡的組合（即R²≥0.216）^[36]占總組合的7.57%，R²>0.8的組合占總組合的2.14%，表明該群體存在一定的連鎖不平衡，可進行關(guān)聯(lián)分析^[37]。當(dāng)R²值大于0.8時表明兩個位點存在強連鎖

不平衡，可被歸入同一個單倍型中^[38]。因此，在R²>0.8的條件下，對自然群體基因分型中發(fā)現(xiàn)的1503個變異位點進行單倍型分析，共構(gòu)建了376個單倍型，且所有單倍型的基因頻率均大于5%。

2.4??群體結(jié)構(gòu)分析和關(guān)聯(lián)分析

運用376個單倍型對94份煙草種質(zhì)進行群體結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)最佳類群數(shù)K=2時，△K值最大，因此將其分為兩個類群;這一結(jié)果表明應(yīng)用于本研究的材料群體結(jié)構(gòu)簡單，而簡單的群體結(jié)構(gòu)有利于關(guān)聯(lián)分析^[40]。

據(jù)此，本研究結(jié)合群體結(jié)構(gòu)Q值和材料間的親緣系數(shù)值，基于376個單倍型，對2015年和2018年統(tǒng)計的青枯病病情指數(shù)進行關(guān)聯(lián)分析，并對顯著關(guān)聯(lián)（p<0.01）的單倍型進行假陽性檢驗（FDR

2.5??連鎖與連鎖不平衡平行作圖

對連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果進行比較，發(fā)現(xiàn)在94份材料的關(guān)聯(lián)分析中檢測到的8個單倍型，其中有2個單倍型即Hap227和Hap370中含有的分子標(biāo)記與連鎖分析檢測到的QTL位點處于同一個連鎖群上。其中，Hap227含有的分子標(biāo)記INDELR-229與qTBWR-18-E2在LG18上峰值的距離為1.14 cM（圖1 D）;Hap370含有的分子標(biāo)記RAD-68與qTBWR-17-E1在LG17上峰值的距離為3.15 cM（圖1 C）。但連鎖分析中探測到的另兩個QTLs（qTBWR-6-E4和qTBWR-11-E3）未發(fā)現(xiàn)與關(guān)聯(lián)分析存在聯(lián)系，關(guān)聯(lián)分析中獲得的其他6個單倍型亦未發(fā)現(xiàn)與連鎖分析探測到的QTL存在關(guān)聯(lián)。

2.6??228份煙草材料的群體結(jié)構(gòu)及整合作圖

利用546個標(biāo)記對整合群體進行基因分型，確定出1399個等位基因頻率均大于0.05的變異位點，并在R²>0.8的條件下構(gòu)建了573個單倍型，利用單倍型進行群體結(jié)構(gòu)分析，將其分為兩個類群。

對2015年和2018年的病情指數(shù)進行關(guān)聯(lián)分析，并經(jīng)FDR驗證，共發(fā)現(xiàn)到8個單倍型與煙草青枯病抗性密切相關(guān)（表4）。其中，2015年共檢測到Hap9、Hap15、Hap250、Hap261、Hap370和Hap368等6個單倍型與青枯病抗性緊密相關(guān)，表型變異解釋率介于5.03%～6.50%之間;而2018年僅檢測到Hap73和Hap289等2個單倍型與青枯病抗性緊密相關(guān)，表型變異解釋率分別為4.95%和6.93%。

整合作圖中探測到的Hap289和Hap370在利用94份煙草材料進行的關(guān)聯(lián)分析中亦被探測到，單倍型Hap368中涉及的分子標(biāo)記RAD-66是連鎖分析中QTL qTBWR-6-E4的左翼標(biāo)記。因此，單倍型Hap289、Hap370和Hap368適用的材料范圍可能較廣，可靠性也較高，可利用其進行抗性材料的篩選。

2.7??青枯病抗病相關(guān)單倍型的表型效應(yīng)

在連鎖分析、關(guān)聯(lián)分析和整合作圖分析中，有4個單倍型（Hap227、Hap289、Hap370和Hap368）在兩種及以上分析方法均發(fā)現(xiàn)與抗病密切相關(guān)，表明這些單倍型用于評價青枯病抗病性將具有較高的準(zhǔn)確性。因此，對它們進行表型效應(yīng)分析（表5），發(fā)現(xiàn)Hap289和Hap370表現(xiàn)為減效效應(yīng);而Hap227和Hap368表現(xiàn)為增效效應(yīng)。

3 ?討 ?論

本研究利用建立的遺傳圖譜進行青枯病抗性QTL定位，檢測到4個解釋率在12%～30.1%之間的QTLs，表明這些可能為主效基因位點，與NISHI等^[2]、MATSUDA等^[40]和MATSUDA^[41]研究發(fā)現(xiàn)煙草青枯病抗性有主效基因影響的結(jié)論一致。此外，所發(fā)現(xiàn)的QTL qTBWR-6-E4的位置與SSR標(biāo)記TP398和TP133的遺傳距離分別為21.49 cM和26.83 cM（圖1），與范江^[42]研究發(fā)現(xiàn)青枯病抗病品種“R8”中抗病基因與標(biāo)記TP398和TP133的遺傳距離分別為24.49 cM和26.51 cM的結(jié)果基本一致，猜測qTBWR-6-E4可能為“R8”的抗性基因;該QTL左右兩翼鄰近標(biāo)記RAD-66和INDELR-27與QTL峰值點的距離均小于6 cM，表明連鎖得更加緊密，因此利用這兩個分子標(biāo)記對煙草材料進行抗病性評價更具優(yōu)勢。值得一提的還有，本研究發(fā)現(xiàn)4個QTL的臨近標(biāo)記多為利用“粵煙98”和“118-3”這兩個親本基于RAD-seq測序開發(fā)的InDel標(biāo)記;

由于InDel標(biāo)記在基因組中分布廣泛，擴增產(chǎn)物的穩(wěn)定性和分辨率均較SSR標(biāo)記好^[43]，而以往的報道中利用AFLP、RAPD、SSR等標(biāo)記對煙草青枯病抗性進行QTL定位^{[1-3，5，44]}，而未見有利用InDel標(biāo)記開展煙草遺傳圖譜的構(gòu)建和青枯病抗性QTL定位工作;因此本研究豐富了煙草青枯病研究的標(biāo)記類型，有利于后續(xù)對煙草材料進行更精確的評價。

連鎖分析的QTL定位主要利用兩個親本的遺傳背景，由此獲得的分子標(biāo)記適用的材料范圍有待考量^[10];而利用自然群體作材料開展的基于連鎖不平衡的關(guān)聯(lián)分析卻能克服上述缺點，挖掘出的分子標(biāo)記將可能具有較為廣泛的適用性。目前在煙草青枯病抗病性關(guān)聯(lián)分析的研究報道較少，僅見2篇我們前期分別利用37個MFLP標(biāo)記和236個SSR標(biāo)記對煙草青枯病抗性進行關(guān)聯(lián)分析^[9-10]。本研究在前期研究工作基礎(chǔ)上，運用253個SSR標(biāo)記和293個InDel標(biāo)記共546個標(biāo)記開展青枯病抗性的關(guān)聯(lián)分析，增加了標(biāo)記數(shù)目和標(biāo)記的類型，且使用單倍型進行基于連鎖不平衡的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了解釋率介于8.27%～11.42%之間的8個單倍型（含16個變異位點）與青枯病抗病性相關(guān)，所發(fā)現(xiàn)到的單倍型數(shù)多于賴瑞強等^[10]檢測到的7個單倍型數(shù)，涉及的變異位點數(shù)也遠多于吳超等^[9]利用變異位點進行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)到6個與青枯病抗性相關(guān)的MFLP變異位點;而值得一提的是本研究所發(fā)現(xiàn)單倍型Hap59，所含的變異位點即TM10247.125/TM10247.130在賴瑞強等^[10]研究中也被關(guān)聯(lián)到與煙草青枯病抗性相關(guān)，表明本研究的關(guān)聯(lián)結(jié)果可靠性高，可為煙草青枯病抗病材料的分子標(biāo)記輔助篩選提供參考。

雖然關(guān)聯(lián)分析能克服連鎖分析遺傳背景狹窄的缺點，但也存在局限性，如關(guān)聯(lián)分析不能檢測QTL的加性效應(yīng)，且對稀有等位基因的檢測效能低^[11];反之，連鎖分析卻不具有上述缺點^[12]。因此，連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析兩種分析方法各有優(yōu)劣，通過結(jié)合這兩種方法，揚長避短進行相互驗證有利于提高QTL定位的準(zhǔn)確性^[10]。在本研究開展的連鎖與連鎖不平衡聯(lián)合作圖的平行作圖中，發(fā)現(xiàn)與抗病性相關(guān)的單倍型Hap227和Hap370分別與坐落在連鎖群LG18的qTBWR-18-E2和LG17上qTBWR-17-E1峰值之間的遺傳距離均小于4 cM;而劉凱等^[28]報道當(dāng)關(guān)聯(lián)位點與QTL在連鎖群上的遺傳距離小于6 cM時，表明對應(yīng)區(qū)段存在目標(biāo)性狀的相關(guān)基因;因此本研究發(fā)現(xiàn)到的兩個區(qū)段，可能存在與煙草青枯病抗性相關(guān)的基因。但本研究也存在一些QTL和關(guān)聯(lián)位點沒有相互驗證到的情況，這可能是兩個群體的遺傳背景差異造成，該結(jié)果與LU等^[33]認為關(guān)聯(lián)分析中檢測到的一些標(biāo)記未被連鎖分析發(fā)現(xiàn)，是由于群體遺傳背景差異造成的結(jié)論一致。而在連鎖與連鎖不平衡聯(lián)合作圖的整合作圖中，共發(fā)現(xiàn)到8個單倍型與煙草青枯病抗性相關(guān)，其中Hap289和Hap370在利用種質(zhì)材料的關(guān)聯(lián)分析中亦被發(fā)現(xiàn)，而Hap368含有RAD-66標(biāo)記位點，為本研究連鎖分析探測到的QTL（qTBWR-6-E4）側(cè)翼標(biāo)記，且與范江^[42]發(fā)現(xiàn)到的青枯病抗性基因位置基本一致。這些說明了本研究結(jié)果的具有較高的準(zhǔn)確性。

4 ?結(jié) ?論

本研究首次利用連鎖與連鎖不平衡聯(lián)合作圖策略對煙草青枯病抗性進行研究，探測到4個在兩種及以上分析方法均發(fā)現(xiàn)與抗病密切相關(guān)單倍型。該結(jié)果可為煙草青枯病抗性的相關(guān)研究及后續(xù)煙草青枯病抗性材料的輔助篩選提供參考。

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