阮 潔，劉 松，李江華*，堵國成，陳 堅

（1.江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

人體內(nèi)的磷酸肌酸代謝終產(chǎn)物肌酐可以經(jīng)過腎臟過濾，經(jīng)由血液進入尿液而排出體外。在腎臟功能或者肌肉功能出現(xiàn)問題時，血清中肌酐含量將從正常的35～150 μM 上升到1 000 μM[1-2]。因此，血清中肌酐含量成為檢測腎的重要指標。當前市場上最常用的酶法檢測肌酐含量試劑盒主要涉及3 種關鍵酶，肌酐水解酶、肌酸酶（EC 3.5.3.3，CRE)和肌氨酸氧化酶[3]。其中，CRE 主要用于催化肌酸水解產(chǎn)生尿素和肌氨酸。要制備商品化的且能長久保存的肌酐檢測試劑，CRE 的穩(wěn)定性十分重要。

在酶法測定肌酐含量涉及的3 種酶中，已報道的肌酐酶水解酶和肌氨酸氧化酶較穩(wěn)定[4-5]，而其主要來源于惡臭假單胞菌、節(jié)桿菌、產(chǎn)堿桿菌和副球菌[6-9]等的肌酸酶熱穩(wěn)定性皆不理想，文獻[6]對Paracoccus sp.strain WB1 CRE 分析發(fā)現(xiàn)：CRE 最適反應溫度在30～40 ℃，當溫度高于45 ℃時，穩(wěn)定性會顯著下降，在55 ℃保溫10 min 后殘余酶活僅剩10%左右。P.putida NTU-8 CRE[10]與Alcaligenes sp.nov CRE[11]的研究中也具有這一性質(zhì)。已有研究中關于CRE 穩(wěn)定性改造的研究較少，文獻[12]對來源于P.putida CRE 分子進行了隨機突變改造，其中V182I 突變株的Tm提高0.2 ℃。文獻[13]通過固定化的方式使得肌酸酶在4 ℃保存200 d 后仍具有較高活性。但若想將CRE 應用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)，CRE的熱穩(wěn)定性還有待進一步提高。

本研究前期來源于Arthrobacter nicotianae 23710 CRE 表達基因與pET-20b（+)相連，并轉(zhuǎn)入Escherichia coli（DE3），獲得高效表達重組菌pET-20J[14]。且A.nicotianae 23710 CRE 在45 ℃熱穩(wěn)定性較好、比酶活較高，但仍不能達到工業(yè)應用的標準。蛋白質(zhì)工程能有效改善天然酶的性能，通常蛋白質(zhì)改造的策略主要包括：DNA shuffling[15]，易錯PCR[16]，體外隨機重組、定點突變[17]等。本研究擬結合同源序列比對與計算機同源建模確定改造位點，對A.nicotianae 23710 CRE 的進行飽和突變，得到熱穩(wěn)定性顯著提高的CRE 突變體，為分子改造提高CRE 穩(wěn)定性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本研究前期構建保存的表達質(zhì)粒pET-20J，用于表達CRE。E.coli BL21（DE3)和E.coli JM109 來自Qiagen 公司（美國）。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶Nde I、Xho I、Dpn I 均購自Thermo 公司。Primer star DNA 聚合酶、感受態(tài)制備試劑盒、柱回收試劑盒均購與TaKaRa 公司。異丙基-β-D 硫代半乳糖苷（IPTG)、質(zhì)粒提取試劑盒與氨芐青霉素均購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基（LB）：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L；發(fā)酵培養(yǎng)基（TB）：酵母粉24 g/L，胰蛋白胨12 g/L，甘油10 g/L，K2HPO416.43 g/L，KH2PO42.32 g/L，（pH 7.0)。

1.2 方法

1.2.1 CRE 突變體的構建 以前期實驗室保存的pET-20J 質(zhì)粒為模板[14]，設計兩條引物（見附表1)，利用突變引物通過重疊延伸PCR 引進突變點。將相應的重疊延伸PCR 產(chǎn)物Dpn I 消化2 h，除去模板質(zhì)粒后進行柱回收并轉(zhuǎn)入感受態(tài)E.coli JM109 中，挑取單菌落培養(yǎng)并提質(zhì)粒測序。將正確突變質(zhì)粒利用化學法轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3)感受態(tài)細胞中進行表達。實驗所需的突變引物均由上海生工合成。

表1 K195 位點飽和突變引物Table 1 Saturation mutagenesis-primer of K195 site

續(xù)表1

1.2.2 CRE 突變體的表達 將突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3)得到表達CRE 的突變菌株。挑取單個菌落至LB 培養(yǎng)基（含100 μg/mL 的氨芐抗生素）中，于37 ℃、220 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)8 h。之后將種子液以體積比為3%的接種量接入TB 培養(yǎng)基，于37℃、220 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)至菌濃OD600=3，并加入終濃度為0.6 mmol/L 的IPTG 誘導，于30 ℃、220 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)10 h。

1.2.3 CRE 突變體的純化 將突變菌株的發(fā)酵液經(jīng)過超聲破碎，在低溫下12 000 r/min 離心10 min后收集上清液。在冰浴條件下將上清液進行逐級硫酸銨沉淀，離心收集沉淀。向獲得的沉淀中加入少量的磷酸緩沖液（0.05 mol/L NaH2PO4及0.05 mol/L Na2HPO4混合液，pH=7.0)以溶解沉淀，裝入透析袋（截留分子量為10 kDa）后在同樣的磷酸緩沖液中透析24 h。透析后，透析除鹽后用微孔濾膜（0.25 μm）去除酶液中的雜質(zhì)，利用陰離子交換柱（HiPrep 16/10 Q-XL）進行蛋白純化。上樣緩沖液（A 液）為50 mmol/L 的磷酸緩沖液，而洗脫緩沖液（B 液）為加有1 mol/L NaCl 的磷酸緩沖液（50 mmol/L）。

1.2.4 CRE 的酶活測定 在試管中加入0.1 mol/L肌酸溶液900 μL，在室溫條件下平衡5 min 后加入待測酶液100 μL，于37 ℃反應10 min 后加入2 mL終止劑終止反應，并置于25 ℃溫育20 min，在435 nm 處測定吸光度值?？瞻坠苁窃诩∷崛芤褐邢燃尤雽?二甲氨基苯甲醛，后加入待測酶液，其他步驟與測定管一致。終止劑為對二甲氨基苯甲醛溶液：2 g 對-二甲氨基苯甲醛固體粉末溶于100 mL 二甲亞砜溶液中，待完全溶解后加入15 mL 濃鹽酸。

單位酶活定義為單位時間內(nèi)將肌酸水解產(chǎn)生1 μmol 尿素所需要的酶量。計算如下

式中：V樣為反應體系中酶液體系；V總為反應總體積；ε 為毫摩爾吸光系數(shù)；t 為反應時間。

1.2.5 酶學參數(shù)的測定 半衰期檢測（t1/2，min)：將純化后的突變CRE 稀釋到同一濃度，放置于50 ℃水浴保溫25 min，其中每隔3 min 取樣并按照1.2.4節(jié)方法測定CRE 的殘余酶活，確定蛋白的半衰期。

Km和kcat測定：配制不同濃度的肌酸溶液（0～120 mmol/L），加入過量的酶液，按照1.2.4 測定酶活力，并用GraphPad Prism 5 軟件（GraphPad Software）計算。

1.2.6 軟件分析 利用在線服務器SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/），以PDB 數(shù)據(jù)1CHM[18]晶體結構為模板，同源模擬A.nicotianae 23710 CRE 晶體結構。CRE 晶體結構由軟件Discovery studio 4.1 分析。

2 結果與討論

2.1 CRE 飽和突變位點的選擇及構建

隨機突變的結果顯示，V182 突變?yōu)楫惲涟彼崾筆.putida CRE 的Tm提高0.2 ℃[12]，表明V182 對與P.putida CRE 熱穩(wěn)定性有重要影響。氨基酸序列比對 顯 示，A.nicotianae 23710 與P.putida 來 源 的CRE 同源性達到62%。以P.putida 晶體結構（PDB ID.1CHM）為模板，通過SWISS-MODEL 在線服務器構建得到A.nicotianae CRE 的模擬結構。通過一級及二級序列比對發(fā)現(xiàn)，V182 位點對應于A.nicotianae CRE 的K195 位點，兩位點同處于α 螺旋（圖1）。因此，為研究K195 對A.nicotianae CRE 熱穩(wěn)定性的影響，對此K195 進行飽和突變。

圖1 CRE 序列比對Fig.1 CRE secondary sequence alignment

2.2 CRE的表達及酶學性質(zhì)分析

以pET-20J 質(zhì)粒為模板，設計兩條含突變點的引物，利用突變引物通過重疊延伸PCR 引進突變點。將測序正確的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3)中，用于發(fā)酵表達CRE 突變體。發(fā)酵結束后收集菌體，測定胞內(nèi)上清中CRE 的熱穩(wěn)定性。如圖2（a）所示，相同條件下，突變體的粗酶液在45 ℃保溫30 min 后，CRE 突 變 體K195V、K195T、K195C 和K195L 較野生酶（WT)熱穩(wěn)定性明顯提高。通過硫酸銨沉淀及陰離子柱純化得到K195V、K195T、K195C 和K195L 純酶液（圖2（b）)，進一步分析其酶學性質(zhì)。

圖2 粗酶液中CRE 及其突變體的熱穩(wěn)定性及優(yōu)勢突變體純化蛋白的電泳分析Fig.2 Crude enzyme thermostability analysis of CRE and its mutants；SDS-PAGE analysis of CRE and its positive mutants

與野生酶相比，突變體K195V、K195T、K195C和K195L 的t1/2（50 ℃)分別提高260%、230%、60%和20%；其中，K195V 和K195C 的比酶活分別提高了80.7%，88.2%（表2)。突變體中Tm值較WT 增加了4～5.9 ℃；K195V 的Tm達到55.4 ℃。與P.putida CRE 的組合突變體A109V/ V182I/V355M 相比[12]，K195V 高0.7 ℃。表明本研究得到的K195V 在穩(wěn)定性方面更具有優(yōu)勢。

此外，部分突變體的Km值較突變前降低，其中K195C 突變體的Km值降低幅度較大，降低了28%，與報道的A.nicotianae 02181[19]來源CRE 基本一致。突變體K195V、K195T、K195C 和K195L 的kcat/Km值與野生型相比，分別提高了131%、218%、83%和100%。表明，K195 對CRE 底物親和力及酶催化速率有較大影響。

表2 突變體的酶學性質(zhì)Table 2 Kinetic constants of CRE

2.3 K195 突變體的穩(wěn)定化機制分析

研究表明，蛋白質(zhì)分子的熱穩(wěn)定性、催化活性的變化與蛋白質(zhì)分子間作用力的種類和數(shù)量有關[20]。為分析突變體熱穩(wěn)定性提高的原因，構建了A.nicotianae CRE 結構模型并用在線軟件 Protein Interaction calculator（http：//pic.mbu.iisc.ernet.in/job.html)分析CRE 分子間作用力的變化。如表3 所示，突變體K195V、K195T、K195L 較WT 分別增加2、3、4 個疏水作用力。研究表明，疏水作用力是影響蛋白穩(wěn)定性的重要因素，降低蛋白表面的疏水性或者增強分子內(nèi)部的疏水性有利于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定[21-22]。因此，疏水作用力的增加極有可能是CRE 熱穩(wěn)定性提高的一個原因。此外，突變體K195V、K195T、K195L 較WT 分別增加了7、12、13 個氫鍵。文獻[23]研究表明增加一個氫鍵可提供0.6 kcal·mol-1的能量，且氫鍵增加是酶分子穩(wěn)定性增加的重要原因之一[24]。因此，氫鍵的增加可能是CRE 熱穩(wěn)定性提高的重要原因。

表3 突變前后CRE 作用力變化Table 3 Interactions potentially involved in the stability of wild-type and mutants

運用軟件Discovery studio 4.1 對CRE 的活性位點及催化區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)：突變體K195T 的活性位點Phe 72、Arg 74、His 663、Glu 693、Glu 789、Arg 766 與周圍氨基酸形成的氫鍵較WT 有所增加。如圖3 所示，在K195T 中，Arg 74 與Thr 71 形成2 個氫鍵，且Arg 766 與催化區(qū)域形成的氫鍵由原來的2 個增至4 個。據(jù)報道，氫鍵對于在高溫條件下維持酶的穩(wěn)定性具有重要作用[25]。文獻[26]研究中表明，增加分子間的作用力特別是主鏈氫鍵的增加有利于酶的穩(wěn)定，且增強活性位點的剛性有利于酶的催化。文獻[27]的研究中也表明了這一觀點。因此，氫鍵的增加極有可能是K195T 催化效率提高及熱穩(wěn)定性提高的重要因素。

圖3 突變體形成新的氫鍵作用分布情況Fig.3 Hydrogen binding network newly formed of mutants

3 結語

通過飽和突變的方法，確定了K195 位點為提高肌酸酶熱穩(wěn)定性的重要位點，構建的K195V、K195T、K195C 和K195L 突變體的半衰期較野生型分提高260%、230%、60%和20%。其中，K195V 和K195C 的比酶活分別提高了80.7%，88.2%。獲得高熱穩(wěn)定性及高催化活性的CRE 突變體將有助于其工業(yè)化應用。