安 然，王春婷，董 平，李 敬，梁興國

（中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

近年來，由于食品市場的全球化發(fā)展及食品安全事件的頻發(fā)，建立并完善食品產(chǎn)業(yè)的溯源體系成為確保食品安全的一個(gè)重要措施。由于標(biāo)簽或外包裝防偽技術(shù)存在易損壞脫落或被偽造等缺陷[1-2]，DNA 指紋[3-5]和DNA 條形碼[6]等生物技術(shù)逐漸被用于食品原料的種質(zhì)鑒定及產(chǎn)地溯源。然而這些方法對于白酒、橄欖油等自身DNA 含量極低或DNA 被嚴(yán)重破壞的深加工食品，提取其自身DNA 并進(jìn)行鑒定也較為困難。因此，通過在食品中加入外源DNA 作為溯源內(nèi)標(biāo)物的新型技術(shù)逐漸受到重視[7-8]。

雖然相比于其他生物大分子，DNA 的理化性質(zhì)較為穩(wěn)定，但由于食品中存在多種核酸破壞因子（如核酸酶、自由基和酸等），DNA 在其中經(jīng)長時(shí)間貯藏后會發(fā)生脫嘌呤、氧化或斷裂等損傷，造成序列信息的丟失，最終導(dǎo)致檢測的假陰性，這大大限制了其作為溯源標(biāo)記物在食品中的應(yīng)用。因此，目前亟需一種提高DNA 穩(wěn)定性的方法來實(shí)現(xiàn)其在食品中的長期穩(wěn)定存在。

眾所周知，核酸具有聚陰離子的特性，其磷酸基上的負(fù)電荷可通過靜電相互作用與聚陽離子化合物攜帶的正電荷結(jié)合，從而達(dá)到提高核酸穩(wěn)定性的目的[8]。在細(xì)胞中，DNA 正是通過纏繞在帶有多個(gè)正電荷的組蛋白上來提高DNA 穩(wěn)定性。目前已有研究表明，堿性多肽和精胺、亞精胺和腐胺等多胺類聚陽離子化合物可降低由輻射產(chǎn)生的DNA 斷裂損傷[9-11]；殼聚糖-DNA 納米粒子可抵抗DNase I[12-14]、DNase II[15]和Exonulease III[16]等核酸酶的降解；殼聚糖[17-19]和多胺類物質(zhì)[20]還可提高核酸對氧化和輻射的耐受性。此外，根據(jù)脫嘌呤的質(zhì)子化機(jī)理[21]，聚陽離子可通過中和磷酸基上的負(fù)電荷來抑制核酸在酸性條件下的脫嘌呤反應(yīng)。而且，由于具有聚陽離子性質(zhì)的殼聚糖是一種天然的無毒無害的食品添加劑，很適合作為核酸保護(hù)劑應(yīng)用于食品領(lǐng)域。

因此，本文作者選用了殼聚糖、殼寡糖和精胺3種分子量大小不同的聚陽離子化合物，探究了聚陽離子化合物對液態(tài)食品中DNA 的保護(hù)作用，并評估了DNA-聚陽離子復(fù)合物作為食品溯源標(biāo)記物的可行性。不僅可為食品中核酸穩(wěn)定性的提高提供一種新思路，還可擴(kuò)大DNA 標(biāo)記物在食品中的應(yīng)用范圍。此外，對于DNA-聚陽離子復(fù)合物穩(wěn)定性的研究也可為殼聚糖-DNA 納米營養(yǎng)體在液態(tài)食品中穩(wěn)定性的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)所用試劑 pUC18質(zhì)粒、λDNA、pfu DNA 聚合酶、DNase I 和SYBR Select Master Mix 購自Thermo Scientific 公司；引物訂購自蘇州金唯智生物科技有限公司，序列見表1；dNTPs（10 mmol/L）和精胺購自Sigma 公司；殼寡糖（分子量：6 500 Da；脫乙酰度：91.1%）購自山東省萊州市海力生物制品有限公司；殼聚糖（分子量：50～100 kDa）購自浙江澳興生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑；Piko Real 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購自Thermo Scientific 公司。1.1.2 實(shí)驗(yàn)所用液態(tài)食品 本實(shí)驗(yàn)所使用的液態(tài)食品的保質(zhì)期與pH 值列于表2 中。其中白酒品名為三井小刀，生產(chǎn)單位為河北三井酒業(yè)股份有限公司；葡萄酒品名為青島華東干紅葡萄酒，生產(chǎn)單位為青島華東葡萄釀酒有限公司；牛奶品名為圣牧有機(jī)純牛奶，生產(chǎn)單位為內(nèi)蒙古圣牧高科奶業(yè)有限公司；乳酸菌飲料品名為伊利每益添低糖活性乳酸菌飲料，生產(chǎn)單位為內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司；檸檬汁飲料品名為水溶c100 檸檬味復(fù)合果汁飲料，生產(chǎn)單位為農(nóng)夫山泉（淳安茶園）有限公司；白醋品名為海天9 度純釀米醋，生產(chǎn)單位為佛山市海天（高明）調(diào)味食品有限公司；蘇打水品名為嶗山蘇打水，生產(chǎn)單位為青島嶗山礦泉水有限公司；蟲草酒品名為茅臺北冬蟲夏草酒，生產(chǎn)單位為貴州茅臺酒廠（集團(tuán)）保健酒業(yè)有限公司。

表1 本研究中使用的引物序列Table 1 Sequence of primers used in this study

表2 本研究中使用的液態(tài)食品Table 2 Liquid foods used in this study

1.2 DNA-聚陽離子復(fù)合物的制備

PCR 產(chǎn)物的制備：以pUC18 質(zhì)粒為模板（1010拷貝/μL），pUC18-364a/s（表1）為引物進(jìn)行PCR 反應(yīng)，目的產(chǎn)物長度為364 bp。50 μL PCR 反應(yīng)體系中含1×pfu Buffer（20 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L（NH4）2SO4，10 mmol/L KCl，0.1 mg/mL BSA，1%（v/v）Triton X-100，2 mmol/L MgSO4，pH 8.8@25 ℃），0.4 μmol/L 引物，0.2 mmol/L dNTPs，2 U pfu DNA 聚合酶。PCR 參數(shù)為：72 ℃引物延伸5 min，94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72℃延伸90 s，35 個(gè)循環(huán)后72 ℃保溫5 min。將得到的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化并用NanoDrop2000 分光光度計(jì)（Thermo Scientific）測定濃度。

將λDNA、pUC18 質(zhì)粒DNA（pDNA）或PCR 產(chǎn)物分別與殼寡糖、殼聚糖或精胺按照不同的氨基磷酸比混合后，于4 ℃放置12 h，使DNA 與聚陽離子化合物充分作用，通過靜電相互作用形成復(fù)合物。

1.3 復(fù)合物對DNase I 的耐受性實(shí)驗(yàn)

將λDNA-殼寡糖復(fù)合物或λDNA-精胺復(fù)合物加入到含有DNase I 的體系中，20 μL 酶切體系中含600 ng λDNA，0.02 U DNase I 和1×DNase I Buffer（10 mmol/L Tris -HCl，2.5 mM MgCl2，0.1 mmol/L CaCl2，pH 7.5@25 ℃）。37 ℃反應(yīng)10 min 后，在65 ℃下溫浴10 min 將酶滅活。通過瓊脂糖凝膠電泳對λDNA 的長度進(jìn)行檢測。

1.4 復(fù)合物在液態(tài)食品中的長期貯藏

取4 μL pDNA-聚陽離子復(fù)合物（氨基磷酸比為10∶1）加入到396 μL 不同的液態(tài)食品（表2）中，使pDNA 的終濃度達(dá)到290 pg/μL（～108拷貝/μL）混勻后分別置于4、20 ℃和37 ℃下貯藏10～30 d。取1 μL PCR 產(chǎn)物-聚陽離子復(fù)合物（氨基磷酸比為10∶1）加入到1 mL 蟲草酒中，使PCR 產(chǎn)物的濃度達(dá)到約0.4 pg/μL（～106拷貝/μL），并置于室溫下貯藏60～120 d。同時(shí)設(shè)置不添加聚陽離子化合物的對照組，即將質(zhì)粒DNA 或PCR 產(chǎn)物直接加入到液態(tài)食品中，使DNA 的終濃度與復(fù)合物中DNA 的終濃度相同，其他貯藏條件完全相同。

1.5 熒光定量PCR 法測定DNA 含量

將含有質(zhì)粒DNA 或PCR 產(chǎn)物的液態(tài)食品稀釋100 倍后作為熒光定量PCR（qPCR）反應(yīng)的模板。針對pUC18 質(zhì)粒DNA 設(shè)計(jì)的特異性引物為pUC18-170s/a，目的產(chǎn)物長度為170 bp；針對PCR 產(chǎn)物設(shè)計(jì)的特異性引物為PCR-156s/a，目的產(chǎn)物長度為156 bp（表1）。10 μL qPCR 體系含5 μL 2×SYBR Select Master Mix，0.3 μM 特異性引物，1 μL 稀釋后的液態(tài)食品。熒光定量PCR 參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性20 s，59 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40 個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基磷酸比對λDNA-聚陽離子復(fù)合物穩(wěn)定性的影響

氨基磷酸比（N/P）是復(fù)合物中聚陽離子化合物攜帶的氨基摩爾數(shù)與DNA 攜帶的磷酸基摩爾數(shù)之比，它代表DNA-聚陽離子復(fù)合物中正負(fù)電荷的比例，是影響聚陽離子化合物與DNA 靜電相互作用的重要因素。

本實(shí)驗(yàn)制備了不同氨基磷酸比（1∶1～100∶1）的λDNA-殼寡糖和λDNA-精胺復(fù)合物，以DNase I 的水解程度為指標(biāo)，探究了氨基磷酸比對DNA-聚陽離子復(fù)合物穩(wěn)定性的影響。圖1 中的結(jié)果顯示，經(jīng)DNase I 酶解10 min 后，大部分λDNA 都被水解為500 bp 以下的小片段；當(dāng)N/P≥10 時(shí)，λDNA 的條帶位置與標(biāo)準(zhǔn)品位置一致，幾乎不會被DNase I 降解，說明殼寡糖對λDNA 的保護(hù)效果較好。精胺對DNA的保護(hù)效果稍差于殼寡糖，當(dāng)氨基磷酸比達(dá)到10∶1時(shí)，有少部分λDNA 被DNase I 輕微降解，產(chǎn)生彌散條帶。基于以上結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中質(zhì)粒DNA-聚陽離子復(fù)合物的制備選用的氨基磷酸比為10∶1。

圖1 不同氨基磷酸比的λDNA-聚陽離子復(fù)合物對DNase I 的耐受性Fig.1 λDNA -polycation complexes with various N/P hydrolyzed by DNase I

2.2 質(zhì)粒DNA-聚陽離子復(fù)合物在液態(tài)食品中的穩(wěn)定性

本實(shí)驗(yàn)選取了7 種不同的液態(tài)食品（表2），其中包括酒類飲品、乳制飲品、酸味液態(tài)食品和堿性飲品。這些液態(tài)食品的理化性質(zhì)特殊，具有一定的代表性，且?guī)缀蹩赡依ù蟛糠忠簯B(tài)食品的主要成分，使用其探究DNA-聚陽離子復(fù)合物在其中的穩(wěn)定性具有一定的普遍意義。

為確定液態(tài)食品的成分以及聚陽離子化合物對于qPCR 的影響，本實(shí)驗(yàn)將含有質(zhì)粒DNA（pDNA）-聚陽離子復(fù)合物的液態(tài)食品分別稀釋100和1 000 倍后進(jìn)行qPCR 檢測。結(jié)果顯示，不同液態(tài)食品經(jīng)100 倍稀釋后Ct 值有較大差異，但經(jīng)1 000倍稀釋后Ct 值則沒有顯著性差異（數(shù)據(jù)未列出），說明食品成分和聚陽離子化合物在充分稀釋后對qPCR 反應(yīng)幾乎無影響。因此，此方法可以于定量評價(jià)pDNA 在液態(tài)食品中的穩(wěn)定性。

2.2.1 在酒類飲品中的穩(wěn)定性 本實(shí)驗(yàn)中分別測定了單獨(dú)pDNA 的對照組、pDNA-殼寡糖、pDNA-殼聚糖和pDNA-精胺復(fù)合物在白酒和葡萄酒中的穩(wěn)定性（圖2）。結(jié)果顯示，pDNA 在酒類飲品中的穩(wěn)定性較差，經(jīng)37 ℃、10 d 的貯藏后，對照組中白酒和葡萄酒的pDNA 拷貝數(shù)由108拷貝/μL 降低至約105拷貝/μL，pDNA 含量僅分別為最初的0.07%和0.08%。降低貯藏溫度后，pDNA 的穩(wěn)定性明顯提高，但在20 ℃時(shí)，DNA 的破壞程度仍然較大。

將pDNA-聚陽離子復(fù)合物加入酒類飲品中可明顯提高pDNA 的穩(wěn)定性，其中殼聚糖對pDNA 的保護(hù)效果較好，在20 ℃時(shí)經(jīng)20 d 的貯藏后pDNA-殼聚糖復(fù)合物在白酒和葡萄酒中的含量幾乎沒有數(shù)量級的變化。殼寡糖和精胺對酒類中的外源DNA也具有一定的保護(hù)作用。

圖2 p DNA-聚陽離子復(fù)合物在酒類飲品中的穩(wěn)定性Fig.2 Stability of pDNA -polycation complexes in alcoholic drinks

2.2.2 在乳制飲品中的穩(wěn)定性 本實(shí)驗(yàn)選取了牛奶和乳酸菌飲料為兩種代表性的乳制飲品。結(jié)果顯示，pDNA 在牛奶中的穩(wěn)定性較低，經(jīng)37 ℃貯藏10 d 后含量僅為最初的0.9%（圖3（a））。在其中加入pDNA-殼寡糖復(fù)合物或pDNA-殼聚糖復(fù)合物后，pDNA的穩(wěn)定性明顯提高，20 ℃，20d貯藏后，pDNA 的含量幾乎無數(shù)量級的變化。然而精胺在牛奶中對DNA 的保護(hù)作用不明顯。

雖然乳酸飲品的pH 值較低（pH 3.9），但與牛奶不同的是，pDNA 在乳酸飲料中的穩(wěn)定性較高，經(jīng)不同溫度下長時(shí)間貯藏后對照組和3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的pDNA 含量都幾乎無變化（圖3（b））。

圖3 p DNA-聚陽離子復(fù)合物在乳制飲品中的穩(wěn)定性Fig.3 Stability of pDNA-polycation complexes in dairy drinks

2.2.3 在酸味液態(tài)食品中的穩(wěn)定性 本實(shí)驗(yàn)選取了pH 值分別為3.0 和2.2 的檸檬汁飲料和白醋作為酸味液態(tài)食品的代表，探究pDNA-聚陽離子復(fù)合物在酸味液態(tài)食品中的穩(wěn)定性。

pDNA 在檸檬汁和白醋中的穩(wěn)定性極差，經(jīng)37℃貯藏10 d 后，檸檬汁飲料和白醋中的pDNA 含量分別僅為最初的0.2%和0.09%（圖4）。其中殼寡糖和殼聚糖對pDNA 在檸檬汁飲料中的保護(hù)效果較好，在4、20 ℃和37 ℃下貯藏若干天后，pDNA 的含量幾乎無變化。然而，白醋對pDNA 的破壞性較強(qiáng)，在貯藏溫度高于20 ℃時(shí)，殼寡糖和精胺對于DNA的保護(hù)作用微弱。白醋中，殼聚糖對于DNA 有一定的保護(hù)作用，但在37 ℃貯藏10 d 后，殼聚糖-DNA復(fù)合物中的DNA 仍有較明顯的降解。

圖4 p DNA-聚陽離子復(fù)合物在酸味飲品中的穩(wěn)定性Fig.4 Stability of pDNA-polycation complexes in sour drinks

2.2.4 在堿性飲品中的穩(wěn)定性 蘇打水提供的環(huán)境為核酸最穩(wěn)定的弱堿性條件，因此核酸在其中的穩(wěn)定性極好，在4、20、37 ℃下長時(shí)間貯藏，外源pDNA 的含量都幾乎無變化（圖5）。

2.3 PCR 產(chǎn)物-殼聚糖復(fù)合物在名貴白酒中的穩(wěn)定性

基于以上結(jié)果，殼聚糖對于DNA 在液態(tài)食品中的保護(hù)作用最強(qiáng)。因此本實(shí)驗(yàn)選取蟲草酒作為代表性的名貴酒類飲品（表1），初步探究了成本較低且安全性較高的PCR 產(chǎn)物-殼聚糖復(fù)合物作為食品溯源內(nèi)標(biāo)物的應(yīng)用可行性。圖6 中將含有0.4 pg/μL PCR 產(chǎn)物的蟲草酒在室溫下貯藏120 d 后，PCR 產(chǎn)物的濃度始終維持在～106拷貝/μL，而未加入殼聚糖的對照組在貯藏90 d 后PCR 產(chǎn)物的含量已低于qPCR 的檢測限，造成檢測的假陰性。

圖5 pDNA-聚陽離子復(fù)合物在蘇打水中的穩(wěn)定性Fig.5 Stability of pDNA-polycation complexes in alkalic drinks

圖6 PCR 產(chǎn)物-殼聚糖復(fù)合物在蟲草酒中的穩(wěn)定性Fig.6 Stability of PCR products-chitosan complex in cordyceps liqueur

3 討論

實(shí)驗(yàn)表明：DNA 在大部分液態(tài)食品中的穩(wěn)定性較差，尤其是在酒類飲品、牛奶和酸味液態(tài)食品中，經(jīng)20 ℃貯藏20 d 后，DNA 的含量不足最初的1%。然而，聚陽離子化合物可在溶液中與DNA 相互纏繞結(jié)合為復(fù)合物，通過空間包裹或靜電相互作用阻礙核酸酶、自由基和質(zhì)子等破壞因子對DNA 的攻擊，提高外源DNA 在液態(tài)食品中的穩(wěn)定性。使用的3 種聚陽離子化合物中，殼聚糖對DNA 的保護(hù)效果最好，殼寡糖其次，精胺較差。這可能是由于殼聚糖的分子量較大，其較長的鏈狀結(jié)構(gòu)易于與DNA 鏈纏繞形成較為穩(wěn)定的復(fù)合物，而殼寡糖和精胺的分子尺寸較小，與DNA 形成的復(fù)合物穩(wěn)定性較差。

圖7 為pDNA-殼聚糖復(fù)合物在不同pH 值的液態(tài)食品中20 ℃貯藏20 d 后的pDNA 拷貝數(shù)。酒類飲品的pH 值較低，白酒的pH 值為3.7，葡萄酒的pH 值為3.1（表2）。酸類物質(zhì)為白酒中重要的呈味物質(zhì)，白酒中含乳酸、乙酸、己酸和丁酸等20 多種有機(jī)酸，總酸度為0.6～1.5 g/L[22]。葡萄酒的總酸度為1.66～4.52 g/L，其中含酒石酸、蘋果酸、乳酸和醋酸等[23]。研究表明，DNA 在相同pH 值的酸性乙醇和水中DNA 的脫嘌呤速率差別不大[24]。因此，外源DNA在白酒和葡萄酒中都會因脫嘌呤而發(fā)生較嚴(yán)重的降解，這可解釋酸性液態(tài)食品中裸露DNA 穩(wěn)定性較差的原因。根據(jù)脫嘌呤的質(zhì)子化機(jī)理[21]，聚陽離子化合物可與DNA 的磷酸基團(tuán)發(fā)生靜電相互作用，從而減慢嘌呤堿的質(zhì)子化反應(yīng)，抑制DNA 的脫嘌呤反應(yīng)。因此，在酒類飲品中，聚陽離子化合物可能主要是通過抑制脫嘌呤反應(yīng)來提高外源DNA 的穩(wěn)定性。

圖7 不同pH 值對pDNA-殼聚糖復(fù)合物穩(wěn)定性的影響Fig.7 Stability of pDNA-chitosan complex in drinks with various pH

與酒精類飲品類似的是檸檬汁飲料和白醋，它們的pH 值也較低，分別為2.2 和3.0，DNA 在其中極易發(fā)生脫嘌呤反應(yīng)。研究表明，37℃的條件下，DNA 在pH 2.5 和3.0 的水溶液中的脫嘌呤速率常數(shù)分別為7.5×10-6s-1和2.3×10-6s-1[21]。通過計(jì)算可得，DNA 在相同條件下10 d 后的脫嘌呤百分比約為99%和86%，因此在這兩種液態(tài)食品中外源DNA的破壞作用主要由脫嘌呤反應(yīng)引起的。

牛奶的pH 值為6.8，屬于中性飲品，但DNA 在其中的穩(wěn)定性較差。這可能是由于在牛奶的滅菌過程后仍有部分核酸酶保持活性，從而對DNA 發(fā)生水解反應(yīng)。殼聚糖和殼寡糖可有效抑制核酸酶的水解作用，從而大大提高牛奶中DNA 的穩(wěn)定性。乳酸菌飲料中DNA 的穩(wěn)定性較高，可能的原因是其中的牛乳蛋白大多已被水解為小片段的多肽，其中有些帶有正電荷的多肽易于與DNA 結(jié)合，從而對DNA 起到與聚陽離子化合物相似的保護(hù)作用。

本研究選用對DNA 保護(hù)效果最好的殼聚糖與PCR 產(chǎn)物制成溯源內(nèi)標(biāo)物成功實(shí)現(xiàn)了其在蟲草酒中的長期穩(wěn)定存在。PCR 產(chǎn)物可通過對模板和引物的選擇控制DNA 的序列和來源（比如，模板可選用其他天然食品來源的DNA），具有較高的安全性。殼聚糖無色無味，還具有調(diào)節(jié)脂類代謝、提高免疫力、抗菌抑菌及保護(hù)消化系統(tǒng)等多種生理作用[25]。因此，極少量的PCR 產(chǎn)物-殼聚糖內(nèi)標(biāo)物（＜10 pM）不會影響食品的風(fēng)味和口感，且安全可靠。此外，本方法無需對DNA 進(jìn)行提取，可通過直接稀釋食品對DNA 內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行檢測，操作流程簡便快捷，適用于食品溯源及防偽的快速檢測。

4 結(jié)語

本研究的結(jié)果表明，外源DNA 在多數(shù)液態(tài)食品中的穩(wěn)定性較差，在保質(zhì)期之內(nèi)就會降解完全。殼聚糖、殼寡糖和精胺等聚陽離子化合物可大大提高DNA 在液態(tài)食品中的穩(wěn)定性，其中分子量最大的殼聚糖對DNA 的保護(hù)效果最好，可以維持室溫下大部分液態(tài)食品中外源DNA 的含量長期保持不變。此外，由于殼聚糖為天然的多糖分子，無毒無害且具有多種生理功能，極其適合應(yīng)用于食品當(dāng)中。

DNA 可攜帶大量序列信息，在不同品牌、批次的產(chǎn)品中加入極少量不同序列的DNA 就可在不影響食品風(fēng)味和品質(zhì)的情況下建立信息完善的食品溯源體系。并且，由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 具有高特異性、高通量檢測等特點(diǎn)，可快速同時(shí)進(jìn)行大批量產(chǎn)品的檢測。因此，通過將DNA-殼聚糖復(fù)合物加入到液態(tài)食品中作為食品溯源內(nèi)標(biāo)物具有十分廣闊的應(yīng)用前景。