趙科 郭兆元 羅敏 徐文霞 劉源 任靜,*

(1 抗生素研究與再評價四川省重點實驗室，四川抗菌素工業(yè)研究所，成都大學(xué)，成都 610052；2 成都理工大學(xué)，成都 610059)

格列美脲(glimepiride, GM)是近年開發(fā)的臨床評價最優(yōu)的磺脲類藥物，具有高效、長效、治療劑量少、不良反應(yīng)小等諸多優(yōu)點，臨床上應(yīng)用廣泛除了降血糖的作用外[1-2]，有研究報導(dǎo)其有可以抑制人乳腺癌細胞增殖的作用[3]。但是格列美脲溶解性低，影響了其在體內(nèi)的口服吸收；而包合材料β-環(huán)糊精(β-CD)的衍生物羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)熱穩(wěn)定性強，水溶性好，對腎臟無毒性，對黏膜和肌肉幾乎沒有刺激性，溶血作用低，是目前最有前景的藥物載體材料之一[4]。因此，可以采用制劑手段，制備格列美脲包合物以提高藥物的溶解性并改善其生物利用度[5]。

為了易于操作便于工業(yè)化生產(chǎn)，本文采用GM與HP-β-CD通過研磨的方式進行包合，使兩者緊緊包合在一起，并通過Box-Behnken響應(yīng)面法(Box-Behnken design response surface methodology, BBD-RSM)優(yōu)化格列美脲HP-β-CD片的處方，以期得到最佳處方，且能為格列美脲片的進一步開發(fā)奠定良好的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器

GM對照品(批號：100674-201102，中國食品藥品檢定研究院)，GM原料藥(批號：140132-319334，武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司)；乳糖Flow-100(Lactose Flow-100，德國Meggle公司)，微粉硅膠和羧甲基淀粉鈉(湖州展望藥業(yè)有限公司)，HP-β-環(huán)糊精(武漢諾梵生物科技有限公司)，微晶纖維素、聚維酮K30、硬脂酸鎂(安徽山河藥用輔料股份有限公司)，羥丙基甲基纖維素(上?？房蛋录夹g(shù)有限公司)，其他輔料均為藥用級；甲醇、乙腈為色譜純，其他化學(xué)試劑均為分析純。

LC-10A高效液相色譜儀(含LC-10AT泵和SPD-10A檢測器，日本島津公司)；2000傅立葉紅外波譜儀(美國PerkinElmer公司)；BS224S型電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；SHZ-22水浴恒溫振蕩器(江蘇省太倉縣醫(yī)療器械廠)；TDP-5T型單沖壓片機(上海超億制藥機械設(shè)備有限公司)；CJY-2C型片劑脆碎硬度測定儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)；RC806D溶出試驗儀(天津市天大天發(fā)科技有限公司)。

1.2 方法學(xué)驗證

1.2.1 色譜條件

通過查閱GM有關(guān)文獻[6-7]及預(yù)實驗確定其色譜條件：Hypersil BDS-C18柱(200mm×4.6mm, 5μm)，流動相為乙腈：0.1%磷酸二氫鈉(60:40)，檢測波長為228nm，流速為1.0mL/min，進樣量為20μL，柱溫為室溫。

1.2.2 溶液的配制

對照品溶液：精密稱取GM對照品置于容量瓶中，加適量80%乙腈溶液，超聲溶解后，放冷，用80%乙腈稀釋定容至刻度，搖勻，即得400μg/mL GM對照品貯備液。

供試品溶液：精密稱取GM包合物片劑研磨粉置于容量瓶中，加適量80%乙腈溶液，超聲溶解后，放冷，用80%乙腈稀釋定容至刻度，搖勻，用0.45μm濾膜進行過濾，即得20μg/mL的供試品溶液。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

精密吸取適量對照品貯備液，配制成0.1、0.5、1.0、5.0、10、20、40和80μg/mL對照品溶液，進樣測定，在波長228nm處用高效液相色譜儀測定其峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)進行線性回歸處理。

1.2.4 精密度

取濃度為20μg/mL的GM對照品溶液，在相同條件下，連續(xù)進樣6次，測定其峰面積，考察方法的精密度。

1.2.5 重復(fù)性

按“1.2.2”項下GM供試品溶液的配制方法，在相同條件下，平行制備6份樣品，測定其峰面積，考察方法的重復(fù)性。

1.2.6 穩(wěn)定性

取濃度為20μg/mL的GM對照品溶液和20μg/mL的供試品溶液，在室溫條件下保存，分別于0、1、2、4和6h測定其峰面積，考察溶液的穩(wěn)定性。

1.2.7 回收率

分別配制16、20和24μg/mL的GM對照品溶液，依次稱取處方量的輔料至9個25mL的容量瓶中，分別加入高、中、低濃度對照品溶液，每種濃度分別制備3份，按供試品制備方法操作，取續(xù)濾液進樣測量其峰面積，按對照品溶液峰面積計算GM的含量并求得其回收率。

1.3 處方制備

1.3.1 包合物的制備

參照文獻[8-10]先稱取原料藥和包合材料用研缽進行研磨包合，再稱取相關(guān)輔料，用等量遞加的方式進行研磨混勻，以保證本品含量均勻度符合規(guī)定。

1.3.2 GM普通片及環(huán)糊精包合物片劑的制備

普通片制備通過過篩方式先將處方量的API與乳糖采用等量遞加法過65目篩混合均勻，再依次加入其余輔料混合均勻，加入黏合劑制成軟材，過24目篩制粒，濕顆粒在50℃干燥40min，過24目篩整粒，加入潤滑劑混合均勻，調(diào)節(jié)裝量在200mg左右，調(diào)節(jié)硬度60N左右，壓片。GM包合物片劑制備采用研磨法先將處方量API與HP-β-CD加入研缽，充分研磨攪拌。然后根據(jù)等量遞加法加入其他輔料研磨攪拌均勻，加入黏合劑制成軟材，過24目篩制粒，濕顆粒在50℃干燥 40min，過24目篩整粒。取干顆粒加入潤滑劑，混合均勻，調(diào)節(jié)裝量在200mg左右，調(diào)節(jié)硬度60N左右，壓片(原輔料均已提前過80目篩)。

1.4 處方優(yōu)化

1.4.1 處方單因素實驗

分別以不同的稀釋劑比例、黏合劑種類、黏合劑濃度、崩解劑比例和潤滑劑比例進行單因素實驗，通過測定其累積溶出度使用f2因子比較不同處方間的差異(50≤f2≤100時，認為兩條曲線相似或等同)。

1.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計

通過單因素實驗結(jié)果，以溶出度為響應(yīng)值，稀釋劑比例(A)、黏合劑濃度(B)和崩解劑比例(C)為因變量進行3因素3水平的BBD-RSM實驗優(yōu)化(表1)。通過Design Expert 8.0.6.1軟件對數(shù)據(jù)進行結(jié)果分析，模型驗證得出GM環(huán)糊精包合物的最優(yōu)條件。

表1 BBD選擇的變量編碼及其水平Tab. 1 Level and code of variables chosen for box-behnken design

1.5 GM包合物驗證

1.5.1 包合物的表征

用溴化鉀壓片法，對GM、HP-β-CD、GM/HP-β-CD物理混合物和GM/HP-β-CD包合物，分別在400～4000cm-1的波數(shù)范圍進行紅外吸收光譜測定。

1.5.2 溶解度的測定

稱取過量的GM，GM/HP-β-CD物理混合物，GM/HP-β-CD包合物樣品分別置于15mL試管中，加10mL水配成過飽和溶液，置于水浴恒溫搖床振搖[(25±0.5)℃，120r/min] 48h，用0.45μm的微孔濾膜迅速過濾，將濾液經(jīng)流動相稀釋適當(dāng)倍數(shù)后于228nm處由HPLC測定，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，經(jīng)計算得到GM，GM/HP-β-CD物理混合物，GM/HP-β-CD包合物樣品在水中的溶解度。

1.6 片劑的質(zhì)量檢查

按照中國藥典四部[11]的要求依次對片劑的片重差異、脆碎度、溶出度及含量均勻度進行檢查。

1.7 片劑的體外釋放

采用重蒸水、pH7.8的磷酸鹽緩沖液和0.02%的三羥基氨基甲烷為溶出介質(zhì)，量取溶出介質(zhì)900mL置于溶出杯內(nèi)，待溶出介質(zhì)溫度恒定在37.0℃后，取6片供試品分別投入6個溶出杯內(nèi)，設(shè)置轉(zhuǎn)速75r/min，分別于5、15、30、60和90min時間點取樣適量并補充相同體積的同溫釋放介質(zhì)，用0.45μm濾膜進行過濾，取續(xù)濾液進高效液相色譜儀進行含量分析，計算累積溶出度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

響應(yīng)曲面模型的回歸方程式和顯著性統(tǒng)計用Design Expert 8.0.6.1 軟件進行計算和分析。單因素實驗結(jié)果采用直觀分析和方差分析，考察稀釋劑比例、黏合劑種類、黏合劑濃度、崩解劑比例和潤滑劑比例對其的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC法測定GC含量的方法學(xué)驗證

標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=65248x+589.7(R2=0.9999,n=8)，線性范圍0.1～80μg/mL；精密度實驗RSD為0.86%(n=6)，重復(fù)性實驗RSD為1.02%(n=6)；穩(wěn)定性實驗對照品與供試品RSD分別為0.96%和1.21%；低、中和高3種劑量平均回收率分別為98.85%、100.63%和99.74%，RSD分別為1.19%、0.48%和0.85%(n=3)。結(jié)果表明，建立的HPLC含量測定方法符合試驗測定要求。

2.2 單因素實驗結(jié)果與分析

2.2.1 稀釋劑比例的影響

使用初選處方輔料的稀釋劑-乳糖和MCC，控制裝量為200mg，按照2:1、5:1和8:1的比例配制處方，根據(jù)片劑的累積溶出度為考察指標(biāo)進行篩選，結(jié)果見圖1a。

結(jié)果表明，乳糖和MCC的比例對片劑的體外釋放有顯著影響，f2(2:1、5:1)和f2(2:1、8:1)分別為35.44和43.57。乳糖為水溶性輔料，MCC為水不溶性輔料，乳糖比例越大理論上溶出越快，但由于親水性乳糖比例過大會導(dǎo)致片劑結(jié)合過于致密，反而會影響藥物前期和中期的釋放。

2.2.2 黏合劑種類的影響

使用初選處方輔料的黏合劑-淀粉漿、HPMC、PVP，考察其種類對片劑累積溶出度的影響，結(jié)果見圖1b。

結(jié)果表明，黏合劑種類對片劑的體外釋放有顯著影響，f2(淀粉漿，PVP)和f2(PVP、HPMC)分別為25.15和32.11。淀粉漿作為一種傳統(tǒng)使用的黏合劑，由于其糊化會導(dǎo)致藥物包裹在其中，造成后期藥物不易完全釋放，因此在目前藥物開發(fā)中使用的越來越少；HPMC由于在冷水中不易分散，而在熱水中溶解性又較差，因此配制過程先要在熱水中分散，隨后冷卻后再溶解，過程較為繁瑣且在此處方中效果不及PVP。綜合考慮，固化黏合劑為PVP。

2.2.3 黏合劑濃度的影響

通過篩選黏合劑種類，確定使用PVP為黏合劑，現(xiàn)進一步對其濃度進行篩選，現(xiàn)擬定5%、10%、15% 共3種濃度為比較對象，根據(jù)片劑的累積溶出度為考察指標(biāo)進行篩選，結(jié)果見圖1c。

結(jié)果表明，黏合劑濃度對片劑的體外釋放有顯著影響，f2(5%、15%)和f2(10%f15%)分別為34.94和34.42。使用15%PVP其溶出度較其他兩種都低，且采用PVP 15%黏合劑制軟材，黏合劑溶解較慢，后期釋放較慢。而5%及10%的PVP總體差別不大，因此需進一步優(yōu)化得出最佳處方。

2.2.4 崩解劑比例的影響

使用初選處方輔料的崩解劑-CMS-Na，考察其占處方總比例大小對片劑質(zhì)量的影響?，F(xiàn)擬定3種比例2.5%、5%和7.5%為比較對象，將片劑的累積溶出度作為考察指標(biāo)進行篩選，結(jié)果見圖1d。

結(jié)果表明，在擬定3種比例7.5%、5%、2.5%中，使用2.5%的崩解劑其溶出速率較其他兩種都慢一點，f2(2.5%，5%)和f2(2.5%、7.5%)分別為39.60和37.50。隨著崩解劑比例提高至5%，片劑的溶出體現(xiàn)出明顯改善的趨勢，但比例繼續(xù)增大至7.5%，溶出的變化不是很明顯，因此需進一步優(yōu)化得出最佳處方。

2.2.5 潤滑劑微粉硅膠的影響

使用初選處方輔料的潤滑劑-微粉硅膠，考察其添加對片劑質(zhì)量的影響。根據(jù)片劑的累積溶出度為考察指標(biāo)進行篩選，結(jié)果見下圖1e。

結(jié)果表明，微粉硅膠的比例對體外釋放無顯著影響，f2(0.5%、1%)和f2(1%、1.5%)分別為78.29和75.98。但考慮到添加微粉硅膠可以改善流動性且溶出度高，所壓片劑硬度適宜，崩解時限也相對較快等特點；綜合考慮固化微粉硅膠比例為1%。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

2.3.1 BBD-RSM 實驗設(shè)計結(jié)果

圖1 不同影響因素的釋放曲線Fig.1 Dissolution curves of different in fluencing factors

根據(jù)單因素實驗結(jié)果表明：稀釋劑比例(A)、黏合劑濃度(B)和崩解劑比例(C)是影響藥物釋放的主要因素，以其作為自變量，溶出度為響應(yīng)值進行3因素3水平BBD-RSM實驗優(yōu)化(表1)。保持各處方API 2mg，黏合劑采用PVP，潤滑劑占處方1%的量，用 Design-Expert 8.0.6進行實驗設(shè)計，共17組處方組成，制備包合物片劑并測定各處方在15min的溶出度，結(jié)果見表2。

表2 BBD試驗結(jié)果的實測值Tab. 2 Box-Behnken design matrix along with test values

2.3.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

經(jīng)過模型擬合確定最優(yōu)模型為二次多項式，模型具有顯著性，失擬項無顯著性，具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過實驗得到的模型回歸方程為：Y=79.96+5.40A-4.60B+3.65C-3.55AB+2.00AC-3.80BC-5.51A2-3.06B2-2.60C2(R2=0.9483；模型：F=14.27，P=0.0010，有意義；失擬項：P=0.1636，無意義)。影響藥物溶出的主次因素是：稀釋劑比例(A)＞黏合劑濃度(B)＞崩解劑比例(C)，除了因素A、B和C外，A2、B2以及交互項AB和BC都是影響溶出度的顯著因素。包合物片劑溶出度的等高圖及響應(yīng)面3D圖譜如圖2所示。從圖中可以看到，稀釋劑乳糖和微晶纖維素的比例對片劑溶出度的影響最大，隨著乳糖比例的提高，溶出度先急速增大，后又慢慢減小。其次，黏合劑濃度和崩解劑比例對溶出度也有較為顯著的影響，隨著黏合劑濃度提高，溶出度先緩慢增大然后顯著減小；隨著崩解劑比例增大，溶出度先升高后趨于平緩。通過直觀圖得出的結(jié)果與模型方程得到的結(jié)果一致，這也反映了模型方程的可靠。

2.3.3 優(yōu)化條件的驗證試驗

采用 Design-Expert V8.0.6.1軟件對方程中Y求解，得到HP-β-CD格列美脲片的理論最佳條件為：稀釋劑-乳糖和MCC的比例為7.37:1，黏合劑-PVP的濃度為6%，崩解劑-CMS-NA的比例為6.45%。為了簡化實際操作的難度，HP-β-CD格列美脲片最佳條件修正為稀釋劑-乳糖和MCC 的比例為7.5:1，黏合劑-PVP的濃度為6%，崩解劑-CMS-NA的比例為6.5%。此條件下進行3組平行實驗，所得溶出度的平均值為88.13%(n=3)，而回歸方程所得的溶出度理論預(yù)測值為88.69%，兩者相對誤差為0.64%，說明運用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

2.4 包合物的驗證結(jié)果

2.4.1 紅外吸收光譜

由圖3所示，GM(a)在3369～3288cm-1為N-H拉伸振動的吸收峰(如3366和3291cm-1處的峰)，在1708～1673cm-1處為格列美脲分子內(nèi)的羰基伸縮振動吸收峰(如1706和1673cm-1處的峰)，在1345～1153cm-1處為分子內(nèi)磺酰胺基團的不對稱伸縮振動吸收峰(如1340和1153cm-1處的峰)；HP-β-CD(b)在3500～3300cm-1處為O-H拉伸振動峰(如3429cm-1處的峰)，在3000～2800cm-1處為CH-CH2的伸縮振動峰(如2934cm-1處的峰)；而HP-β-CD/GM物理混合物(c)的峰為a和b峰的簡單疊加，GM和HP-β-CD的特征吸收峰均沒有變化；HP-β-CD/GM包合物(d)的峰同a、b和c相比沒有太大變化，說明骨架結(jié)果并沒有發(fā)生變化，但在3369～3288cm-1處的峰明顯加寬，且HP-β-CD在3429cm-1處的峰在(d)藍移到了3348cm-1處，這是由于包合作用使GM的特征峰被HP-β-CD的峰減弱，同時HP-β-CD峰的環(huán)境改變導(dǎo)致振動頻率降低。在a上1708～1673cm-1和1345～1153cm-1處的峰在d上只可觀察到1345～1153cm-1處的峰，1708～1673cm-1處的峰在d上消失，這是因為形成包合物后，由于GM分子較大使得HP-β-CD只能部分包合還有一部分基團未被包合物包合進去，進一步說明確實形成了穩(wěn)定的包合物。

2.4.2 水溶性測定

按溶解度的測定項下方法操作，經(jīng)帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線后得出實驗結(jié)果如表3所示。由表3可知，GM原料藥的溶解度僅為1.36μg/mL，GM/HP-β-CD物理混合物的溶解度提高了20多倍，而GM/HP-β-CD包合物在水中的溶解度提高了50多倍。事實證明，GM被水溶性極好的HP-β-CD包合后，水溶性得到了極大的改善。

圖2 影響因素對藥物溶出度影響的等高線圖與3D圖譜Fig.2 contour map and 3D map of in fluencing factors on dissolution of drugs

2.5 片劑的質(zhì)量檢查結(jié)果

2.5.1 片重差異的檢查

取供試品20片，精密稱定總重量，求得平均片重后，再分別精密稱定每片的重量，每片重量與平均片重比較，計算重量差異，結(jié)果見表4。

2.5.2 脆碎度的檢查

取供試品32片洗耳球吹去粉末后稱得總重，100轉(zhuǎn)后洗耳球吹去粉末后再稱得總重，計算減失重量，結(jié)果見表4。

2.5.3 含量均勻度的檢查

取供試品1片置于50mL的容量瓶中，加1～2mL重蒸水，超聲使藥片崩解，加80%乙腈適量，使溶解后，定容搖勻，即得。用0.45μm的濾膜過濾后，取續(xù)濾液作為供試品溶液，進高效液相色譜儀分析其含量，結(jié)果見表4所示。

2.5.4 溶出度的檢查

取本品依照中國藥典(2015版)采用漿法測定GM片劑溶出，轉(zhuǎn)速為75r/min，900mL pH7.8磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer, PBS)為溶出介質(zhì)，15min取溶液過0.45μm的濾膜后取續(xù)濾液用HPLC分析，考察溶出度，結(jié)果見表4。

圖3 GM(a)、HP-β-CD(b)、HP-β-CD/GM物理混合物(c)和HP-β-CD/GM包合物(d)紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of glimepiride (a), HP-β-CD (b), HP-β-CD/glimepiride physical mixture (c), HP-β-CD/glimepiride inclusion complex (d)

表3 樣品的水溶性測定結(jié)果(n=3)Tab. 3 Determination of water solubility of samples (n=3)

由表4可知，制備的GM普通片及環(huán)糊精包合物片劑在含量均勻度、片重差異、脆碎度和溶出度方面均滿足2015版藥典要求。

2.6 體外釋放曲線的繪制

采用重蒸水、pH7.8的磷酸鹽緩沖液和0.02%的三羥基氨基甲烷為溶出介質(zhì)，分別取格列美脲片和優(yōu)化后的HP-β-CD格列美脲片，按片劑的體外釋放項下方法進行含量測定，計算累積釋放度，結(jié)果見圖4。

由圖4分析可知，在PBS和三羥基氨基甲烷的釋放介質(zhì)中，兩種格列美脲片釋放結(jié)果差異較小，90min時兩者均已達到85%以上，相對較為穩(wěn)定；而在水中兩者的釋放結(jié)果相差較大，90min時格列美脲片才達到60%，而HP-β-CD格列美脲片的釋放已達93.28%，明顯優(yōu)于格列美脲片。作為難溶性藥物，體外與體內(nèi)釋放具有一定的相關(guān)性，提升其體外釋放意義重大；在0.02%的三羥基氨基甲烷溶液中，兩者區(qū)分力最小，而在水中區(qū)分力最大，因此可以選擇重蒸水作為篩選最優(yōu)處方的釋放介質(zhì)。

3 討論

HP-β-CD為水溶性材料，過大的溶解度導(dǎo)致使用飽和溶解度法不能很好地進行制備，而本文通過研磨法制備包合物具有操作簡便、成本低廉和易于工業(yè)化生產(chǎn)等特點。通過響應(yīng)面法對HP-β-CD格列美脲片處方進行優(yōu)化，得到的優(yōu)化模型預(yù)測性較好，其圖形直觀，且相比正交設(shè)計在實驗條件尋優(yōu)過程中，可以連續(xù)地對實驗的各個水平進行分析?；谶@些優(yōu)勢，響應(yīng)面法將在今后的處方設(shè)計與優(yōu)化過程中發(fā)揮越來越重要的作用。

表4 格列美脲片的質(zhì)量檢查結(jié)果Tab. 4 Quality controlled results of glimepiride table(n=3)

圖4 處方在3種介質(zhì)中的溶出曲線Fig.4 Dissolution curves of the prescription in three media

測定結(jié)果表明，HP-β-CD與GM形成的包合物成功地改善了溶解性，從而有望改善其生物利用度。在體外釋放試驗中，普通片和包合片劑在水溶液中的區(qū)分力較大而在其余兩種介質(zhì)中區(qū)分力較小，這是因為GM在0.02%的三羥基氨基甲烷溶液中的溶解度大，其溶解速率較快；而在pH7.8的磷酸鹽緩沖液中，GM的溶解度仍是在水中的近30倍，加上兩種片劑均提高了其溶解度，因此普通片與包合片劑并無大的區(qū)別；同理，在中性及酸性環(huán)境中，由于溶解度小，GM很依賴于制劑技術(shù)的改善。此前，由于檢測條件的限制，規(guī)格較小的藥物都采用小杯法進行溶出度的檢測，但難溶性藥物采用常規(guī)溶出介質(zhì)很難達到漏槽條件，因此格列美脲片不得不采用三羥基氨基甲烷溶液這種專有介質(zhì)，但這是以犧牲區(qū)分力為代價的。隨著制劑技術(shù)的進步與HPLC的普及，微量的準(zhǔn)確檢測變得可能，除中國藥典外，各國藥典標(biāo)準(zhǔn)均無小杯法，是否停止采用小杯法以便同國際接軌，值得商榷。本文的研究結(jié)果將為GM制劑的開發(fā)奠定良好的理論基礎(chǔ)。