李圩田 王佳雯 洪閣 毛麗娜 劉天軍,*

(1 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津 300192；2 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)

光動力抗菌化學(xué)療法(photodynamic antimicrobial chemotherapy, PACT)[1]是一種新型的物理化學(xué)細菌滅活方法，目前已經(jīng)成為針對細菌、真菌和病毒感染特別是耐藥菌感染最有前途的新的治療方式之一[2-4]，其關(guān)鍵是光敏劑。光敏劑[5]是一類具有光吸收能力強、較高的三線態(tài)轉(zhuǎn)移效率，可與氧通過能量轉(zhuǎn)移作用產(chǎn)生活性氧的化合物。它可以選擇性地富集在特定的組織，在可見光或紫外光的激發(fā)下，產(chǎn)生光動力殺傷作用，從而起到殺菌的功效。并非所有的光敏劑具有抗菌活性，只有光敏劑進入細菌內(nèi)部才能通過光動力殺菌。喹諾酮類藥物[6-8]作為抗菌藥物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，它的抗菌機制是通過選擇性地抑制細菌DNA促旋酶起到抑菌殺菌作用，然而臨床數(shù)據(jù)揭示其抗菌效果的同時其光敏毒副作用常被提及，那么喹諾酮類藥物是否真的有光敏抗菌活性？若有將會是一件好事，尤其在細菌耐藥性[9-12]的報道日益增多的今天。本文將以臨床用藥GFLX和SPFX為例探索喹諾酮類化合物的光敏抗菌活性。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

GFLX購于上海畢得醫(yī)藥科技有限公司；SPFX購于源葉生物公司，以上化合物純度均≥98%；二甲基亞砜購于Sigma(美國)；胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂均購于Oxoid(英國)；氯化鈉購于天津市江天化工技術(shù)有限責(zé)任公司，肉湯培養(yǎng)基用相應(yīng)試劑由本實驗室配制。

1.2 主要儀器與設(shè)備

超凈工作臺(SW-CJ-IFD蘇州)；激光器(7404 Intense，美國)；Maisheng Dc Power Supply(MP6010D，中國)；多功能酶標(biāo)儀(Thermo 3001，美國)；離心機(MIRRO22，英國)；Millipore 純水儀(Mili-Q Biocel，美國)；細菌培養(yǎng)箱(SANY，日本)；立式高溫高壓滅菌鍋(MJ-78A 杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司)；恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZWY-103B，上海智誠)。

1.3 實驗菌株

本實驗所用MRSA(臨床分離菌株)作為革蘭陽性菌的代表，P. aeruginosa(臨床分離菌株)，E. coli(臨床分離提取)作為革蘭陰性菌的代表，均來自解放軍304醫(yī)院。

1.4 細菌的培養(yǎng)

1.4.1 液體培養(yǎng)基的配置

蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、氯化鈉5g、蒸餾水500mL攪拌溶解，經(jīng)121℃高壓滅菌30min后，在0～4℃冷暗處備用。

1.4.2 固體培養(yǎng)基配置

瓊脂粉7.5g、蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、氯化鈉5g、蒸餾水500mL攪拌溶解經(jīng)121℃高壓滅菌30min后，放冷后，在無菌超凈工作臺上，將混合溶液倒入固體培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)基大約是15～20mL，使之均勻分布，待冷卻后，將其放入冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 喹諾酮類化合物的的紫外吸光譜研究

分別移取GFLX、SPFX的母液50μL置于不同的5mL容量瓶中，各自用0.01mol/L的鹽酸溶液定容至5mL并超聲分散，分別得到相應(yīng)濃度為0.01mmol/L的GFLX、SPFX化合物待測液。各待測液室溫靜置，在波長200～700nm范圍內(nèi)進行紫外光譜掃描，并選擇其合適的光照波長。

1.6 照射光波長的影響

光源：650nm激光器， 450nm LED，365nm LED，白光來源于日光燈。實驗前所有光源的光功率經(jīng)過功率計核準(zhǔn)。用LB液體培養(yǎng)基，通過二倍濃度稀釋法將藥物配置成相應(yīng)梯度濃度，37℃下與菌液(106CFU/mL)在暗處孵育30min，然后用不同波長的光照射(650nm、450nm、365nm，白光)，光照功率均為1.5mW，光照時間30min作為光毒組(暗毒組不進行光照)，通過測定GFLX、SPFX化合物的MIC與MBC，評價其光動力抗菌活性與有效工作波長。

首先，在37℃無菌搖床條件下避光孵育30min，然后在相應(yīng)光照條件下光照30min(暗毒組，不進行光照)。然后，分別吸取100μL該96孔微量測試板中不同梯度濃度藥物和細菌的混合液，將混合液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基上。隨后，將LB固體培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)箱條件下避光孵育，24h后評估，菌落數(shù)與對照組相比明顯減少且空白組沒有菌落生長為MIC,菌落個數(shù)小于等于5的為MBC。MIC、MBC的數(shù)值越小說明藥物的抗菌活性越好。

MIC和MBC的測量方法具體如下：以GFLX為例子。首先在96孔平底板中，分別向每個孔中加入180μL不同梯度濃度的GFLX和20μL的MRSA并混合均勻?？瞻捉M為200μL的液體培養(yǎng)基，對照組為180μL的LB液體培養(yǎng)基和20μL的MRSA混合液，進行了3組獨立實驗。首先，在37℃無菌搖床條件下避光孵育30min，然后在相應(yīng)光照條件下光照30min(暗毒組，不進行光照)。然后，分別吸取100μL該96孔微量測試板中不同梯度濃度藥物和細菌的混合液，將混合液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基上。隨后，將LB固體培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)箱條件下避光孵育，24h后評估，菌落數(shù)與對照組相比明顯減少且空白組沒有菌落生長為MIC，菌落個數(shù)小于等于5的為MBC。MIC、MBC的數(shù)值越小說明藥物的抗菌活性越好。

1.7 SPFX、GFLX單線態(tài)氧的測定

據(jù)文獻報道[13-15]，喹諾酮類化合物可以產(chǎn)生多種活性氧物質(zhì)，包括1O2、O2-、OH-等其中單線態(tài)氧在人體中有非常重要的化學(xué)反應(yīng)活性。我們基于文獻方法[16-18]，以1,3-二苯基異苯并呋喃(DPBF)作為單線態(tài)氧捕獲劑，測定了SPFX、GFLX在的單線態(tài)氧產(chǎn)生效率。

具體步驟為：(1)分別配置好0.02mmol/L DPBF和相應(yīng)藥物；(2)將配置好的藥物(100μL)和DPBF(100μL)混合，并設(shè)計兩個對照組；(3)光照單獨對DPBF的消耗影響及對藥物的影響，以及光照對DPBF與藥物混合溶劑影響；(4)檢測不同光照時間對DPBF在410nm處吸收光度值影響。

1.8 光照功率的影響

1.8.1 GFLX抗菌MIC、MBC值的能量依賴性

用LB液體培養(yǎng)基，通過二倍濃度稀釋法將藥物配置成相應(yīng)梯度濃度，37℃下與菌液(106CFU/mL)暗孵育30min，選用450nm的光，在1.5、3、4.5和6mW等不同功率下，分別光照30min，測定GFLX的MIC與MBC，評價喹諾酮類化合物的光動力抗菌活性，選擇合適的光照功率。

1.8.2 GFLX在MIC值處不同光能量密度對MRSA的PACT作用

取對數(shù)生長期的MRSA細菌，進行離心，并用PBS洗菌，然后重懸細菌，用紫外分光光度計測定其A值，直到A600=0.7，然后稀釋菌液10倍，取稀釋的菌液100μL，和配置好的GFLX溶液100μL，使得混合后藥物濃度為0.62μg/mL。37℃下，在96孔板暗孵育30min。用450nm LED燈照射，光照能量密度分別為1、2、4、6和8J/cm2，然后分別吸取不同能量密度下的藥物與菌液混合液，進行10倍梯度稀釋，分別取稀釋度為10-4、10-5、10-6和10-7的藥物與菌液的混合液，并迅速涂固體培養(yǎng)基，每個梯度下涂3塊板，37℃烘箱下培養(yǎng)，24h后菌落計數(shù)。來表征不同激光能量密度對MRSA的PACT作用。

1.9 GFLX、SPFX對3T3細胞毒性

據(jù)文獻報道[19]，研究GFLX、SPFX對3T3細胞毒性是非常有意義的,因此收集對數(shù)生長期的3T3細胞，在DMEM(含10%的血清)培養(yǎng)液中以1×104個細胞/孔的密度接種于96孔板中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；隨后吸出培養(yǎng)液，分別將不同濃度的GFLX和SPFX加入到每孔中，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30min。隨后將其分組進行光毒性與暗毒性研究。光照組采用波長為650nm的光(P=2.3mW、30min、4J/cm)照射96孔板30min；暗毒組在相同條件下避光30min；隨后將光毒性與暗毒性的細胞96孔板分別置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24h。然后每孔中加入50μL MTT溶液(1mg/mL)，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中作用4h。除去上清液，每孔中加入DMSO溶液150μL，震蕩搖勻，通過酶標(biāo)儀在570nm波長處檢測各孔吸光度(A)值。3T3細胞存活率按以下公式計算：細胞的存活率(%)=給藥組A值/對照組的A值×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 GFLX、SPFX的紫外吸光譜研究

圖1給出了GFLX、SPFX的吸收光譜，它們在275～300nm處有很強的吸收峰，GFLX在374nm處也有一個較強的紫外吸收峰。全波長光譜對GFLX、SPFX在光照波長選擇上有一定的指導(dǎo)作用，因此，在“2.2”項中，本文探討了365、450、650nm、白光及暗毒組等不同波長條件下GFLX、SPFX的抗菌活性。

2.2 GFLX、SPFX在不同波長光照射下的MIC、MBC值

圖1 GFLX、SPFX紫外吸收圖譜Fig.1 GFLX, SPFX UV absorption spectrum

由于SPFX藥物在365nm有較強的吸收，本研究探討了SPFX在365nm的光動力滅菌活性，結(jié)果表明在365nm光的照下空白對照組的A600=0.4，而暗毒組的A600=0.7，說明365nm處光照已經(jīng)具有殺菌作用。紫外光(200～400nm)可以獨立滅菌，同時對細胞也具有一定的殺傷作用，在此區(qū)間進行研究意義不大，因此我們的研究選取可見光區(qū)，包括藍光(450nm)，紅光(650nm)以及白光(長波混合光)進行研究，盡管在此區(qū)間GFLX與SPFX的吸收光子能力較弱且相互間有差異，這會致使其光動力抗菌活性的差異，但研究結(jié)果具有一定的借鑒意義。

本文探討了450nm、650nm和白光等不同光照條件下，SPFX、GFLX對MRSA、P. aeruginosa、E.coli的抗菌活性(表1～2)，結(jié)果表明，在光照條件下，喹諾酮的抗菌活性的確有一定程度的提高，遠優(yōu)于暗毒組；且用不同波長的光照射，對于同一種細菌其MIC/MBC值均有一定的差別。表1說明GFLX在450nm的光照下其抗菌活性略優(yōu)于其它光照條件下。由于GFLX為第四代喹諾酮類抗菌藥物，為新一代抗菌喹諾酮藥物。因此，本文選擇450nm處光照條件下進行下近一步深入研究。

2.3 GFLX、SPFX單線態(tài)氧測定

圖2表明，伴隨著光照時間的延長，光照對DPBF的影響與光照對藥物SPFX、GFLX產(chǎn)生單線態(tài)氧對DPBF的影響趨勢一樣，說明了光照SPFX、GFLX產(chǎn)生較弱的單線態(tài)氧。這與表1～2的實驗結(jié)果一致，即光照可以增加喹諾酮藥物的抗菌活性，但提升有限。

2.4 GFLX抗菌MIC、MBC的值的能量依賴性

表1 GFLX在不同波長下的抗菌MIC、MBC的值/(μg/mL)Tab. 1 Antibacterial MIC and MBC values of GFLX at different wavelengths/(μg/mL)

表2 SPFX在不同波長下的抗菌MIC、MBC的值/(μg/mL)Tab. 2 Antibacterial MIC and MBC values of SPFX at different wavelengths/(μg/mL)

圖2 DPBF作為單線態(tài)氧捕獲劑在不同溶液狀態(tài)下隨時間變化圖Fig.2 Graph of DPBF as a singlet oxygen trap over time in different solution states

表3 GFLX在450nm波長下的抗菌MIC和MBC(μg/mL)Tab. 3 Antibacterial MIC and MBC of GFLX at 450nm wavelength(μg/mL)

圖3 GFLX在450 nm波長下光穩(wěn)定性研究Fig.3 Photostability study of GFLX at 450nm wavelength

表3是GFLX在450nm光照射下對于3種細菌的MIC、MBC隨著光照能量的變化，結(jié)果表明隨著光照能量的增大。對于革蘭陽性菌MRSA和革蘭陰性菌E. coli，其MIC、MBC值都有一定程度的增大，對于革蘭陰性菌P. aeruginosa，MIC值略有增加，而MBC總體減小。這與強光敏抗菌藥物的行為有很大差異。這種差異可能源于GFLX的濃度減少，然而圖3表明GFLX在12J/cm2以內(nèi)照射光譜變化不大，對于光照保持良好的穩(wěn)定性，并無光分解，因而藥物濃度相對穩(wěn)定。因而本文認為MIC和MBC的反常變化源于喹諾酮類藥物弱的光敏抗菌活性以及光照引起細菌培養(yǎng)液的溫度少幅度提升帶來細菌的增殖，這進一步表明GFLX不適合光敏抗菌用。

2.5 GFLX在MIC值處不同激光能量密度對MRSA的PACT作用結(jié)果

進一步探究光能量密度對于細菌的菌落數(shù)量的影響，圖4說明了能量密度由2～4J/cm2光照后，細菌存活數(shù)量迅速減少，起到了強烈的光動力抗菌活性；隨著能量密度的增大，在能量密度為4J/cm2，細菌的菌落數(shù)保持一定的數(shù)量基本不在減少，這一說明喹諾酮類藥物的光動力滅菌效能不高，盡管臨床上這類藥物有一定的光敏毒副作用，還不足以用于臨床殺菌。

2.6 SPFX、GFLX對3T3細胞毒性

圖5的MTT結(jié)果表明，當(dāng)GFLX、SPFX藥物濃度小于20μg/mL，光照對3T3細胞沒有表現(xiàn)出明顯的毒性，且光照組與暗毒組沒有明顯的差異，而藥物的抗菌MIC、MBC值遠小于20μg/mL，因此，在此條件下光動力抗菌是安全的。

圖4 不同光照能量密度對MRSA的PACT作用Fig.4 PACT effects of different light energy densities on MRSA

圖5 GFLX、SPFX對3T3細胞毒性圖Fig.5 GFLX and SPFX to 3T3 cytotoxicity

3 結(jié)論

通過SPFX，GFLX對MRSA、P.aeruginosa、E. coli光動力研究，對比了不同光照條件與暗毒組抗菌活性結(jié)果，得出光動力手段可以一定程度上增加GFLX和SPFX的抗菌活性，但提升有限，在此區(qū)間其光敏毒副作用有限，這類藥物不會傷及細胞，因而喹諾酮類藥物在臨床上不足以作為光敏抗菌藥物使用，相對安全。