臧國棟

（惠州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測中心，廣東 惠州 516008）

測量不確定度定義為表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)，它是測量結(jié)果質(zhì)量的指標(biāo)［1-3］.但由于測量誤差的存在，無法得到被測量的真值.測量不確定度就是反應(yīng)了測量誤差存在時對所測量值不能肯定的程度，是測量結(jié)果質(zhì)量的指標(biāo).在報(bào)告物理量測量的結(jié)果時，必須給出相應(yīng)的不確定度，一方面便于使用它的人評定其可靠性，另一方面也增強(qiáng)了測量結(jié)果之間的可比性.

氯霉素是一種酰胺醇類廣譜抗生素，因?yàn)槟芤种萍?xì)菌蛋白質(zhì)的形成而起到殺菌的作用，所以在水產(chǎn)品養(yǎng)殖中曾被廣泛使用，用于治療由傷寒桿菌、痢疾桿菌等引起的感染，但對造血系統(tǒng)有嚴(yán)重不良反應(yīng)，長期食用含有該藥物殘留的食品，將導(dǎo)致人體再生障礙性貧血癥，并可能引起人體體內(nèi)菌群失調(diào)及產(chǎn)生耐藥性，同時對消化系統(tǒng)也有損害［4-10］.根據(jù)農(nóng)業(yè)部235號公告，氯霉素在所有動物源食品中不得檢出［11］.目前，國內(nèi)關(guān)于氯霉素類藥物殘留的檢測方法的報(bào)道已比較多，包括酶聯(lián)免疫法［12］、氣相色譜-質(zhì)譜法［13］以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［14］等.其中高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高，成為氯霉素類藥物殘留檢測的重要方法，但對其不確定度的分析評定相關(guān)報(bào)道非常少，而且測量不確定度的來源也不夠全面，因測量誤差的客觀存在，我們無法得到被測量值的真值，而所得到的被測量值具有分散性，因而所有測量結(jié)果都毫無例外的具有不確定度.本研究依據(jù)農(nóng)業(yè)部781號公告-2-2006《動物源食品中氯霉素殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》［15］和JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》［16］著重對鰻魚中氯霉素殘留的測定進(jìn)行了分析評定.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent G6460三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國Agilent公司），配電噴霧離子源，配Agilent 1290超高效液相色譜儀；TGL-16M高速冷凍離心機(jī)（湘儀離心機(jī)公司）；EYELA N-1200BV-W旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化）；SC-8L-150數(shù)控固相萃取裝置（廣州智真生物公司），waters Oasis HLB固相萃取柱:500 mg，6 mL（美國Waters公司）；微孔濾膜:0.22 μm（天津津騰公司）；鰻魚（單位抽樣）.氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度99.0%（Dr.E公司）；甲醇、乙腈（色譜純、MERCK公司），正己烷、乙酸乙酯（色譜純，Amethyst Chemicals）試劑均為分析純中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司，實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q超純水.

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

氯霉素標(biāo)物儲備液:精確稱取氯霉素10mg于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18℃保存.

氯霉素標(biāo)物工作液:精確取上述儲備液適量，用流動相逐級稀釋制備成100ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃避保存.

氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)儲備液：取氘代氯霉素10mg于100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18℃保存.

氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)工作液：精確取上述儲備液適量，用流動相逐級稀釋制備成10ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃避保存.

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確量取氯霉素標(biāo)物工作液和氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)工作液適量，用流動相稀釋成氯霉素濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0和10ng/mL，氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)濃度為5.0 ng/mL的溶液，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定.

2.4 樣品處理

準(zhǔn)確稱取已均質(zhì)的鰻魚樣品5.00g于50mL離心管，加氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)工作液250μL，加乙腈5mL，4%氯化鈉溶液5mL，勻漿1 min，渦旋振蕩2min，15000 r/min離心10 min，吸取上清液到另一個50mL離心管中，重復(fù)提取一次.合并兩次提取液，提取液中加正己烷5mL，渦旋振蕩1min，5000 r/min離心10 min，棄上層液體，重復(fù)一次，加水飽和乙酸乙酯溶液5mL，渦旋振蕩2min，5000 r/min離心10 min，將上層溶液轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，重復(fù)提取一次.合并提取液，氮?dú)獯蹈?用水-乙腈（95:5）3ml溶解，加入已用10mL甲醇、10mL水預(yù)洗的固相萃取柱然后用3水洗柱兩次，用流動相4mL以1mL/min洗脫于15mL離心管中，然后加入水飽和乙酸乙酯溶液4mL，渦旋振蕩1min，5000 r/min離心5min，吸上層溶液，重復(fù)提取一次，合并提取液，氮?dú)獯蹈?用流動相1.0mL溶解殘留物，過0.22μm微孔濾膜于進(jìn)樣瓶，供液質(zhì)分析.

2.5 液相色譜條件

色譜柱:ZORBAX Eclipse PlusC18柱，2.1 mm×50 mm×1.8μm（Agilent公司）；柱溫:30℃；流速:0.4 mL/min；進(jìn)樣量:20μL；流動相:甲醇-水（50+50）.

2.6 質(zhì)譜條件

電離方式:電噴霧電離源（ESI），負(fù)離子模式掃描，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），監(jiān)測離子為：氯霉素320.6/152.2，320.6/256.9，氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)326.3/157.2，離子源溫度:350℃；氣體:氮?dú)?；干燥氣流?6L/min；霧化器壓力:310kPa；鞘氣溫度:350℃.

2.7 不確定度數(shù)學(xué)模型的建立

測量不確定度數(shù)學(xué)模型如下所示：

其中：X為試料中氯霉素的殘留量（μg/kg）；c為供試溶液中氯霉素的濃度（ng/mL）；V為溶解殘余物的體積（mL）；m為組織樣品質(zhì)量（g）.

3 不確定度評估

3.1 測量不確定度的來源

根據(jù)測量過程和數(shù)學(xué)模型分析，測定氯霉素的不確定度主要有幾個來源：①標(biāo)準(zhǔn)品配制引入的不確定度；②樣品稱量m引入的不確定度；③測量重復(fù)性的不確定度；④樣品定容V引入的不確定；⑤標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定；⑥回收率引入的不確定度.

3.2 不確定度分量的評定

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制的相對不確定度

3.2.1.1 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書提供的信息，氯霉素的P為98.5%，擴(kuò)展不確定度均為0.5%（k=2）.其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（P）為:

3.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的不確定度

稱量天平為Sanorius BS224S電子天平，根據(jù)天平檢定證書，其最大允許誤差為0.1 mg（區(qū)間半寬度為0.1 mg），取矩形分布，則稱量誤差引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度U（m標(biāo)）為：

稱量氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品10.25mg，故氯霉素稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（m標(biāo)）為：

3.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制中稀釋定容過程中引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)溶液在稀釋定容過程中使用到10mL、100mL容量瓶和1mL和2mL移液管，均檢定均為A級.按照J(rèn)JGl96-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》［17］，用最大允差計(jì)算不確定度，假設(shè)為三角分布.

（1）1mL移液管引入的不確定度

校準(zhǔn)引入的不確定度：按照J(rèn)JGl96-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》［17］，1mLA級移液管最大容量允差為±0.007mL，按三角分布，標(biāo)準(zhǔn)不確定度U1（V1）為：

溫度變化引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度:環(huán)境溫度變化為±3℃，甲醇的膨脹系數(shù)為1.18×10-3℃，取矩形分布（k=3），其標(biāo)準(zhǔn)不確定度U2（V1）為：

合成：將以上兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成如下：

lmL移液管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（V1）=U（V1）/1=0.003514/1=0.003514

（2）2mL移液管引入的不確定度

校準(zhǔn)引入的不確定度：按照J(rèn)JGl96—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》［17］，1mLA級移液管最大容量允差為±0.010mL，按三角分布，標(biāo)準(zhǔn)不確定度U1（V2）為：

溫度變化引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度:其標(biāo)準(zhǔn)不確定度U2（V2）為：

合成：將以上兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成如下：

2mL移液管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（V2）=U（V2）/2=0.005777/2=0.002889

（3）10mL容量瓶引入的不確定度

校準(zhǔn)引入的不確定度：按照J(rèn)JGl96-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》［17］，10mLA級容量瓶最大容量允差為±0.02mL，按三角分布，標(biāo)準(zhǔn)不確定度U1（V10）為：

溫度變化引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度:其標(biāo)準(zhǔn)不確定度U2（V10）為：

合成：將以上兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成如下：

10mL容量瓶引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（V10）=U（V10）/10=0.022010/10=0.002201

（4）100mL容量瓶引入的不確定度

校準(zhǔn)引入的不確定度：按照J(rèn)JGl96-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》［17］，100mL容量瓶的容量允差為±0.10mL，取三角分布，則引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度U1（V100）為：

溫度變化引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度:其標(biāo)準(zhǔn)不確定度U2（V100）為：

合成：將以上兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成如下：

l00mL容量瓶引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（V100）=U（V100）/100=0.208425/100=0.002084

故合成標(biāo)準(zhǔn)工作液配制中稀釋定容過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.2.2 樣液中D5-氯霉素總量引入的不確定度

樣液中D5-氯霉素總量引入的不確定度主要由移取時使用的1.0ml移液管引入.按JJGl96-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》［17］規(guī)定，1mL A級移液管最大容量允差為±0.007mL，按三角分布，標(biāo)準(zhǔn)不確定度U1（V1）為：

溫度變化引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度:其標(biāo)準(zhǔn)不確定度U2（V1）為：

合成：將以上兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成如下：

則樣液中D5-氯霉素總量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2.3 樣品稱量引入的不確定度

鰻魚稱樣量為5.01g，根據(jù)天平檢定證書，天平允許最大誤差為0.01 g（區(qū)間半寬度為0.01 g），取矩形分布，引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（m）為：

3.2.4 測量重復(fù)性引入的不確定度

由重復(fù)測定引入的不確定度主要考慮A類不確定度.制備6份平行樣品，各加入氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液（100ng/mL）50μL，則樣品加標(biāo)濃度為1.0μg/kg.上機(jī)測得6份加標(biāo)樣品的氯霉素值分別為0.9116μg/kg、0.9092μg/kg、0.9089μg/kg、0.9107μg/kg、0.9092μg/kg和0.9158μg/kg，平均值`x為0.9109μg/kg.單次測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

因?yàn)樵趯?shí)際檢測樣品時一般只做兩個平行樣品，所以測量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

由測量重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.2.5 樣液最后定容引入的不確定度

校準(zhǔn)引入的不確定度：按照J(rèn)JGl96-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》［17］，1mL A級移液管最大容量允差為±0.007mL，取三角形分布，則樣品定容引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度U1（V1）為：

溫度變化引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度:其標(biāo)準(zhǔn)不確定度U2（V1）為：

合成：將以上兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成如下：

lmL移液管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（V樣品）=U（V樣品）/1=0.003514/1=0.003514

3.2.6 由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度

取由2.3制備的5種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，測得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=1.7425x+0.0129，相關(guān)系數(shù)（r）為0.9992.測定結(jié)果見表1.

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合計(jì)算結(jié)果

曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式為：

式中:S（A）—標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)差

p—樣品溶液的測定次數(shù)，p=6

N—標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定次數(shù)，N=9

a—標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距

b—標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率

xˉ—樣品溶液中待測物的濃度，μg/L

c—標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的平均值，μg/L

ci—校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度

cj—由校準(zhǔn)曲線方程求得的標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度值，μg/L

Ai—單次標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值

3.2.7 由加標(biāo)回收率引入的不確定度

實(shí)驗(yàn)加標(biāo)回收率結(jié)果見表2，按A類不確定度，由加標(biāo)回收率引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度U（R）為:

故由加標(biāo)回收率引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（R）為：

表2 鰻魚中氯霉素含量測定結(jié)果

3.2 .8 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

把所有相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的分量匯總成表，結(jié)果見表3.

表3 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量匯總表

所以

U（x）=0.085412×0.9109=0.077802μg/kg

4 擴(kuò)展不確定度與測量結(jié)果表示

擴(kuò)展不確定度：置信概率95%，取包含因子k=2，U=k×U（x）=2×0.077802=0.155604 μg/kg.結(jié)果表述：依據(jù)農(nóng)業(yè)部781號公告-2-2006《動物源食品中氯霉素殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》測得鰻魚中氯霉素殘留量為 0.9109μg/kg，則結(jié)果表述為（0.9109±0.1556）μg/kg，

5 討論

本研究對使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定鰻魚中氯霉素的檢測結(jié)果進(jìn)行了不確定度評定.各不確定度分量評定結(jié)果顯示，測量不確定度主要來源于測定結(jié)果重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制以及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度.因此制樣要徹底均勻，減少標(biāo)準(zhǔn)品配制的步驟，標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制要精確，減小測定結(jié)果的不確定度，以提高測定的結(jié)果的準(zhǔn)確性.