王靜 李馨筱 吳琳娜 劉凡

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）作為一種常見的淋巴瘤，具有侵襲力強(qiáng)、惡性程度高等特點(diǎn)［1］。有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，經(jīng)聯(lián)合化療治療，40%左右的患者可達(dá)到完全緩解，但仍有50%以上的患者對(duì)化療不敏感［2］。目前在癌癥研究中發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞凋亡對(duì)于腫瘤形成與發(fā)展起到了重要作用，許多藥物均通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗癌作用［3］。凋亡過程的調(diào)節(jié)涉及多組基因，這些調(diào)控基因表達(dá)改變會(huì)對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響，最終引起細(xì)胞異常增殖、凋亡受到抑制，進(jìn)而對(duì)化療產(chǎn)生耐受性，預(yù)后不佳［4］。所以對(duì)DLBCL細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)可作為指導(dǎo)個(gè)體化治療、預(yù)測(cè)治療療效的主要方法之一。NF-κB是一種多向性核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，P50/P65二聚體是其最常見形式，NF-κB激活入核后可調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子等表達(dá)。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB還可調(diào)節(jié)某些細(xì)胞增殖基因和抗凋亡基因的表達(dá)，可能是腫瘤發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因子［5］。Bcl-2是抗凋亡蛋白，在一些腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，延長腫瘤細(xì)胞存活時(shí)間，促進(jìn)腫瘤發(fā)展［6］。Bax是促凋亡蛋白，可抑制Bcl-2的抗凋亡作用［7］。本研究對(duì) NF-κB/p65、Bcl-2 和 Bax 等細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，探討這些蛋白與DLBCL臨床病理參數(shù)以及預(yù)后的關(guān)系，為尋找DLBCL新治療靶點(diǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

組織標(biāo)本來自于2012年3月至2015年2月我院接受手術(shù)治療的78例DLBCL患者和30例反應(yīng)增生性淋巴結(jié)患者，分別作為DLBCL組和反應(yīng)增生性淋巴結(jié)組。DLBCL組中，男46例，女32例，年齡26～77歲，中位年齡54歲，根據(jù)Ann Arbor分期標(biāo)準(zhǔn)［8］，Ⅰ、Ⅱ分期共 51例，Ⅲ、Ⅳ分期共 27 例，淋巴瘤國際預(yù)后指數(shù)（international prognostic index，IPI）＜2分的38例，≥2分的40例。反應(yīng)增生性淋巴結(jié)組中，男19例，女11例，年齡27～75歲，中位年齡51歲，2組性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。2組患者均經(jīng)手術(shù)、組織病理學(xué)證實(shí)，術(shù)前未接受相關(guān)治療，患者對(duì)本研究均知情同意。組織標(biāo)本的獲取和使用均獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 主要試劑

兔抗人NF-κB/p65單克隆抗體（ZA-0210）、鼠抗人Bcl-2單克隆抗體（ZM-0010）、鼠抗人Bax單克隆抗體（MAB-0254）、即用型免疫組化超敏UltraSensitiveTMSP檢測(cè)試劑盒（KIT-9710）均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 免疫組化方法

石蠟切片厚度 4 μm，3%H2O2處理 10 min。0.01 mol/L磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）調(diào)pH值至7.2～7.4，沖洗干凈后，采用水浴鍋加熱0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液（pH 6.0）至95℃，放入組織切片熱修復(fù)15 min。一抗低溫封閉過夜，PBS沖洗3次，二抗室溫孵育30 min。PBS沖洗5次，DAB顯色后采用蘇木素復(fù)染。經(jīng)脫水、透明、封片后鏡檢觀察。結(jié)果判定：隨機(jī)選取5個(gè)視野，根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例及染色強(qiáng)度評(píng)分，無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為3分；無著色為0分，著色淺黃為1分，著色黃色為2分，著色棕黃為3分，2項(xiàng)評(píng)分乘積在3分以上者為陽性［9］。由另2名高年資病理醫(yī)師觀察切片，判定結(jié)果，意見不一致時(shí)，共同商討得出最終結(jié)果。統(tǒng)計(jì)NF-κB/p65、Bcl-2和Bax陽性表達(dá)的DLBCL組織中患者的年齡、性別、B癥狀、IPI得分、結(jié)外病灶數(shù)、臨床分期情況，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 隨訪

對(duì)所有患者隨訪5～53個(gè)月，隨訪以門診或電話方式進(jìn)行，隨訪內(nèi)容包括患者生活質(zhì)量、一般情況、近期復(fù)查情況等。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，DLBCL組織中NF-κB/p65、Bcl-2和Bax表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系行χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，生存分析采用Kaplan-Meier分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DLBCL組和反應(yīng)增生性淋巴結(jié)組NF-κB/p65、Bcl-2和Bax表達(dá)情況比較

NF-κB/p65主要表達(dá)于細(xì)胞核，Bcl-2主要表達(dá)于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜（圖1）。2組NF-κB/p65、Bcl-2和Bax陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 DLBCL組織NF-κB/p65、Bcl-2和Bax表達(dá)與B癥狀、IPI得分、臨床分期等的關(guān)系

DLBCL組織NF-κB/p65陽性表達(dá)與B癥狀、IPI得分、臨床分期有關(guān)（P＜0.05），Bcl-2陽性表達(dá)與IPI得分、臨床分期有關(guān)（P＜0.05），Bax陽性表達(dá)與臨床分期有關(guān)（P＜0.05），見表2。

2.3 DLBCL組織中NF-κB/p65、Bcl-2和Bax表達(dá)之間的相關(guān)性分析

免疫組化結(jié)果中，NF-κB/p65與Bcl-2表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.53，P＜0.05），NF-κB/p65與Bax表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.51，P＜0.05），Bcl-2與Bax表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.62，P＜0.05）。

圖1 各蛋白在DLBCL組織中表達(dá)情況Figure 1 Expression of each protein in DLBCL tissue

表1 DLBCL組和反應(yīng)增生性淋巴結(jié)組NF-κB/p65、Bcl-2和Bax表達(dá)情況比較［n（%）］Table 1 Comparison of NF-κB/p65，Bcl-2 and Bax expression between DLBCL group and reactive proliferative lymph nodes group［n（%）］

2.4 DLBCL組織中NF-κB/p65、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)與生存期的關(guān)系

對(duì)本研究78例患者隨訪5～53個(gè)月，NF-κB/p65陽性表達(dá)中位生存期18個(gè)月，NF-κB/p65陰性表達(dá)中位生存期34個(gè)月，Bcl-2陽性表達(dá)中位生存期16個(gè)月，Bcl-2陰性表達(dá)中位生存期31個(gè)月，Bax陽性表達(dá)中位生存期30個(gè)月，Bax陰性表達(dá)中位生存期15個(gè)月。Kaplan-Meier生存曲線分別見圖2至圖4。NF-κB/p65、Bcl-2和 Bax陽性表達(dá)與陰性表達(dá)的Kaplan-Meier生存曲線有明顯差異（P＜0.05）。

表2 DLBCL組織NF-κB/p65、Bcl-2和Bax表達(dá)與病理特征關(guān)系Table 2 Relationship between expression of NF-κB/p65，Bcl-2，Bax in DLBCL tissue and pathological features

圖2 NF-κB/p65陽性表達(dá)對(duì)DLBCL患者生存期的影響Figure 2 The influence of positive expression of NF-κB/p65 on the survival of patients with DLBCL

圖3 Bcl-2陽性表達(dá)對(duì)DLBCL患者生存期的影響Figure 3 Influence of positive expression of Bcl-2 on survival of patients with DLBCL

圖4 Bax陽性表達(dá)對(duì)DLBCL患者生存期的影響Figure 4 Influence of positive Bax expression on survival of DLBCL patients

3 討論

DLBCL的發(fā)生發(fā)展與多種遺傳信息異常有關(guān)，是一個(gè)異質(zhì)性、多步驟的過程，由各種信號(hào)通路的異常激活或阻滯引起的異常細(xì)胞生長、分化、凋亡均會(huì)引發(fā)DLBCL［10-12］?，F(xiàn)已明確藥物化療的主要機(jī)制是誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)凋亡的基因組包括NF-κB家族、BCL-2家族、胱冬蛋白酶（caspase）家族、TNF 受體家族、MYC 家族等［13］。這些調(diào)控基因表達(dá)改變會(huì)對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響，最終引起細(xì)胞異常增殖、凋亡受到抑制，進(jìn)而對(duì)化療產(chǎn)生耐受性，預(yù)后不佳。

p50/p56二聚復(fù)合物是NF-κB家族蛋白成員中最常見的活性形式，通常情況下，NF-κB與IκB結(jié)合處于未激活狀態(tài)，當(dāng)NF-κB受到外界刺激后，IκB被磷酸化降解，NF-κB由從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，結(jié)合靶基因，使轉(zhuǎn)錄增加［14］。凋亡調(diào)節(jié)相關(guān)編碼基因即為NF-κB靶基因之一，其可通過直接調(diào)控凋亡基因調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，另外還可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和其他蛋白互相作用間接調(diào)節(jié)凋亡［15］。Bcl-2和Bax均屬于Bcl-2家族蛋白，Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白，Bcl-2或Bax基因突變或表達(dá)異常均會(huì)影響DLBCL治療療效［16］。朱斌等人［17］發(fā)現(xiàn) DLBCL 組織中 NF-κB/p65 陽性表達(dá)率為62.8%，明顯高于淋巴增生組織的23.3%，與IPI評(píng)分以及臨床分期相關(guān)。孟亞紅等人［18］研究發(fā)現(xiàn)，淋巴瘤組Bcl-2陽性表達(dá)率為55.2%，顯著高于對(duì)照組的25.0%，且與臨床分期相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DLBCL組織樣本中，NF-κB/p65、Bcl-2陽性率分別為39.74%、51.28%，顯著高于反應(yīng)增生性淋巴結(jié)組織樣本中的陽性表達(dá)率，與上述研究結(jié)果基本一致。不同之處在于NF-κB/p65陽性表達(dá)除了與IPI得分、臨床分期有關(guān)，還與B癥狀有關(guān)。國內(nèi)關(guān)于Bax在DLBCL組織中的表達(dá)分析研究較少。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bax陽性率為32.05%，顯著低于反應(yīng)增生性淋巴結(jié)組織樣本中的陽性表達(dá)率，且與臨床分期相關(guān)，說明Bax也可能參與DLBCL的發(fā)生，促進(jìn)DLBCL的發(fā)展。

進(jìn)一步經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，NF-κB/p65與Bcl-2呈正相關(guān)，NF-κB/p65與Bax呈負(fù)相關(guān)，Bcl-2與Bax呈負(fù)相關(guān)。NF-κB/p65與Bcl-2呈正相關(guān)原因可能在于Bcl-2是NF-κB/p65下游關(guān)鍵靶蛋白之一［19］。Bcl-2與Bax呈負(fù)相關(guān)原因可能在于Bcl-2可阻止細(xì)胞色素c釋放，而Bax可促進(jìn)細(xì)胞色素c釋放，細(xì)胞色素c一旦釋放便與caspase-9、細(xì)胞凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合形成凋亡酶，激活 caspase-3而啟動(dòng)凋亡［20］。Bcl-2、Bax的平衡是以上效應(yīng)是否發(fā)生的關(guān)鍵所在，隨著Bcl-2蛋白表達(dá)增多，Bax/Bax同源二聚體逐漸轉(zhuǎn)化為Bax/Bcl-2異源二聚體，由誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)化為促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2、Bax 兩者對(duì)凋亡起到正負(fù)調(diào)控作用［21］。延長患者生存期是DLBCL治療的最終目的，朱斌等人［17］發(fā)現(xiàn) NF-κB/p65 陽性表達(dá)患者 2 年總生存率25.0%，明顯低于陰性表達(dá)者的68.8%。糜公仆等人［12］研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2陽性表達(dá)者3年總生存率56.25%，低于1年總生存率75%。以上結(jié)果提示NF-κB/p65和Bcl-2陽性表達(dá)會(huì)對(duì)患者生存率產(chǎn)生影響，但上述研究觀察時(shí)間均較短。本研究則對(duì)所有患者進(jìn)行為期5～53個(gè)月的隨訪，并進(jìn)行Kaplan-Meier生存曲線分析，結(jié)果顯示NF-κB/p65或Bcl-2陽性表達(dá)可降低生存率，而Bax陽性表達(dá)可提高生存率。這是由于NF-κB/p65、Bcl-2陽性表達(dá)可抑制癌細(xì)胞凋亡，延長癌細(xì)胞壽命，預(yù)后不佳，而Bax陽性表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，阻止DLBCL進(jìn)一步發(fā)展，進(jìn)而延長患者生存期。

綜上所述，NF-κB/p65、Bcl-2和 Bax表達(dá)可在一定程度上反映DLBCL生物學(xué)異質(zhì)性及臨床特征，對(duì)DLBCL預(yù)后產(chǎn)生一定影響，可作為DLBCL診療及預(yù)后評(píng)估的參考指標(biāo)。