農(nóng)雪萍　黃建華　馮雅莉　劉翼軍

【摘要】 目的：探索外泌體β-actin mRNA作為惡性胸腔積液和結(jié)核性胸腔積液鑒別診斷指標(biāo)的臨床價(jià)值。方法：收集70例結(jié)核性胸腔積液和57例惡性胸腔積液，采用外泌體沉淀試劑沉淀胸腔積液中的外泌體后用Trizol法提取外泌體總RNA，之后通過(guò)微滴式數(shù)字定量PCR技術(shù)檢測(cè)外泌體中β-actin mRNA的表達(dá)。結(jié)果：數(shù)字定量PCR結(jié)果顯示，1 ?g結(jié)核性胸腔積液外泌體總RNA中β-actin的拷貝數(shù)為75.20（15.15，614.00），1 ?g惡性胸腔積液外泌體總RNA中β-actin的拷貝數(shù)為4.65（1.95，22.40），兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.02）。受試者工作特征曲線結(jié)果顯示，曲線下面積為0.79±0.04（P<0.000 1）。結(jié)論：外泌體β-actin mRNA可作為惡性胸腔積液和結(jié)核性胸腔積液鑒別診斷的潛在的新指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】 惡性胸腔積液 結(jié)核性胸腔積液 外泌體 β-actin mRNA

Application Value of Exosome β-actin mRNA in Differential Diagnosis of Malignant Pleural Effusion and Tuberculous Pleural Effusion/NONG Xueping， HUANG Jianhua， FENG Yali， LIU Yijun. //Medical Innovation of China， 2019， 16（29）： -172

[Abstract] Objective： To explore if β-actin could be used as a novel method to distinguish malignant pleural effusion from tuberculous pleural effusion using the levels of β-actin mRNA in exosomes. Method： A total of Seventy cases of tuberculous pleural effusion and 57 cases of malignant pleural effusion were collected. After the exosomes in pleural effusion were precipitated by exosomes precipitation reagent， total exosomes RNA was extracted by Trizol method， the expression of beta-actin mRNA in exosomes was detected by microdrop quantitative PCR. Result： The results of quantitative PCR showed that the copy number of actin in the total RNA of 1 μg tuberculous pleural effusion exosomes was 75.20 （15.15， 614.00）， and that of 1 μg malignant pleural effusion exosomes was 4.65 （1.95， 22.40）， showed statistically significant difference between the two groups （P=0.02）.The results of the subject operating characteristic curve show that the area under the curve was （0.79±0.04） （P<0.000 1）. Conclusion： Exosome beta-actin mRNA may be a potential new indicator in the differential diagnosis of malignant pleural effusion and tuberculous pleural effusion.

[Key words] Malignant pleural effusion Tuberculous pleural effusion Exosome β-actin mRNA

First-authors address： Jiangxi Chest Hospital， Nanchang 330006， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.29.044

胸腔積液是一種由多種病因引起的臨床常見疾病。對(duì)于胸腔積液的診斷有助于原發(fā)病因的明確、患者預(yù)后的判斷以及治療方案的選擇[1]。結(jié)核性胸腔積液和惡性胸腔積液是我國(guó)最常見的兩種胸腔積液類型[2]，但是正確的區(qū)分兩種類型并不容易，因?yàn)閮烧呔沙霈F(xiàn)胸痛、發(fā)熱、消瘦、乏力等相似的臨床表現(xiàn)，而且均屬于滲出性胸腔積液，且均可為血性積液。雖然胸腔積液中查到結(jié)核分枝桿菌或腫瘤細(xì)胞可明確診斷，但是臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)單次胸腔積液的陽(yáng)性檢出率較低，需進(jìn)行3次以上的送檢。即使如此，仍然有一部分病例經(jīng)過(guò)多種無(wú)創(chuàng)檢測(cè)仍無(wú)法明確診斷，對(duì)于這部分病例只有行胸腔鏡檢查方能提高診斷準(zhǔn)確度[3-4]。但是胸腔鏡檢查為有創(chuàng)檢查，對(duì)操作者技能和經(jīng)驗(yàn)要求較高，且有不可忽視的禁忌證和并發(fā)癥，因此不能常規(guī)運(yùn)用于臨床區(qū)分結(jié)核性胸腔積液和惡性胸腔積液[5]。外泌體是一種由細(xì)胞釋放出的具有雙層脂質(zhì)的細(xì)胞外囊泡，其直徑為30～150 nm，包含了其來(lái)源細(xì)胞豐富且特異的miRNA、mRNA、DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和其他生物活性分子等物質(zhì)，因此可以通過(guò)檢測(cè)外泌體內(nèi)的特異性物質(zhì)來(lái)明確其來(lái)源細(xì)胞的類型[6-8]。目前外泌體內(nèi)包含的來(lái)源細(xì)胞特異性mRNA已被報(bào)道可用于糖尿病腎病、膀胱癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌等疾病的診斷[9-12]。β-actin是一種常見的內(nèi)參基因，其在不同類型的組織和細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)[13]。本文就外泌體β-actin mRNA在胸腔積液和惡性胸腔積液鑒別診斷中的臨床價(jià)值進(jìn)行研究，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年12月-2018年6月到本院就診的123例患者，其中結(jié)核性胸腔積液患者70例，結(jié)核性胸腔積液組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）胸腔積液及組織中涂片找到結(jié)核分枝桿菌或者培養(yǎng)有結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng);（2）組織病理標(biāo)本PCR檢測(cè)陽(yáng)性或符合干酪性肉芽腫病變;（3）胸腔積液PCR檢測(cè)陽(yáng)性或影像學(xué)表現(xiàn)符合結(jié)核病;（4）符合結(jié)核病臨床過(guò)程，同時(shí)結(jié)核菌素試驗(yàn)陽(yáng)性（硬結(jié)平均直徑>20 mm）;（5）診斷性抗結(jié)核治療2個(gè)月，臨床表現(xiàn)和影像學(xué)特點(diǎn)都有好轉(zhuǎn)。符合（1）、（2）任一項(xiàng);或（3）、（4）、（5）中的至少兩項(xiàng)均可入組。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有心、肝、腎等嚴(yán)重疾病和精神病;（2）合并惡性腫瘤、自身免疫性疾病、糖尿病;

（3）妊娠期、哺乳期婦女;（4）人免疫缺陷病毒（HIV）檢測(cè)抗體陽(yáng)性者。惡性胸腔積液患者57例，惡性胸腔積液組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）胸腔積液細(xì)胞沉淀中找到惡性細(xì)胞;（2）胸膜活檢組織中觀察到惡性腫瘤的病理改變。符合（1）或（2）任一項(xiàng)均可入組。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠期、哺乳期、HIV感染、急性病毒感染、自身免疫性疾病及免疫抑制劑應(yīng)用史、嚴(yán)重肝腎功能損害者。該研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣本收集及處理 收集經(jīng)呼吸科科確診的結(jié)核性胸腔積液和惡性胸腔積液各5 mL裝入1.5 mL離心管（貨號(hào)：430791，美國(guó)Corning公司），于冷凍離心機(jī)（型號(hào)：5810R，德國(guó)Eppendorf公司）中4 ℃ 3 000×g離心15 min。用0.22 μm一次性針頭式濾器（貨號(hào)：SLGP033RB，德國(guó)Merck公司）抽濾上清液，將抽濾后的液體裝入5 mL凍存管，-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 外泌體沉淀及總RNA提取

1.2.2.1 外泌體沉淀 將凍存的樣本取出后放入37 ℃水浴鍋中完全融解后立即取出，吸取500 μL樣本于1.5 mL EP管中，加入126 μL ExoQuick外泌體沉淀劑（貨號(hào)：EXOQ5A-1，加拿大SBI公司）后放入4 ℃冰箱孵育至少12 h以上。孵育完成后冷凍離心機(jī)中4 ℃ 1 500×g離心30 min，取出EP管，棄上清，其底部的團(tuán)塊狀白色物質(zhì)即為沉淀的外泌體。

1.2.2.2 總RNA提取 用62.6 μL無(wú)酶去離子水重懸外泌體團(tuán)塊，之后采用Trizol法提取外泌體總RNA。具體過(guò)程如下：（1）外泌體懸液中加入1 mL Trizol（貨號(hào)：15596026，美國(guó)ThermoFisher公司），室溫放置5 min;（2）加入200 μL氯仿，充分振蕩混勻后冰浴放置15 min;（3）4 ℃ 12 000×g離心15 min后吸取上層水相于2 mL無(wú)酶EP管中;（4）加入500 μL預(yù)冷異丙醇后充分混勻，冰浴放置10 min;（5）4℃ 12 000×g離心15 min，棄上清，加入1 mL無(wú)酶去離子水配制的75%乙醇，顛倒混勻;（6）4 ℃ 8 000×g離心15 min，盡量棄上清，室溫開蓋干燥5～10 min;（7）用20 μL無(wú)酶去離子水溶解RNA;（8）用NanoPhotometer（型號(hào)：N60，德國(guó)IMPLEN公司）檢測(cè)RNA的濃度及純度。

1.2.3 β-actin mRNA表達(dá)的檢測(cè)

1.2.3.1 總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 使用iScript cDNA合成試劑盒（貨號(hào)：1708891，美國(guó)Bio-Rad公司）將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL：5×反應(yīng)混合物4 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，無(wú)酶去離子水和RNA模板量根據(jù)各樣本RNA濃度確定。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：首先25 ℃ 5 min使引物與模板結(jié)合，然后46 ℃ 20 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，接著95 ℃ 1 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，最后4 ℃保存。

1.2.3.2 微滴式數(shù)字PCR檢測(cè) β-actin上游引物序列為5‘-CAGAGCAAGAGAGGCATC-3，下游引物序列為5‘-CTGGGGTGTTGAAGGTCT-3，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為216 bp。PCR擴(kuò)增體系為20 μL：2×EvaGreen擴(kuò)增混合物（貨號(hào)：1864034，美國(guó)Bio-Rad公司）10 μL，前引物100 nM，后引物100 nM，cDNA 1 μL，無(wú)酶去離子水8.8 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s高溫變性，60 ℃ 1 min退火/延伸，40個(gè)循環(huán);4 ℃ 5 min;90 ℃

5 min。具有檢測(cè)步驟如下：（1）將20 μL PCR擴(kuò)增體系和70 μL微滴發(fā)生油分別加入微滴發(fā)生板，微滴發(fā)生儀（型號(hào)：QX200，美國(guó)Bio-Rad公司）將自動(dòng)生成微滴;（2）將生成的微滴全部加入微滴式數(shù)字PCR專用96孔板內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，并設(shè)置陰性對(duì)照;（3）擴(kuò)增結(jié)束后將96孔板放入微滴讀取儀（型號(hào)：QX200，美國(guó)Bio-Rad公司）中進(jìn)行檢測(cè)，QuantaSoft軟件將自動(dòng)計(jì)算每個(gè)檢測(cè)樣本所含目的基因的拷貝數(shù)。

1.2.4 臨床診斷的評(píng)價(jià) 將結(jié)核性胸腔積液組β-actin mRNA表達(dá)設(shè)為對(duì)照組，惡性胸腔積液組β-actin mRNA表達(dá)設(shè)為疾病組，以靈敏度為縱坐標(biāo)，1-特異度為橫坐標(biāo)繪制受試者工作特征曲線（ROC曲線），計(jì)算曲線下面積，評(píng)價(jià)其臨床診斷價(jià)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 定量資料使用SPSS 11.0軟件，運(yùn)用k-s方法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，若為正態(tài)分布則用均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差表示，若為非正態(tài)分布則用中位數(shù)（四分位間距）表示。兩組數(shù)據(jù)比較根據(jù)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布采用非配對(duì)t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)分析均使用GraphPad Prism 7.0軟件，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的一般資料比較 惡性胸腔積液組，非小細(xì)胞肺癌30例，腺癌：男28例，女23例，鱗癌：男2例;小細(xì)胞癌2例，其中乳腺癌1例，卵巢癌1例。兩組患者的性別、年齡、病程比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，見表1。

2.2 外泌體總RNA濃度及純度 500 μL結(jié)核性胸腔積液和惡性胸腔積液所獲得的外泌體總RNA濃度和純度比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

2.3 兩組樣本β-actin微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)結(jié)果比較

2.3.1 兩組樣本微滴數(shù)量檢測(cè)結(jié)果 123個(gè)胸腔積液樣本及陰性對(duì)照樣本微滴數(shù)量均達(dá)到了10 000個(gè)以上，部分樣本微滴數(shù)量結(jié)果見圖1。

2.3.2 兩組樣本β-actin表達(dá)結(jié)果 微滴式數(shù)字PCR結(jié)果顯示，所有檢測(cè)樣本陰性微滴的熒光信號(hào)值均值為2 494.04±65.94。微滴式數(shù)字PCR自帶分析軟件QuantaSoft自動(dòng)設(shè)置檢測(cè)閾值為8 000，結(jié)核性胸腔積液中有陽(yáng)性微滴的例數(shù)為66例，惡性胸腔積液中有陽(yáng)性微滴的例數(shù)為50例，兩組陽(yáng)性微滴檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.34）。設(shè)置檢測(cè)閾值后QuantaSoft軟件自動(dòng)計(jì)算出20 ?L PCR擴(kuò)增體系中β-actin的拷貝數(shù)，根據(jù)此結(jié)果計(jì)算出1 ?g結(jié)核性胸腔積液外泌體總RNA和1 ?g惡性胸腔積液外泌體總RNA中β-actin的拷貝數(shù)分別為75.20（15.15，614.00）和4.65（1.95，22.40），兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.02），見圖2。

2.4 β-actin診斷價(jià)值的評(píng)估 ROC曲線下面積為（0.79±0.04），95%CI為（0.71，0.87），與曲線下面積等于0.5相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.000 1），見圖3。ROC曲線顯示當(dāng)診斷臨界值為0.3時(shí)，具有最高的診斷靈敏度92.86%，特異度為10.71%;當(dāng)診斷臨界值為2 618時(shí)，具有最高的診斷特異度100%，此時(shí)靈敏度為11.43%;當(dāng)診斷臨界值為258時(shí)，具有最高的似然比，其值為18.4，此時(shí)診斷的靈敏度為32.86%，特異度為98.21%。

3 討論

胸腔積液的診斷步驟首先要按照Light氏標(biāo)準(zhǔn)明確其為漏出液還是滲出液，之后如果是滲出液的話根據(jù)相關(guān)病史進(jìn)行對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室檢查和特殊檢查，例如如果需要對(duì)最不容易區(qū)分的結(jié)核性和惡性胸腔積液進(jìn)行鑒別的話，則需要進(jìn)行胸腔積液細(xì)胞計(jì)數(shù)、生化、腫瘤標(biāo)志物檢查、PPD檢查、多次涂片查找抗酸桿菌或者腫瘤細(xì)胞、微生物培養(yǎng)、多次胸膜活檢甚至可能需要開胸肺活檢，整個(gè)診斷過(guò)程非常的繁瑣、耗時(shí)，因此臨床急需無(wú)創(chuàng)、準(zhǔn)確、快速的新診斷方法輔助醫(yī)生明確病因以便為患者提供最及時(shí)的醫(yī)療處理[3，14]。

最近研究表明外泌體是一種新的疾病診斷標(biāo)志物，它由所有類型的細(xì)胞分泌至體液中，每種細(xì)胞分泌的外泌體內(nèi)所包含的生物分子各有不同，同一種細(xì)胞所分泌的外泌體也會(huì)隨著該細(xì)胞狀態(tài)的不同而有所不同，因此可通過(guò)檢測(cè)相關(guān)體液中所包含的外泌體的特征來(lái)明確其來(lái)源細(xì)胞或者反映其來(lái)源細(xì)胞的狀態(tài)，從而達(dá)到疾病診斷的目的[15]。外泌體表面高表達(dá)的CD317和表皮生長(zhǎng)因子受體被認(rèn)為是非小細(xì)胞肺癌的診斷標(biāo)志物，外泌體內(nèi)miR-483-5p、miR-200b-5p等miRNA的高表達(dá)也被報(bào)道對(duì)于肺腺癌的診斷有臨床價(jià)值[16]。

外泌體mRNA同樣是一種具有潛力的疾病診斷生物標(biāo)志物。尿液外泌體Wilms瘤基因1的mRNA的高表達(dá)與糖尿病腎病的不良預(yù)后相關(guān)[8]，尿液外泌體SLC2A1、GPRC5A和KRT17基因mRNA高表達(dá)有望成為膀胱癌的潛在生物標(biāo)志物[10]。因此筆者認(rèn)為胸腔積液中外泌體mRNA也有成為輔助胸腔積液

診斷的指標(biāo)之一。目前檢測(cè)mRNA表達(dá)最常用的方法為熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)相對(duì)定量法，該方法通過(guò)獲得同一樣本目的基因和內(nèi)參基因的閾值循環(huán)數(shù)，用目的基因閾值循環(huán)數(shù)/內(nèi)參基因循環(huán)數(shù)的比值來(lái)表示樣本中目的基因的表達(dá)，因此內(nèi)參基因的選擇極其重要[17]。β-actin和GAPDH是檢測(cè)mRNA相對(duì)表達(dá)最常用的內(nèi)參基因，文獻(xiàn)[8]研究中選用的內(nèi)參基因即為GAPDH，但是目前尚未見將β-actin作為內(nèi)參基因的報(bào)道。本課題組在前期的胸腔積液外泌體相關(guān)研究的預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)外泌體中β-actin的mRNA表達(dá)在結(jié)核性胸腔積液和惡性胸腔積液中的差異較大，結(jié)核性胸腔積液外泌體中β-actin的mRNA表達(dá)顯著高于惡性胸腔積液，因此筆者推測(cè)胸腔積液外泌體中的β-actin mRNA也許可以作為一個(gè)新的鑒別診斷指標(biāo)，因此增加了樣本量，并對(duì)其診斷價(jià)值進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

微滴式數(shù)字PCR法是通過(guò)用微滴發(fā)生油將PCR反應(yīng)體系處理成上萬(wàn)個(gè)油包水微滴，每個(gè)油包水微滴即成為一個(gè)獨(dú)立的PCR擴(kuò)增系統(tǒng)，PCR擴(kuò)增完成后微滴讀取儀讀取所有微滴中的熒光信號(hào)，軟件即可自動(dòng)計(jì)算出樣本中目的基因的拷貝數(shù)，理論上可以檢出含有1個(gè)拷貝的目標(biāo)分子[18]。本研究中通過(guò)微滴式數(shù)字PCR法檢測(cè)了1 ?g結(jié)核性和惡性胸腔積液外泌體總RNA中β-actin的拷貝數(shù)，結(jié)果顯示少部分樣本外泌體中并不能檢測(cè)到β-actin的表達(dá);結(jié)核性胸腔積液外泌體中β-actin的表達(dá)顯著高于惡性胸腔積液中的表達(dá)，其原因可能與結(jié)核桿菌抗菌抗原刺激巨噬細(xì)胞后，巨噬細(xì)胞的分泌改變有關(guān)，但是其具體的機(jī)制仍不清楚[19-20]。

綜上所述，外泌體β-actin mRNA具有作為結(jié)核性胸腔積液和惡性胸腔鑒別診斷新指標(biāo)的潛力，其確切的臨床診斷價(jià)值需進(jìn)行多中心大樣本量的驗(yàn)證，且在實(shí)際應(yīng)用時(shí)其診斷臨界值的選擇取決于臨床的實(shí)際需要。

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（收稿日期：2019-04-15） （本文編輯：張爽）