劉 喆，遲鴻悅，趙彩秀，黃 鑫，郭云龍，劉淑瑩,2

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春 130117；2.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所，長春質(zhì)譜中心，吉林 長春 130022)

腐竹、干豆腐、豆皮等豆制品中含有豐富的蛋白質(zhì)等多種營養(yǎng)成分，是頗受歡迎的傳統(tǒng)食品。堿性橙Ⅱ(C12H12N4HCl)和金胺O(C17H21N3HCl)均屬于偶氮工業(yè)染料，主要用于腈綸、紡織品、紙張、皮革、家具等的染色，該染料可致癌、致畸，對人體健康具有嚴(yán)重的危害。堿性橙Ⅱ和金胺O等染料在中性和偏堿性的條件下與蛋白質(zhì)結(jié)合牢固，不易褪色且成本低廉。一些食品生產(chǎn)商非法添加該類染料使豆制品顏色鮮亮，嚴(yán)重損害了消費者的身體健康?！吨腥A人民共和國食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》及《中華人民共和國食品衛(wèi)生法》規(guī)定，禁止堿性橙Ⅱ和金胺O作為食品添加劑。

目前，檢測豆制品中堿性橙Ⅱ和金胺O的方法主要有光譜法、高效液相色譜法(HPLC)和高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)[1-6]等。雖然研究人員不斷優(yōu)化檢測方法，但在實際操作中仍存在前處理使用的試劑種類復(fù)雜，檢測前需要液相分離，檢測步驟繁瑣耗時等問題。

敞開式離子化質(zhì)譜(ambient ionization mass spectrometry, AIMS)是由Cooks等[7]于2004年首次提出的一種新型離子化技術(shù)，即在大氣壓環(huán)境下，在開放實驗室環(huán)境中，在不改變被分析物本身性質(zhì)的條件下，直接完成對樣品的離子化以及進樣分析的技術(shù)方法[8]。實時直接分析(DART)是AIMS中一種典型的離子化技術(shù)，主要優(yōu)點是可以在幾秒鐘內(nèi)實現(xiàn)液體、氣體、固體樣品材料表面的痕量或少量化合物的離子化質(zhì)譜分析[9]。四極桿-靜電軌道高分辨質(zhì)譜儀(Q-Exactive)采用先進的信號處理技術(shù)，依靠其高分辨的優(yōu)勢可將檢測數(shù)值精確到小數(shù)點后兩位，有效避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。該儀器對定性和定量的程序進行了重新定義，具有稱為確證定量“quanfirmatiom”的新功能，對化合物的鑒定、定量和確證，都可在一次分析中同時完成，是針對食品安全中的一些非法添加及有機污染物定性或定量分析的理想篩選平臺[10]。

本研究擬采用DART-Q-Orbitrap MS聯(lián)用技術(shù)對豆制品中非法添加的堿性橙Ⅱ和金胺O染料進行快速檢測分析，通過優(yōu)化分析方法，希望建立一種簡單、快捷、準(zhǔn)確、高效、綠色的定性和定量分析方法，并為其他食品中非法添加的染料檢測提供參考依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

DART 離子源：包括自動滑軌、載樣熔點孔載樣器、玻璃滴管液體載樣模塊(Dip-it)，美國 Ion Sense 公司產(chǎn)品；Q-Exactive Orbitrap 質(zhì)譜儀(包括Xcaliber工作站)、移液槍：均為美國Thermo-Fisher公司產(chǎn)品；Waters Purifier-R-M220 超純水機：長春萊博特公司產(chǎn)品；KQ-500DA 數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器公司產(chǎn)品；高速萬能粉碎機：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司產(chǎn)品；離心機：德國Eppendorf公司產(chǎn)品。

堿性橙Ⅱ和金胺O標(biāo)準(zhǔn)品：純度均大于80%，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；豆制品樣品：購自本地市場；乙腈：色譜純，美國Thermo-Fisher公司產(chǎn)品；高純氮氣、氦氣：純度 99.999%，長春巨洋氧廠產(chǎn)品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

精密稱取各5 mg堿性橙Ⅱ和金胺O標(biāo)準(zhǔn)品，分別置于10 mL容量瓶中，加入乙腈溶解，搖勻，并用乙腈定容，配制成0.5 g/L的標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液，于4 ℃冰箱儲存，備用。

1.3 樣品制備

將市售豆制品樣品粉碎，過60目篩，精密稱取1 g(精確至0.01 g)樣品，置于50 mL離心管中，加入10 mL 80%乙腈水溶液[6]，超聲提取30 min，以5 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液于另一50 mL離心管中，作為樣品溶液，于4 ℃冰箱中保存，備用。將空白豆制品樣品粉碎，依照上述方法制成空白基質(zhì)溶液，于4 ℃冰箱保存，備用。

1.4 實驗條件

1.4.1DART條件 離子化氣體為氦氣，待機氣體為氮氣，氣體壓力0.3 MPa，離子化溫度300 ℃，毛細管溫度250 ℃，其他參數(shù)采用儀器默認設(shè)置，應(yīng)用正離子模式采集，Dip-it方式進樣，載樣器傳輸速度2 mm/s。

1.4.2質(zhì)譜條件 質(zhì)量掃描范圍m/z50～500，分辨率70 000 FWHM，AGC target 3×10-6，正離子模式，掃描方式為Full MS-SIM/Targeted-MS2，碎裂電壓為50～55 eV，DART離子源與質(zhì)譜儀接口之間的距離為3.2 cm。

2 結(jié)果與討論

2.1 DART-MS參數(shù)的優(yōu)化

2.1.1工作氣體的選擇 為提高檢測性能，達到更好的檢測效果，對DART的實驗參數(shù)進行系統(tǒng)性優(yōu)化。實驗發(fā)現(xiàn)，工作氣體類型和溫度是影響信號強度的重要因素。根據(jù)文獻報道，DART離子源的工作氣體多為He[11-13]，這是因為N2作為離子化試劑時會發(fā)生副反應(yīng)，產(chǎn)生的信號峰相對雜亂，且這種氣體的激發(fā)態(tài)粒子能量較低，為8.5～15.0 eV；而23S激發(fā)態(tài)的氦原子具有比氮更高的能量，其內(nèi)能可達到19.8 eV，能夠使更多種類的化合物被電離，且不產(chǎn)生過多的碎片離子[14-15]。因此，本實驗選用氦氣作為工作氣體。由于氦氣的價格約為氮氣的15倍，實驗待機過程中選用N2作為待機氣體，既可防止離子源污染又可節(jié)約成本。

2.1.2工作氣體溫度的選擇 分別取適量的堿性橙Ⅱ和金胺O標(biāo)準(zhǔn)品工作液，用基質(zhì)溶液稀釋至10 mg/L，以熔點管進樣方式分別在100、150、200、250、300、350、400 ℃下檢測堿性橙Ⅱ和金胺O在質(zhì)譜中的響應(yīng)值與載氣溫度的關(guān)系。由于高溫激發(fā)態(tài)有利于待測物質(zhì)去溶劑化并轉(zhuǎn)移到氣相中[16]，故在一定范圍內(nèi)升高溫度。在達到最大離子信號前(金胺O為350 ℃，堿性橙Ⅱ為300 ℃)，離子信號的強度隨溫度升高而不斷增強，超過最高溫度范圍后離子信號明顯減弱。這是由于過高的溫度會使樣品分解、碳化，因此信號強度隨溫度升高而下降[13]。綜合考慮載氣溫度對各檢測值的影響，最終選定最佳溫度為300 ℃。

2.1.3其他參數(shù)優(yōu)化 待測物通過由DART 軟件控制的滑動軌道上的Dip-it管尖端引入質(zhì)譜儀。通過檢測發(fā)現(xiàn)，載有待測物的Dip-it管尖的移動速度與離子流圖的峰寬密切相關(guān)，減慢速度有利于提高離子化效率，但速度過慢會使離子流圖的峰寬過寬。綜合考慮，本實驗選擇傳輸速度為2 mm/s，DART離子源孔與質(zhì)譜儀接口之間的距離為3.2 cm。

2.2 堿性橙Ⅱ和金胺O的定性分析

堿性橙Ⅱ和金胺O在溶液中以正離子形式存在，根據(jù)其結(jié)構(gòu)，選擇正離子模式進行掃描[18]，用熔點管分別蘸取堿性橙Ⅱ和金胺O標(biāo)準(zhǔn)品的乙腈溶液(10 mg/L)，得到Full MS下的一級質(zhì)譜圖，示于圖1。堿性橙Ⅱ(C12H12N4·HCl)的相對分子質(zhì)量為248.082 9，在DART-MS正離子模式下，得到質(zhì)子化的準(zhǔn)分子離子峰m/z213.114 2[C12H12N4+H]+，與理論值的質(zhì)量偏差為3.23×10-6。金胺O(C17H21N3·HCl)的相對分子質(zhì)量為303.150 2，得到質(zhì)子化的準(zhǔn)分子離子峰m/z268.181 1[C17H21N3+H]+，與理論值的質(zhì)量偏差為1.12×10-6。通過Targeted-MS2掃描，分別對堿性橙Ⅱ和金胺O進行二級質(zhì)譜碎裂，發(fā)現(xiàn)堿性橙Ⅱ在碰撞電壓為50 eV時，得到的主要碎片離子有m/z77.04、105.04、121.06；金胺O在碰撞電壓為55 eV時，主要碎片離子有m/z79.05、107.07、122.10、147.09、252.15。兩種化合物的二級質(zhì)譜圖和碎裂途徑示于圖2。

圖1 堿性橙Ⅱ(a)和金胺O(b)的一級質(zhì)譜圖Fig.1 Full mass spectra of Basic Orange Ⅱ(a) and Auramine O (b)

圖2 堿性橙Ⅱ(a)和金胺O(b)的二級質(zhì)譜圖Fig.2 DART tandem mass spectra of Basic Orange Ⅱ (a) and Auramine O (b)

本實驗對陽性豆制品樣品進行直接檢測。將空白豆制品樣品分別浸泡在不同濃度梯度的堿性橙Ⅱ和金胺O的80%乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液中，取出后用氮氣吹干。剪取小片腐竹、干豆腐和豆皮(約2 cm×0.5 cm×0.3 cm，大小沒有嚴(yán)格的要求，可放入離子源與質(zhì)譜儀接口間并留有一定空隙即可)，分別置于DART 離子源與質(zhì)譜儀接口之間，按照1.4節(jié)條件對陽性樣品進行一級質(zhì)譜檢測。結(jié)果表明，浸泡在濃度為0.2 mg/L堿性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)溶液和浸泡在濃度為0.5 mg/L金胺O標(biāo)準(zhǔn)溶液中的豆制品均可直接在DART質(zhì)譜儀中檢出相應(yīng)的染色劑。

2.3 堿性橙Ⅱ和金胺O的定量分析

借助電噴霧離子化(electrospray ionization, ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸離子化(matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI)等軟電離質(zhì)譜，通過被測物質(zhì)的準(zhǔn)分子離子信號實現(xiàn)定量檢測[18-19]，為質(zhì)譜用于直接定量分析奠定了基礎(chǔ)。迄今為止，已經(jīng)相繼開發(fā)了20余種能夠用于質(zhì)譜直接定量分析的離子化技術(shù)[20]。雖然它們的結(jié)構(gòu)原理不盡相同，但均能將氣、液和固態(tài)樣品直接離子化，可用于復(fù)雜樣品(如中藥、代謝物、非法添加物質(zhì)等)的快速定量分析[21-24]，并可利用質(zhì)譜自身的篩選功能對分析物進行含量測定，實現(xiàn)快速在線原位分析，縮短檢測周期，且具有良好的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。本實驗采用定量分析方法進行方法學(xué)考察，并得到了豆制品中非法添加染料堿性橙Ⅱ和金胺O的含量。

由于熔點管無法準(zhǔn)確控制載樣量，因此選用Dip-it管進樣方式來控制載樣量的相對統(tǒng)一。取少量配制好的母液進行混合并梯度稀釋至0.1 mg/L，將不同濃度的堿性橙Ⅱ和金胺O標(biāo)準(zhǔn)品混合基質(zhì)溶液置于1.5 mL EP管中，統(tǒng)一液面高度為1.5 cm，用Dip-it管蘸取相同液面高度的混合基質(zhì)溶液于載樣熔點孔載樣器上，蘸取時間約3 s。然后將其固定在DART離子源與四極桿-靜電場軌道阱質(zhì)譜儀之間的滑動軌道上，按照1.4節(jié)條件進行檢測，得到該方法對堿性橙Ⅱ和金胺O的檢出限(LOD)均為0.2 mg/L。

2.4 精密度實驗

分別蘸取5.0 mg/L堿性橙Ⅱ和金胺O標(biāo)準(zhǔn)品基質(zhì)溶液，按1.4節(jié)條件進行檢測，重復(fù)測定6次，分別提取堿性橙Ⅱ和金胺O的離子流圖，以峰面積計算。結(jié)果表明，堿性橙Ⅱ、金胺O的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值分別為9.2%、14.0%，表明該儀器的精密度良好。

2.5 重復(fù)性實驗

分別按1.3節(jié)方法將堿性橙Ⅱ和金胺O標(biāo)準(zhǔn)品用基質(zhì)溶液稀釋成10、20和50 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品，同一濃度配制6份。按照1.4節(jié)條件進行檢測，分別以堿性橙Ⅱ和金胺O提取離子流圖的峰面積計算。結(jié)果表明，堿性橙Ⅱ的RSD 分別為 7.0%、9.8%和5.3%，金胺O的RSD 分別為13.7%、7.3%和5.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 線性關(guān)系考察

精密吸取適量標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，分別以基質(zhì)溶液稀釋成質(zhì)量濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個濃度配制6份，按照1.4節(jié)條件進行檢測，取每個濃度的平均值。結(jié)果表明，在1.0～20.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，堿性橙Ⅱ和金胺O的線性關(guān)系良好。當(dāng)濃度為50和100 mg/L時，由于濃度過高，對軌道阱檢測器造成飽和效應(yīng)，不能獲得良好的線性關(guān)系。以峰面積(y)和標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(x)進行回歸分析，得到堿性橙Ⅱ和金胺O的回歸方程分別為y=14 130x+534.74，R2=0.994 1；y=26 601x+2 629.2，R2=0.990 7，二者的線性關(guān)系曲線示于圖3。

圖3 堿性橙Ⅱ(a)和金胺O(b)的線性關(guān)系曲線Fig.3 Corresponding relation curves of peak area vs.the concentration of Basic Orange Ⅱ (a) and Auramine O (b)

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用五味子醇甲為內(nèi)標(biāo)，分別以堿性橙Ⅱ和金胺O與五味子醇甲提取離子流圖的峰面積比為縱坐標(biāo)，堿性橙Ⅱ和金胺O基質(zhì)溶液的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。堿性橙Ⅱ和金胺O標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度梯度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/L，五味子醇甲的濃度均為5 mg/L。得到堿性橙Ⅱ和金胺O的回歸曲線分別為y=0.124x+0.162 9，R2=0.994 5和y=0.258 4x+0.147 5，R2=0.998 9，示于圖4。由于敞開式離子源存在一定的不穩(wěn)定性，進樣量無法保證完全一致，而內(nèi)標(biāo)法定量與進樣量無關(guān)，只需被測物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)物出峰，且分離度符合要求即可。因此，為使定量分析結(jié)果更加準(zhǔn)確，本實驗選擇內(nèi)標(biāo)法進行定量。需要注意的是，在實驗過程中必須保證內(nèi)標(biāo)物與樣品混合均勻。

2.8 市售樣品檢測

各取5組市售的腐竹、干豆腐、豆皮樣品，編號為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，按照1.4節(jié)條件，將統(tǒng)一大小的樣品小片分別置于離子化區(qū)域內(nèi)直接檢測，發(fā)現(xiàn)Ⅱ、Ⅴ號腐竹中出現(xiàn)堿性橙Ⅱ的準(zhǔn)分子離子峰[C12H12N4+H]+，Ⅰ號豆皮樣品中出現(xiàn)金胺O的準(zhǔn)分子離子峰[C17H21N3+H]+，分別對其進行二級質(zhì)譜碎裂，其譜圖與圖2相同。按1.3節(jié)方法進行提取，并按上述方法定量，測得腐竹Ⅴ號的堿性橙Ⅱ含量為1.59 mg/kg，Ⅱ號樣品的峰面積比值低于線性范圍而無法定量，但不影響定性。Ⅰ號豆皮中的金胺O含量為1.26 mg/kg。干豆腐樣品以及其他的腐竹和豆皮樣品中，均未檢出兩種染料。

圖4 峰面積比值與堿性橙Ⅱ(a)和金胺O(b)濃度的線性關(guān)系曲線Fig.4 Corresponding relation curves of peak area vs. the concentrations of Basic Orange Ⅱ (a) and Auramine O (b)

3 結(jié)論

本實驗采用DART-Q-Orbitrap高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)快速定性和定量分析豆制品中可能添加的堿性橙Ⅱ和金胺O。該方法可直接將脫水后的豆制品置于離子化區(qū)域內(nèi)進行定性檢測，整個過程只需3 s。與常規(guī)的色譜法相比，DART質(zhì)譜技術(shù)可大大減小溶劑和其他復(fù)雜基質(zhì)的干擾，使檢測過程更加快速、方便、準(zhǔn)確。

在定量分析中，該方法具有良好的精密度與重復(fù)性，定量結(jié)果雖然比傳統(tǒng)的色譜方法略微遜色，但其具有簡單、快捷、高效、綠色等優(yōu)點，可為食品的高通量篩查、快速定性、定量分析以及質(zhì)量鑒定提供方法參考。