王喻淇，梅曉丹，李 潔，宋 帥，馬 濤，林 峰,，張加余

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102400；2.江蘇朸健生命科技發(fā)展有限公司，北京 100176；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院，北京 100029)

玫瑰茄(HibiscussabdariffaL.)又名洛神花、紅果梅以及紅角葵等，為錦葵科(Malvaceae)木槿屬一年生草本植物，原產(chǎn)于西非至南亞，現(xiàn)廣泛分布于全球熱帶和亞熱帶地區(qū)，我國臺灣、福建、廣東和云南南部等地大規(guī)模引入栽培[1]。作為一種藥食兩用植物，玫瑰茄含豐富的有機(jī)酸，例如木槿酸、檸檬酸和原兒茶酸等[2-3]。木槿酸是玫瑰茄花萼中的一種特殊物質(zhì)，對心臟病、高血壓、動脈硬化等有較好的療效。此外，玫瑰茄含有的黃酮類、花色素類、木脂素類、還原糖類成分對腸道具有抑菌作用，并能促進(jìn)膽汁分泌，預(yù)防心血管疾病[4-8]。因此，玫瑰茄素有“植物紅寶石”的美譽(yù)。

玫瑰茄特有的營養(yǎng)價值、保健價值及藥用價值決定了其具有廣闊的應(yīng)用開發(fā)前景。然而，玫瑰茄富含酚酸類成分，口感酸澀，直接食用或飲用對胃腸道具有一定的刺激性，導(dǎo)致相關(guān)產(chǎn)品的商品形式較為單一，資源利用不充分[9-11]。玫瑰茄發(fā)酵后口感醇厚、酸甜適宜，已被廣泛用于制作發(fā)酵飲料和發(fā)酵果酒等[12-13]。鑒于玫瑰茄發(fā)酵后的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，本研究將基于UHPLC-LTQ-Orbitrap MS技術(shù)闡明玫瑰茄發(fā)酵過程中主要化學(xué)成分的變化，以期促進(jìn)玫瑰茄資源的開發(fā)和利用，并為其發(fā)酵研究提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

DIONEX Ultimate 3000高效液相色譜儀，LTQ-Orbitrap XL質(zhì)譜：美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源(ESI)和Xcalibur 2.1工作站；R200D型電子分析天平(十萬分之一)：德國Sartorius公司產(chǎn)品；Millipore Synergy UV型超純水機(jī)：美國Millipore公司產(chǎn)品；KQ-250 DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試劑與材料

沒食子酸、兒茶素、槲皮素、原兒茶酸和矢車菊-3-O-葡萄糖苷等5種對照品：純度均不低于98%，成都曼思特生物科技有限公司產(chǎn)品；甲醇、甲酸：均為質(zhì)譜級，美國Fisher公司產(chǎn)品；超純水：由Millipore超純水機(jī)制備。

玫瑰茄藥材：購自亳州市華云中藥飲片有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)張媛副教授鑒定為錦葵科木槿屬草本植物玫瑰茄(HibiscussabdariffaL.)的干燥花萼。

1.3 溶液配制

混合對照品溶液的制備：分別取適量上述5種對照品，精密稱定，加入甲醇制成濃度約為100 mg/L的儲備液，使用時稀釋成適宜濃度的混合對照品溶液。

玫瑰茄供試品溶液的制備：取30 g玫瑰茄藥材粉末，精密稱定，加入300 mL水混合攪拌均勻后，加入一定量的K2HPO4、NaHCO3等，調(diào)至pH 5.8～6.0；然后加入20 g蛋白胨、80 g白砂糖，定容至1 000 mL；在90 ℃水浴條件下滅菌30 min后，以0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

發(fā)酵玫瑰茄供試品溶液的制備：取30 g玫瑰茄藥材粉末，精密稱定，加入300 mL水混合攪拌均勻后，加入K2HPO4調(diào)至pH 4.5～5.0；然后在混合液中添加1 g纖維素酶、1 g果膠酶，于50 ℃下酶解90 min；加入K2HPO4、NaHCO3等，調(diào)至pH 5.8～6.0，再加入20 g蛋白胨、80 g白砂糖，定容至1 000 mL；溶液在90 ℃水浴條件下滅菌30 min，待溫度降至室溫，接種腸膜明串株菌腸膜亞種發(fā)酵(培養(yǎng)溫度25 ℃，發(fā)酵20天)；取發(fā)酵后溶液過濾，濾液過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

1.4 實驗條件

1.4.1色譜條件 Agilent Zorbax SB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流動相：0.1%

甲酸水溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脫條件：0～10 min(5%B)，10～16 min(5%～11%B)，16～66 min(11%～51%B)，66～70 min(51%～55%B)；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件 ESI離子源，負(fù)離子檢測模式；流動相經(jīng)柱后分流進(jìn)入質(zhì)譜檢測器的流速為0.3 mL/min；毛細(xì)管溫度350 ℃；鞘氣流速9 L/min；輔助氣流速3 L/min；噴霧電壓3.0 kV；毛細(xì)管電壓—35 V；管透鏡電壓—110 V；源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)裂解池碰撞能量(CID)35%。樣品采用高分辨FT進(jìn)行全掃描(full scan, FS)，一級掃描分辨率30 000，質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 000。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Xcalibur2.1工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用分子式預(yù)測模塊預(yù)測所有母離子的分子式，相關(guān)參數(shù)設(shè)定為C[0-35]、H[0-50]、O[0-30]、環(huán)不飽和雙鍵數(shù)(RDB equivalent value)[0-15]，質(zhì)量精度誤差在5×10-6以內(nèi)。

2 結(jié)果與討論

采用HPLC-LTQ-Orbitrap MS法分析鑒定玫瑰茄發(fā)酵前后的化學(xué)成分。根據(jù)所獲得的精確分子質(zhì)量，結(jié)合相應(yīng)的色譜保留行為、質(zhì)譜裂解規(guī)律、特征碎片離子以及與對照品比對，最終鑒定出41種化學(xué)成分，其中有5種化學(xué)成分被準(zhǔn)確鑒定，結(jié)果示于圖1和表1。

圖1 玫瑰茄發(fā)酵前后的總離子流圖Fig.1 TIC of water extract and fermentation broth of Hibiscus sabdariffa L.

2.1 有機(jī)酸類成分的鑒定

有機(jī)酸是玫瑰茄中含量最高的一類成分，具有抗氧化、抗癌、抗炎癥等作用。本實驗從玫瑰茄提取液中鑒定出34種有機(jī)酸類成分，包括16種綠原酸類和18種小分子酚酸類；從玫瑰茄發(fā)酵液中鑒定出29種有機(jī)酸類成分，包括15種綠原酸類和14種小分子酚酸類。

2.1.1綠原酸類成分的鑒定 綠原酸類成分是由反式肉桂酸，如咖啡酸(caffiec acid)、阿魏酸(ferulic acid)、對香豆酸(p-coumaric acid)和奎尼酸(quinic acid)及其衍生物縮合而成的酯類化合物。根據(jù)奎尼酸單元羥基成酯的數(shù)目，綠原酸類成分可大致分為單酯類、二酯類、三酯類等。

M19、M32和M33的準(zhǔn)分子離子峰[M—H]-分別為m/z337.092 44、337.092 71、337.092 80，推斷它們可能的分子式為C16H17O8，誤差在±5×10-6范圍內(nèi)。在ESI-MS2質(zhì)譜圖中主要的特征碎片離子為m/z191[quinic acid—H]-、m/z173[quinic acid—H—H2O]-和m/z163[p-

coumaric acid—H]-。研究表明[14-15]，當(dāng)對香豆?；孽セ恢迷?、4或5位時，所產(chǎn)生的ESI-MS2基峰離子分別為m/z163、173、191。結(jié)合該類成分的反相色譜保留行為，分別將M19、M32和M33鑒定為3-對香豆?？崴帷?-對香豆?？崴岷?-對香豆?？崴?。

M10、M24和M28的準(zhǔn)分子離子峰[M—H]-均為m/z353.087 81，其可能的分子式為C16H17O9，誤差在±5×10-6范圍內(nèi)。分析三者的ESI-MS2碎片離子的種類，可知它們均屬于單咖啡?？崴犷惓煞帧慰Х弱？崴犷惢衔镌谫|(zhì)譜裂解過程中產(chǎn)生m/z191[quinic acid—H]-、m/z179[caffiec acid—H]-、m/z173[quinic acid—H—H2O]-和m/z135[caffiec acid—H—CO2]-等特征碎片離子，可能的裂解途徑示于圖2。當(dāng)咖啡酰基在奎尼酸母核上的取代位置為4位時，ESI-MS2基峰離子為m/z173，由此將M28鑒定為隱綠原酸；當(dāng)咖啡?；诳崴崮负松系娜〈恢脼?位和5位時，它們的基峰離子均為m/z191，二者的最明顯區(qū)別在于m/z179的相對豐度：M10的m/z179相對豐度>40%，為新綠原酸；M24的m/z179相對豐度<5%，為綠原酸[16]。

M34和M35的準(zhǔn)分子離子峰[M—H]-分別為m/z367.103 88、367.103 79，推斷可能的分子式為C17H19O9，誤差在±5×10-6范圍內(nèi)。在ESI-MS2譜圖的主要特征碎片離子為m/z193[ferulic acid—H]-、m/z191[quinic acid—H]-、m/z173[quinic acid—H—H2O]-，故推斷二者均為阿魏?？崴犷惓煞?。根據(jù)參考文獻(xiàn)[15]，將M34和M35分別鑒定為3-阿魏?？崴岷?-阿魏?？崴?。

圖2 負(fù)離子模式下，單咖啡酰奎尼酸類成分的裂解途徑 Fig.2 Proposed fragmentation pathway for caffeoylquinic acid in negative ion mode

M7、M9、M13、M14、M16、M20、M22和M28的準(zhǔn)分子離子峰[M—H]-分別為m/z515.140 87、515.140 99、515.141 05、515.141 24、515.141 30、515.141 24、515.141 11、515.141 24，推斷它們的分子式為C22H27O14，誤差均在±5×10-6范圍內(nèi)。結(jié)合上述化合物，經(jīng)CID裂解后均產(chǎn)生m/z353[M—H—caffeoyl/Glu]-、m/z335[M—H—caffeoyl/Glu—H2O]-、m/z191[quinic acid—H]-特征碎片離子，因此，將它們鑒定為單咖啡?？崴崞咸烟擒疹惓煞?。

2.1.2小分子酚酸類成分的鑒定 根據(jù)所獲得的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，M1和M29的準(zhǔn)分子離子峰[M—H]-分別為m/z207.014 53、207.014 74，推斷它們的分子式為C6H7O8，誤差在±5×10-6范圍內(nèi)。在ESI-MS2譜圖中均產(chǎn)生m/z189[M—H—H2O]-和m/z127[M—H—H2O—CO2]-特征碎片離子，因此將M1和M29鑒定為木槿酸及其同分異構(gòu)體。

M2的準(zhǔn)分子離子峰[M—H]-為m/z191.019 65，推斷其可能的分子式為C6H7O7，誤差在±5×10-6范圍內(nèi)。在ESI-MS2譜圖中產(chǎn)生m/z173[M—H—H2O]-、m/z129[M—H—H2O—CO2]-和m/z111[M—H—2H2O—CO2]-特征碎片離子，故將其鑒定為檸檬酸。

M3和M6的準(zhǔn)分子離子峰[M—H]-分別為m/z169.014 47、169.014 40，推斷其可能的分子式為C7H5O5，誤差在±5×10-6范圍內(nèi)。它們的基峰離子均為m/z125[M—H—CO2]-，結(jié)合對照品比對結(jié)果，將M3鑒定為沒食子酸，同時將 M6鑒定為沒食子酸的同分異構(gòu)體。

M4、M5和M23的準(zhǔn)分子離子峰[M—H]-分別為m/z153.019 67、153.019 29、153.019 58，推斷其可能的分子式為C7H5O4，誤差在±5×10-6范圍內(nèi)。三者的ESI-MS2譜圖均產(chǎn)生m/z125[M—H—CO]-和m/z109[M—H—CO2]-特征碎片離子，結(jié)合對照品比對結(jié)果，將M5鑒定為原兒茶酸，將M4和M23鑒定為原兒茶酸的同分異構(gòu)體。

M8、M11和M17的準(zhǔn)分子離子峰[M—H]-分別為m/z179.035 20、179.035 11、179.035 19，推斷它們可能的分子式為C9H7O4，且誤差在±5×10-6范圍內(nèi)。在ESI-MS2譜圖中均產(chǎn)生m/z179[M—H]-、m/z135[M—H—CO2]-和m/z107[M—H—CO—CO2]-特征碎片離子，故推斷它們?yōu)榭Х人峒捌渫之悩?gòu)體[17]。

M12、M15和M36的準(zhǔn)分子離子峰[M—H]-分別為m/z197.045 68、197.045 79、197.045 90，推斷其可能的分子式為C9H9O5，且誤差在±5×10-6范圍內(nèi)。三者的ESI-MS2譜圖均產(chǎn)生m/z182[M—H—CH3]-、m/z153[M—H—CO2]-和m/z138[M—H—CH3—CO2]-特征碎片離子，由此鑒定為丁香酸及其同分異構(gòu)體。

M17和M26的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-分別為m/z163.040 18、163.040 21，推斷其可能的分子式為C9H7O3，且誤差在±5×10-6范圍內(nèi)。二者的ESI-MS2譜圖均產(chǎn)生m/z119[M—H—CO2]-的基峰離子，由此鑒定為對香豆酸及其同分異構(gòu)體。

M25和M30的準(zhǔn)分子離子峰[M—H]-分別為m/z193.050 48、193.050 89，推斷其可能的分子式為C10H9O4，且誤差在±5×10-6范圍內(nèi)。二者的ESI-MS2譜圖均產(chǎn)生m/z178[M—H—CH3]-、m/z149[M—H—CO2]-和m/z134[M—H—CO2—CH3]-等碎片離子，由此鑒定M25和M30為阿魏酸及其同分異構(gòu)體[18]。

2.2 黃酮類成分的鑒定

玫瑰茄中的黃酮類化合物主要為黃酮醇和黃烷醇，多以單體或聚合物的形式存在。本研究從玫瑰茄提取液中鑒定出4種黃酮類成分；從玫瑰茄發(fā)酵液中鑒定出2種黃酮類成分。

M21的準(zhǔn)分子離子峰[M—H]-為m/z289.071 66，推斷其可能的分子式為C15H13O6，誤差為3.443×10-6。在ESI-MS2譜圖中，m/z289首先中性丟失1分子CO2，產(chǎn)生碎片離子m/z245[M—H—CO2]-，同時產(chǎn)生m/z203[M—H—C2H2O—CO2]-和m/z179[M—H—C2H2O—C3O2]-等特征離子，結(jié)合對照品對比及相關(guān)文獻(xiàn)[19]，將M21鑒定為兒茶素。

M39的準(zhǔn)分子離子峰[M—H]-為m/z609.146 42，推斷其可能的分子式為C27H29O16，誤差為2.313×10-6。由文獻(xiàn)[20]可知，蕓香糖為1分子鼠李糖與1分子葡萄糖連接，在CID裂解過程中易直接丟失蕓香糖殘基，即減少308 u。M39經(jīng)CID裂解后產(chǎn)生m/z301[M—H—Rha—Glu]-、m/z300[M—2H—Rha—Glu]-、m/z255[M—H—Rha—Glu—H2O—CO]-基峰離子。其中，m/z301丟失C環(huán)羰基形成m/z273[M—H—Rha—Glu—CO]-，m/z255經(jīng)重排并丟失CO形成m/z227[M—H—Rha—Glu—H2O—2CO]-碎片離子。由此將M39鑒定為蘆丁。同理，M40的準(zhǔn)分子離子峰[M—H]-為m/z593.151 67，推斷其可能的分子式為C27H29O15，誤差為2.653×10-6。m/z593經(jīng)CID裂解后產(chǎn)生m/z285[M—H—Rha—Glu]-和m/z284[M—2H—Rha—Glu]-基峰離子。其中，m/z285丟失C環(huán)羰基形成m/z257[M—H—Rha—Glu—CO]-碎片離子或開環(huán)重排生成m/z185[M—H—Rha—Glu—C4H4O3]-碎片離子，由此推斷M40為山奈酚蕓香糖苷[21]。

M41的準(zhǔn)分子離子峰[M—H]-為m/z301.035 06，推斷其可能的分子式為C15H9O7，誤差為2.594×10-6。在ESI-MS2譜圖中，m/z301通過RDA重排形成m/z151[M—H—C4H4O5—H2O]。同時，m/z301丟失C環(huán)羰基形成m/z273[M—H—CO]-，并繼續(xù)丟失1分子H2O形成m/z257[M—H—CO—H2O]-。結(jié)合對照品比對和文獻(xiàn)[22]，可將M41鑒定為槲皮素。

2.3 花青素類成分的鑒定

玫瑰茄花青素，也叫玫瑰茄花色苷、玫瑰茄紅色素，是玫瑰茄花萼中富含的一種生理活性成分，主要包括飛燕草素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、飛燕草素-3-桑布雙糖苷和矢車菊素-3-桑布雙糖苷等。本研究從玫瑰茄提取液中鑒定出2種花青素類成分；從玫瑰茄發(fā)酵液中鑒定出1種花青素類成分。

M31的準(zhǔn)分子離子峰[M—H]-為m/z447.094 18，推斷其可能的分子式為C21H19O11，誤差為4.456×10-6。在ESI-MS2譜圖中，m/z447離子中性丟失1分子葡萄糖殘基，產(chǎn)生m/z285[M—H—Glu]-和m/z284[M—2H—Glu]-碎片離子。結(jié)合對照品比對，可將M31鑒定為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷。

M37的準(zhǔn)分子離子峰[M—H]-為m/z595.130 80，推斷其可能的分子式為C26H27O16，誤差為2.418×10-6。在ESI-MS2譜圖中，m/z595易丟失1分子桑布雙糖(Sam)形成m/z301[M—H—Sam]-和m/z300[M—2H—Sam]-，并生成m/z255[M—H—Sam—H2O—CO]-等碎片離子，由此可將M37鑒定為飛燕草素-3-O-桑布雙糖苷。

2.4 木脂素類成分的鑒定

玫瑰茄作為錦葵科植物，含有一定量的木脂素類成分。本研究從玫瑰茄提取液和玫瑰茄發(fā)酵液中均鑒定出1種木脂素類成分。

根據(jù)所獲得的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，M38的準(zhǔn)分子離子峰[M—H]-為m/z417.155 85，推斷其可能的分子式為C22H25O8，誤差為3.490×10-6。在ESI-MS2譜圖中，M38離子產(chǎn)生m/z402[M—H—CH3]-碎片離子，表明其結(jié)構(gòu)式中含有甲氧基；m/z191丟失1分子H2O生成m/z166，同時還產(chǎn)生m/z371[M—H—CO2—H2O]-，由此可將M38鑒定為丁香脂素。

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用UHPLC-LTQ-Orbitrap 高分辨質(zhì)譜技術(shù)對玫瑰茄發(fā)酵前后的有機(jī)酸、黃酮、花青素及木脂素類化學(xué)成分進(jìn)行分析檢測。根據(jù)所獲得的精確分子質(zhì)量，同時結(jié)合色譜保留行為、質(zhì)譜裂解規(guī)律、特征碎片離子、對照品比對以及相關(guān)文獻(xiàn)報道，共鑒定出41種化學(xué)成分，包括34種有機(jī)酸類、4種黃酮類、2種花青素類及1種木脂素類。其中，從發(fā)酵前玫瑰茄提取液中鑒定出41種化學(xué)成分，從發(fā)酵玫瑰茄提取液中鑒定出33種化學(xué)成分。研究結(jié)果表明，玫瑰茄發(fā)酵前后其中有機(jī)酸成分的種類及含量發(fā)生不同程度的變化。例如，玫瑰茄發(fā)酵液中的綠原酸類成分含量發(fā)生明顯下降甚至消失，但仍保留了其特有的木槿酸、檸檬酸和花青素等有效成分，這可能就是玫瑰茄經(jīng)發(fā)酵后其酸澀感和胃腸刺激性降低的主要原因。

其次，本研究優(yōu)選腸膜明串株菌腸膜亞種對玫瑰茄進(jìn)行發(fā)酵，該菌種作為可用于食品的菌種之一，自身有較好的發(fā)酵特性，且耐酸性佳，其強(qiáng)大的生物轉(zhuǎn)化能力有益于玫瑰茄中活性成分的轉(zhuǎn)化，提高藥效。綜上，本研究系統(tǒng)地闡明了玫瑰茄發(fā)酵前后的活性物質(zhì)變化，可為多渠道、多途徑開發(fā)玫瑰茄相關(guān)產(chǎn)品，提高相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。