李重九

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100083)

農(nóng)藥廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中防治病蟲草害，控制或調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)。20世紀(jì)40年代，第一個(gè)合成農(nóng)藥DDT問世，由此開始了有機(jī)合成農(nóng)藥發(fā)展的新階段。施用農(nóng)藥后，殘留在農(nóng)作物上和環(huán)境中的痕量農(nóng)藥對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境構(gòu)成了一定的風(fēng)險(xiǎn)[1-2]，農(nóng)藥殘留檢測(cè)可為食品、中藥材、環(huán)境生態(tài)安全評(píng)價(jià)提供重要依據(jù)。

農(nóng)藥殘留分析有如下特點(diǎn)：

1) 檢測(cè)基質(zhì)多樣。農(nóng)藥施用在開放環(huán)境中，除多種農(nóng)作物和防治對(duì)象外，環(huán)境(水、土、氣)及非靶標(biāo)動(dòng)植物、微生物均暴露在施用的農(nóng)藥中。殘留在農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境中的農(nóng)藥會(huì)隨著食物鏈進(jìn)入人類和其他生物體內(nèi)。因此，農(nóng)藥殘留檢測(cè)的樣品基質(zhì)種類繁多，包括種植的各種農(nóng)作物，養(yǎng)殖的各種畜禽、水產(chǎn)品和以其為來源的各種食材和加工食品，危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的有害生物(病原微生物、害蟲、雜草、鼠、蛞蝓等)、環(huán)境樣品(大氣、地下水及地表水、土壤)、生物樣品(環(huán)境中一切非靶標(biāo)生物以及隨飼料攝入殘留農(nóng)藥的動(dòng)物組織)、農(nóng)產(chǎn)品食用者體液(如人尿液、血液或其他樣品)等。

2) 檢測(cè)對(duì)象復(fù)雜。目前，我國(guó)登記使用的農(nóng)藥有600余種，國(guó)際上應(yīng)用或曾用過的農(nóng)藥達(dá)上千種。這些藥物及其部分有生物活性的代謝物的分子結(jié)構(gòu)不同、理化性質(zhì)各異。無論是農(nóng)作物還是環(huán)境樣品(除了在人為控制條件下進(jìn)行科研實(shí)驗(yàn)的樣品)，農(nóng)藥種類往往不止一種，分析時(shí)常需要在復(fù)雜基質(zhì)中同時(shí)檢測(cè)多種性質(zhì)不同、類別各異的殘留農(nóng)藥。

3) 待測(cè)物質(zhì)含量低。現(xiàn)代農(nóng)藥活性較強(qiáng)，施藥濃度常常低于0.1%，而且農(nóng)業(yè)用藥有間歇性，經(jīng)過降解轉(zhuǎn)化后，樣品中待測(cè)藥劑的含量很低，僅為mg/kg～ng/kg級(jí)[3-6]。

從復(fù)雜基質(zhì)中同時(shí)檢測(cè)痕量或超痕量的多種理化性質(zhì)各異、分子結(jié)構(gòu)不同的組分，是農(nóng)藥殘留檢測(cè)的難點(diǎn)。幾十年來，農(nóng)藥殘留分析技術(shù)不斷進(jìn)步，從單一種類農(nóng)藥殘留的分析到多類多種農(nóng)藥殘留的分析，從目標(biāo)化合物的檢測(cè)到未知物的檢測(cè)，每一步進(jìn)展都伴隨著分析技術(shù)的進(jìn)步，特別是色質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)的進(jìn)步。從多類多農(nóng)藥殘留分析技術(shù)的發(fā)展中可以看到，色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在其中發(fā)揮了重大作用。

1 傳統(tǒng)農(nóng)藥多殘留檢測(cè)技術(shù)的缺陷

按照功能分類，農(nóng)藥主要分為殺蟲劑、殺菌劑、除草劑和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。四者相比，殺蟲劑發(fā)展較早，其分子極性較弱，對(duì)人類的急性毒性一般高于其他類別農(nóng)藥，故早期的農(nóng)藥殘留分析主要注重殺蟲劑的檢測(cè)，以氣相色譜法為主。毛細(xì)管柱結(jié)合選擇性檢測(cè)器，其分離能力強(qiáng)，有一定的選擇性，在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)是有機(jī)合成農(nóng)藥殘留分析的主要工具。然而，氣相色譜的選擇性檢測(cè)器具有局限性，使其僅能同時(shí)檢測(cè)含某一類(或幾類)元素的化合物，因此其僅為單類或二類多殘留檢測(cè)方法，如電子捕獲檢測(cè)器(ECD)用于檢測(cè)有機(jī)氯農(nóng)藥或含鹵族元素的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，火焰光度檢測(cè)器(FPD)用于檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥。對(duì)于熱穩(wěn)定性差的氨基甲酸酯類農(nóng)藥，則需要用液相色譜分離，衍生化后用熒光檢測(cè)器測(cè)定[7-8]，即1個(gè)樣品要用3種不同方法檢測(cè)。即使這樣，由于色譜儀僅靠物質(zhì)的保留時(shí)間進(jìn)行定性分析，并不能得到分子結(jié)構(gòu)信息。當(dāng)樣品復(fù)雜時(shí)，許多組分之間的保留時(shí)間只差數(shù)秒，甚至重合，很難判定目標(biāo)化合物。即使用2根性質(zhì)不同的色譜柱進(jìn)一步確認(rèn)分析對(duì)象，其分析結(jié)果對(duì)于目標(biāo)化合物的確認(rèn)能力也是有限的。不能被色譜完全分離的組分，無法對(duì)其進(jìn)行定量分析。對(duì)于復(fù)雜樣品，選擇性檢測(cè)器排除干擾的能力有限。例如，農(nóng)藥殘留檢測(cè)常用的氣相色譜檢測(cè)器ECD，除了對(duì)鹵族元素響應(yīng)值高外，對(duì)氧、硫、氮等具有電負(fù)性的干擾元素也有響應(yīng)。在復(fù)雜的生物樣本中，例如中草藥和動(dòng)物源食品中，這些干擾元素的含量超過殘留農(nóng)藥含量的百倍、甚至千倍以上，ECD檢測(cè)器的選擇性無法排除其干擾。另一個(gè)檢測(cè)器FPD，依據(jù)分子發(fā)射光譜產(chǎn)生選擇性，無論用磷濾光片還是硫?yàn)V光片，有機(jī)磷和有機(jī)硫化合物的發(fā)射光譜都有交叉部分，無法排除相互的影響。在富含有機(jī)硫化合物的樣本中，如百合科植物蔥、蒜、韭菜等，大量的硫醚類天然產(chǎn)物往往會(huì)掩蓋有機(jī)磷農(nóng)藥的信號(hào)。

在色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用以前，以上問題長(zhǎng)期難以解決。

2 氣質(zhì)聯(lián)用儀是農(nóng)藥多類多殘留檢測(cè)分析方法發(fā)展的起點(diǎn)

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)結(jié)合了色譜的分離能力和質(zhì)譜的分子結(jié)構(gòu)鑒定能力，一問世便受到農(nóng)藥殘留分析工作者的關(guān)注。在1963年的國(guó)際農(nóng)藥會(huì)議上就有預(yù)言：在整個(gè)農(nóng)藥殘留領(lǐng)域研究中，“……展望未來，質(zhì)譜儀與氣相色譜儀(原文為氣液色譜儀)聯(lián)用將得到發(fā)展，……這種裝置的高昂價(jià)格不會(huì)阻礙(人們)對(duì)這種吸引人的技術(shù)的鉆研”[9]。微電子工業(yè)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的快速發(fā)展，使GC-MS聯(lián)用裝置突破了原來色譜儀與質(zhì)譜儀的局限，具有了嶄新的功能：1) 通過計(jì)算機(jī)，根據(jù)采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)重建色譜圖和質(zhì)量色譜圖，對(duì)色譜分離不佳的組分通過質(zhì)量色譜圖(提取離子色譜圖)進(jìn)一步分離，彌補(bǔ)了單一色譜柱分離能力的不足；2) 從60年代開始，英國(guó)和美國(guó)開始建立各種化合物(包括農(nóng)藥)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，不斷研究并完善待測(cè)化合物的譜庫檢索方法，現(xiàn)代的質(zhì)譜儀大多具有譜庫檢索功能。對(duì)難以用質(zhì)譜區(qū)分的異構(gòu)體(如構(gòu)象異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體、取代基位置異構(gòu)體及手性異構(gòu)體)，都可以用收集于譜庫中的色譜保留指數(shù)進(jìn)行區(qū)分；3) 通過計(jì)算機(jī)控制質(zhì)譜的質(zhì)量分析器掃描參數(shù)，建立了各種掃描方式，在未知物的結(jié)構(gòu)鑒定、質(zhì)譜裂解途徑研究方面發(fā)揮了重要作用，并成為復(fù)雜基質(zhì)中檢測(cè)痕量物質(zhì)的必要手段[10-11]。為強(qiáng)調(diào)計(jì)算機(jī)技術(shù)的作用，氣質(zhì)聯(lián)用儀曾經(jīng)被稱為氣相色譜-質(zhì)譜-計(jì)算機(jī)系統(tǒng)(GC-MS-DS)。

早期的儀器受靈敏度的限制，主要檢測(cè)可以高度濃縮的樣本，如大氣、水中的農(nóng)藥及污染物。選擇離子檢測(cè)技術(shù)有助于排除干擾，提高儀器檢測(cè)靈敏度。70年代，美國(guó)EPA用氣相色譜填充柱和質(zhì)譜選擇離子掃描方式(SIM)檢測(cè)了飲用水樣品中的艾氏劑、狄氏劑和DDT，從700多個(gè)樣品中發(fā)現(xiàn)了少數(shù)樣品中含量?jī)H有μg/L級(jí)的狄氏劑和DDT。直到80年代，質(zhì)譜儀掃描速度仍很慢，在色譜分析全過程中所選擇的特征離子總數(shù)不超過25個(gè)，而且不能在色譜運(yùn)行過程中更換，故在分析中常常對(duì)每種農(nóng)藥僅能選用一個(gè)離子(被稱為單離子檢測(cè))，這些都影響了農(nóng)藥多殘留分析的發(fā)展。90年代后，氣質(zhì)聯(lián)用儀面貌一新：專用的低流失毛細(xì)管柱，不但使色譜分離能力提高，而且降低了因柱流失產(chǎn)生的化學(xué)噪音[12-13]；質(zhì)譜掃描速度不斷提高，從1 400～2 000 u/s提高到10 000～20 000 u/s；更重要的是，可以設(shè)置時(shí)間程序進(jìn)行選擇離子掃描，即在多組分檢測(cè)時(shí)按照待測(cè)組分的色譜流出時(shí)間，用計(jì)算機(jī)編程針對(duì)每一個(gè)待測(cè)物和干擾物“精準(zhǔn)”選擇特征離子進(jìn)行掃描[14]。與傳統(tǒng)的氣相色譜基于元素的選擇性檢測(cè)器相比，質(zhì)譜SIM是針對(duì)每種待測(cè)化合物分子結(jié)構(gòu)的選擇性檢測(cè)器，不但選擇性更強(qiáng)，分析通量高，而且涵蓋的農(nóng)藥種類更普遍。與此同時(shí)，儀器操作軟件也面貌一新，不再需要用戶掌握復(fù)雜的計(jì)算機(jī)語言才能輸入儀器操作指令，使選擇離子方法的建立簡(jiǎn)便易行。這些因素都促使農(nóng)藥多類多殘留檢測(cè)方法獲得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。筆者在80年代初用普通毛細(xì)管柱在Finnigen MAT 4510 GC-MS儀器上，僅能檢測(cè)數(shù)種農(nóng)藥在水果中的殘留量，即使采用了選擇離子檢測(cè)方法，最低檢出限也僅能達(dá)到 1 mg/kg。而本世紀(jì)初，數(shù)十種至百余種分子結(jié)構(gòu)不同的有機(jī)氯、有機(jī)磷、有機(jī)氮和擬除蟲菊酯等農(nóng)藥可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)提取、同時(shí)檢測(cè)[15]。由于色譜分離能力及質(zhì)譜掃描速度的限制，一次色譜進(jìn)樣分析的農(nóng)藥數(shù)目限制在百余種。為了增加檢測(cè)通量，往往將提取的樣品分?jǐn)?shù)次進(jìn)樣。如Julie Fillion將提取的樣品分2次進(jìn)樣，建立了蔬菜水果中251種農(nóng)藥及其代謝物的殘留檢測(cè)方法，其中用GC-MS/SIM檢測(cè)的農(nóng)藥為239種，既包括殺蟲劑，也含有殺菌劑和除草劑。該方法已經(jīng)用于各種水果和蔬菜樣品的分析，如蘋果、香蕉、甘藍(lán)、胡蘿卜、黃瓜、萵苣、柑桔、梨、胡椒和菠蘿等。對(duì)于大多數(shù)化合物，其檢測(cè)限在0.02～1.0 mg/kg之間，超過80%的化合物，其檢測(cè)限不高于0.04 mg/kg[16]。

影響SIM技術(shù)發(fā)展重要的影響因素包括兩方面：一是色譜儀的分離能力和保留時(shí)間的重復(fù)性；二是質(zhì)譜儀的掃描速度。在農(nóng)藥多殘留分析中，氣相色譜的運(yùn)行時(shí)間一般為30～40 min，一般可對(duì)百余種農(nóng)藥進(jìn)行分離。當(dāng)待測(cè)組分過多時(shí)，可以分為若干組分別進(jìn)樣分析。如龐國(guó)芳等詳細(xì)報(bào)道了478種農(nóng)藥殘留的GC-MS(SIM)分析方法。在色譜運(yùn)行的38 min內(nèi)，401種農(nóng)藥的保留時(shí)間集中在10～30 min內(nèi)。為了使每種農(nóng)藥的色譜峰不少于10個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，其特征離子的駐留時(shí)間不低于10 ms，色譜分離采用多階程序升溫，將被測(cè)農(nóng)藥分為5組，分5次進(jìn)樣分析，并將每組色譜運(yùn)行時(shí)間分割為25～38個(gè)時(shí)間段，分別設(shè)置質(zhì)譜掃描參數(shù)。從該實(shí)驗(yàn)中可以看出，在一個(gè)時(shí)間段內(nèi)，待測(cè)組分越多，同時(shí)掃描的離子數(shù)目越多，每一離子的駐留時(shí)間就越短；儀器檢測(cè)到的離子數(shù)目少，靈敏度下降。在每個(gè)時(shí)間段中不超過10種農(nóng)藥，每種農(nóng)藥采用2～3個(gè)特征離子檢測(cè)的情況下，一個(gè)時(shí)間段中同時(shí)掃描數(shù)目不超過30個(gè)，檢測(cè)農(nóng)藥不超過10種。目前儀器的掃描速度提高到10 000/s或以上，在同一時(shí)間窗口內(nèi)可以掃描更多特征離子。此外，儀器的載氣流量壓力自動(dòng)控制系統(tǒng)及儀器溫度的精準(zhǔn)控制系統(tǒng)，使色譜分離在程序升溫時(shí)，其柱溫及載氣流速和壓力可按照預(yù)先設(shè)定的程序變化或者恒定不變，由此保證了待測(cè)組分保留時(shí)間及色譜流出時(shí)間的穩(wěn)定性，可使質(zhì)譜儀根據(jù)各個(gè)組分色譜流出時(shí)間準(zhǔn)確及時(shí)地切換不同的掃描離子?；贕C-MS/SIM技術(shù)，我國(guó)建立了一系列百種以上農(nóng)藥的多殘留檢測(cè)方法，樣品基質(zhì)包括中草藥、糧谷、果蔬、茶葉、飼料、牛奶和奶粉、蜂蜜及果酒等農(nóng)產(chǎn)品和食品，也包括水和土壤等環(huán)境樣品，大多數(shù)殘留農(nóng)藥的最低檢出限達(dá)到10 μg/kg(或10 μg/L)[17-26]。

與電子轟擊電離(EI)的通用性相比，負(fù)化學(xué)電離(NCI)具有選擇性，即待測(cè)農(nóng)藥分子捕獲低能電子的能力高于基質(zhì)干擾物。研究者嘗試?yán)肗CI的選擇性，結(jié)合色譜分離及選擇離子檢測(cè)，分析復(fù)雜基質(zhì)中多種類痕量農(nóng)藥。如日本生藥研究所Takaomi等[27]研究了天然藥物葛根、大黃、決明子中56種農(nóng)藥的GC-NCI-MS/SIM分析方法，其中包括有機(jī)氯、有機(jī)磷及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥。在藥物中添加水平為0.2 mg/kg及0.4 mg/kg的回收率為70%～111%，大多數(shù)農(nóng)藥的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)低于10%。但由于NCI適用范圍窄，其多用于農(nóng)藥單殘留檢測(cè)。

3 液質(zhì)聯(lián)用儀與極性農(nóng)藥多殘留檢測(cè)技術(shù)

隨著農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的發(fā)展，農(nóng)用殺菌劑、除草劑的應(yīng)用越來越廣泛，其中大部分農(nóng)藥的極性強(qiáng)，一些農(nóng)藥的極性有毒代謝物和生物源殺蟲劑(如多殺霉素、阿維菌素等)無法用氣相色譜分析，使得液相色譜在農(nóng)藥殘留分析中的作用逐漸加強(qiáng)。但是，液相色譜的光譜檢測(cè)器、紫外-可見光檢測(cè)器(UV-VIS)的選擇性較差，熒光檢測(cè)器的適用性窄，這迫切需要廣譜且選擇性較好的質(zhì)譜檢測(cè)器。另外，液相色譜流動(dòng)相的去除，也是液相色譜儀與質(zhì)譜儀連接必須解決的難題。

早期比較成功的接口是傳送帶式，由傳送帶、加熱器及真空泵組成。不斷移動(dòng)的傳送帶接收液相色譜柱尾端流出的流動(dòng)相和樣品組分，當(dāng)傳送帶通過加熱區(qū)時(shí)，流動(dòng)相蒸發(fā)后被真空泵抽走，樣品進(jìn)入質(zhì)譜儀，高溫氣化后經(jīng)電子轟擊電離或化學(xué)電離。這種接口要求流動(dòng)相易揮發(fā)，只適用于正相液相色譜，無法分析極性和熱不穩(wěn)定性農(nóng)藥。此外，由于無法消除難揮發(fā)組分在傳送帶上造成的記憶效應(yīng)，儀器本底高，不能進(jìn)行痕量分析。而后發(fā)展的粒子束接口(PB)以霧化方式去除液相色譜流動(dòng)相的溶劑，由于霧滴比表面積大，去除溶劑快速高效，解決了反相液相色譜與質(zhì)譜儀連接的問題。使用粒子束接口，Kim等[28]嘗試了用化學(xué)電離及選擇離子掃描方式分析蘋果中的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑——丁酰肼；Doerge等[29]研究了用電子轟擊電離及全掃描方式檢測(cè)果蔬中殺菌劑的代謝物——乙撐硫脲。粒子束接口的應(yīng)用，使被檢測(cè)對(duì)象擴(kuò)展到極性和熱不穩(wěn)定性農(nóng)藥的范圍，但由于儀器整體靈敏度低，使其難以發(fā)揮作用。

20世紀(jì)80年代，產(chǎn)生了一種新的軟電離方式——熱噴霧，它也可以作為液質(zhì)聯(lián)用儀的接口。液相色譜流動(dòng)相和其中的待測(cè)組分流出色譜柱后進(jìn)入加熱的不銹鋼毛細(xì)管，在毛細(xì)管尾部氣化，以霧狀形式高速噴出。當(dāng)霧滴進(jìn)入離子源的低壓空間區(qū)域時(shí)，液滴被迅速蒸發(fā)。當(dāng)液相色譜的流動(dòng)相中含有緩沖液時(shí)，液滴中的正電荷或負(fù)電荷留在待測(cè)組分上使其離子化，離子源的推斥極和離子透鏡將生成的離子引出離子源使其進(jìn)入質(zhì)量分析器。熱噴霧接口脫溶劑的效果優(yōu)于粒子束，可以根據(jù)農(nóng)藥分子結(jié)構(gòu)選擇正離子或負(fù)離子檢測(cè)，從90年代開始被用于多種農(nóng)藥殘留分析，如氨基甲酸酯類、苯甲酰脲、擬除蟲菊酯類殺蟲劑(氰戊菊酯)、滅菌丹、異菌脲、硝基苯磺胺除草劑(安磺靈)等。作為軟電離技術(shù)，其碎片離子少，高質(zhì)量區(qū)的離子豐度相對(duì)較高。當(dāng)采用選擇離子掃描時(shí)，其選擇性好，靈敏度為0.025～1 mg/kg[30-33]，因被測(cè)農(nóng)藥分子的結(jié)構(gòu)差異而不同。

電噴霧離子化 (ESI)和大氣壓化學(xué)電離(APCI)是90年代發(fā)展起來的2種常壓下的軟電離方式，與熱噴霧電離源一樣，二者均可以同時(shí)作為液質(zhì)聯(lián)用儀的接口。由于在常壓下電離，只有帶電粒子在高壓電場(chǎng)引導(dǎo)下進(jìn)入質(zhì)譜儀，中性粒子或未氣化的液滴被排斥在質(zhì)譜儀真空區(qū)外。這樣“徹底”排除了流動(dòng)相的干擾，大氣壓電離技術(shù)很快取代了熱噴霧電離和粒子束接口，成為液質(zhì)聯(lián)用儀的主要電離方式。

與此同時(shí)，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)快速發(fā)展。與GC-MS單級(jí)質(zhì)譜不同，用于農(nóng)藥殘留分析的儀器主要為三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，在第一組四極桿中選擇性掃描，挑選特征離子為母離子，在碰撞室(第二組四極桿)中將其裂解，在第三組四極桿中選擇特征子離子用于殘留檢測(cè)。對(duì)每一種農(nóng)藥，可選擇相同的母離子，也可選擇不同的母離子。這種對(duì)母離子、子離子都用選擇性掃描方式進(jìn)行分析的技術(shù)，稱為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)或者選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)。二級(jí)質(zhì)譜技術(shù)增強(qiáng)了色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的選擇性，提高了信噪比和靈敏度。自21世紀(jì)初以來，不斷有LC-MS/MS用于農(nóng)藥殘留分析的報(bào)道。最初LC-MS只用于分析一些極性強(qiáng)、不易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性差，無法采用氣相色譜進(jìn)行分析的農(nóng)藥，如磺酰脲類、苯氧羧酸類等除草劑、以及農(nóng)藥的極性代謝物[34-35]。后來，由于大多數(shù)農(nóng)藥分子中含有雜原子，可以用ESI電離，一些原來用GC-MS(SIM)分析的農(nóng)藥也開始采用LC-MS分析。由于串聯(lián)質(zhì)譜法排除干擾能力以及對(duì)被測(cè)物分子結(jié)構(gòu)鑒定能力均強(qiáng)于GC-MS(SIM)法，一段時(shí)間內(nèi)有LC-MS/MS方法優(yōu)于GC-MS(SIM)方法的觀點(diǎn)，其代表為Alder等于2006年在Mass Spectrom Rev上發(fā)表的文章[36]。該作者選擇了500種農(nóng)藥，分別用LC-ESI-MS/MS、GC-EI-MS(SIM)分析，比較檢測(cè)結(jié)果。農(nóng)藥品種選擇的主要原則是：優(yōu)先考慮歐盟限用的農(nóng)藥，以及食物監(jiān)控項(xiàng)目中經(jīng)常被檢出的農(nóng)藥和重要的農(nóng)藥代謝物。這500種農(nóng)藥覆蓋面廣，具有代表性，包括81種有機(jī)磷類、43種氨基甲酸酯類、40種有機(jī)氯類、26種磺酰脲類、24種三唑類、23種三嗪類、22種其他脲類、19種擬除蟲菊酯類、12種芳氧苯氧基丙酸鹽類和10種芳氧羧酸類農(nóng)藥，其余200種化合物在《農(nóng)藥手冊(cè)》中歸屬于90余種化學(xué)品類。上述農(nóng)藥的生物作用不同，包括172種除草劑、171種殺蟲劑、105種殺菌劑和52種其他類型的農(nóng)藥(殺螨劑、殺菌劑、除草安全劑、滅螺劑、殺線蟲劑、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑)。未被選擇的農(nóng)藥多屬于很少在食品中檢出的除草劑。實(shí)驗(yàn)對(duì)比結(jié)果表明，135種農(nóng)藥在GC進(jìn)樣口中不揮發(fā)或者熱不穩(wěn)定，無法用GC-MS(EI)分析，但僅有49種農(nóng)藥在LC-MS上無響應(yīng)，它們或是不宜用ESI電離，或是極性較弱無法用反相色譜分析。對(duì)于兩種方法都可以分析的農(nóng)藥，檢測(cè)靈敏度差別明顯，其差別甚至可達(dá)到3～4個(gè)數(shù)量級(jí)。比較最低檢測(cè)限的中位值可以清楚發(fā)現(xiàn)，LC-MS/MS方法具有更高的靈敏度，許多農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液用LC-MS/MS的檢測(cè)濃度可低至0.1～1 μg/L；而GC-MS最低檢測(cè)限的中位值明顯較高，為100μg/L。只有2種分析物(氯丙菊酯和腐霉利)由GC-MS檢測(cè)靈敏度更高，19種農(nóng)藥(乙基溴硫磷、氯甲磷、殺螨酯、甲基毒死蜱、苯腈磷、殺螟硫磷、草滅特、氰氟草酯、除線磷、二苯胺、S-氰戊菊酯、殺螟松、氰戊菊酯、λ-氯氟腈菊酯、蟲螨畏、甲基對(duì)硫磷、甲拌磷、丙硫磷、甲基立枯磷)在GC-MS與LC-MS/MS的檢測(cè)中靈敏度相似。與前者相比，LC-MS/MS的優(yōu)勢(shì)：一是進(jìn)樣體積大(20 μLvs. 1 μL)；二是軟電離技術(shù)(ESI)使農(nóng)藥分子碎片離子少，由此可以在高質(zhì)量數(shù)范圍內(nèi)得到較強(qiáng)的母離子，便于進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析[36]。LC-MS的不足之處在于共萃基質(zhì)的干擾使電離效率下降。

4 多類多殘留農(nóng)藥檢測(cè)

無論是GC-MS還是LC-MS/MS，都不能單獨(dú)檢測(cè)全部需要檢測(cè)的農(nóng)藥，于是產(chǎn)生了二者結(jié)合的多類多殘留檢測(cè)方法。如，龐國(guó)芳等[18]研究了839種農(nóng)藥和化學(xué)污染物在動(dòng)物源食品(牛肉、羊肉、豬肉、雞肉和兔肉)中的殘留分析方法。對(duì)脂肪含量較高的樣品，提取后經(jīng)凝膠色譜凈化，用GC-MS(SIM)和LC-MS/MS分析。在839種化合物中，478種適合GC-MS(SIM)分析，379種適合LC-MS/MS分析。在GC-MS進(jìn)樣1 μL，LC-MS/MS進(jìn)樣20 μL的情況下，同樣得出了后者靈敏度較高的結(jié)論。

與除草劑和殺菌劑相比，殺蟲劑對(duì)食品安全的影響更大，而大多數(shù)殺蟲劑極性較弱，分子質(zhì)量低于650 u，可用GC-MS分析。有些必須檢測(cè)的農(nóng)藥，例如有機(jī)氯類、擬除蟲菊酯類，因其極性弱，難以由ESI電離，無法用LC-MS檢測(cè)，大量檢測(cè)工作仍用GC或GC-MS(SIM)進(jìn)行。然而，GC-MS(SIM)靈敏度并不高于GC的選擇性檢測(cè)器，對(duì)于GC檢測(cè)的陽性樣品需要用色質(zhì)聯(lián)用法確證時(shí)，其靈敏度和選擇性往往達(dá)不到要求，在檢測(cè)復(fù)雜樣品時(shí)，基質(zhì)共萃物的干擾無法排除，如含大量硫醚的韭菜、蔥、蒜等蔬菜，次生代謝產(chǎn)物豐富的茶葉、咖啡和中草藥等，GC-MS(SIM)無法解決實(shí)際問題，因此，GC-MS/MS重新引起了人們的關(guān)注。

早在90年代就有GC-MS/MS檢測(cè)農(nóng)藥多殘留的報(bào)道，所用的儀器包括三重四極桿質(zhì)譜儀和離子阱質(zhì)譜儀。研究表明，串聯(lián)質(zhì)譜法比氣相色譜選擇性檢測(cè)器和GC-MS(SIM)具有更高的靈敏度。Martinez等[37]用GC-ECD、GC-EI-MS、GC-EI-MS/MS三種方法檢測(cè)水中12種殘留農(nóng)藥。三者中，GC-MS/MS的檢出限最低，除了克菌丹為26 ng/L，其余化合物的檢出限均在 2～9 ng/L之間；GC-ECD的選擇性、適用范圍及靈敏度均不如GC-MS/MS，有4種農(nóng)藥的最低檢出濃度在18～27 ng/L之間；GC-EI-MS最差。文獻(xiàn)[38]比較了GC-NPD、GC-MS、GC-MS/MS三種方法對(duì)水中11種有機(jī)磷殘留農(nóng)藥的最低檢出濃度，GC-MS/MS法最低，為1～40 ng/L，GC-NPD法的最低檢出濃度為4～44 ng/L，GC-MS/MS法的回收率和重現(xiàn)性均滿足殘留檢測(cè)的要求。另外，也有其他文獻(xiàn)報(bào)道了GC-MS/MS方法的選擇性和靈敏度與PFPD檢測(cè)器相當(dāng)[39-40]。由此可見，對(duì)于氣相色譜選擇性檢測(cè)器得到的陽性樣品，GC-MS/MS法可滿足對(duì)其進(jìn)一步確認(rèn)的要求。Won等[41]比較了166種有機(jī)氯、有機(jī)磷、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥及其代謝物、異構(gòu)體在菠菜中的殘留檢測(cè)方法。樣品基質(zhì)經(jīng)簡(jiǎn)單提取凈化后，添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，分別用GC-MS/MS法和GC-MS/SIM法進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于每一種農(nóng)藥，文中列出了串聯(lián)質(zhì)譜法所用的2對(duì)特征離子和CID能量，以及選擇離子檢測(cè)所用的4個(gè)特征離子及其相對(duì)豐度比，同時(shí)對(duì)比2種方法的檢出結(jié)果和回收率。當(dāng)添加濃度為10 μg/kg時(shí)，GC-MS/SIM法未檢出農(nóng)藥為54種；當(dāng)添加濃度為25 μg/kg時(shí)，未檢出農(nóng)藥為17種；當(dāng)添加濃度為100 μg/kg和500 μg/kg，GC-MS/SIM法仍有個(gè)別農(nóng)藥未檢出，如敵菌丹、克菌丹和雙硫磷。而采用GC-MS/MS法可檢出所有化合物，只有氟啶酮有嚴(yán)重干擾。實(shí)驗(yàn)說明，GC-MS/MS法不但克服了GC-MS/SIM法靈敏度不足的缺點(diǎn)，還解決了氣相色譜選擇性檢測(cè)器不能同時(shí)檢測(cè)各種類型農(nóng)藥的問題，在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中發(fā)揮著重要作用。

除了三重四極質(zhì)譜之外，離子阱質(zhì)譜儀由于結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜，在農(nóng)藥多殘留檢測(cè)中受到關(guān)注。離子阱質(zhì)譜的母離子選擇、誘導(dǎo)解離、子離子檢測(cè)均在一個(gè)質(zhì)量分析器——離子阱中按時(shí)間程序依次進(jìn)行，被稱為時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜。美國(guó)紐約州農(nóng)業(yè)署的食品實(shí)驗(yàn)室使用質(zhì)譜儀的串聯(lián)功能，對(duì)蔬菜、水果、牛奶中100種農(nóng)殘的分析結(jié)果表明，上述農(nóng)殘的檢出限可達(dá)μg/kg(L)水平[42]。離子阱的另一個(gè)特點(diǎn)是EI/CI電離方式的切換。由于氣質(zhì)聯(lián)用儀所用的電子轟擊電離方式產(chǎn)生的碎片離子多，質(zhì)量數(shù)大、豐度強(qiáng)的離子相對(duì)較少，有些農(nóng)藥選擇母離子困難，而化學(xué)電離(CI)并不適用于大多數(shù)農(nóng)藥。在阱內(nèi)電離的離子阱質(zhì)譜儀，可以在一次色譜分析中快速切換EI及CI電離方式。對(duì)于在EI電離方式下易斷裂，缺少質(zhì)量數(shù)較大的離子作為母離子的農(nóng)藥，當(dāng)其從色譜柱流出時(shí)，向阱中通入化學(xué)反應(yīng)氣，將待測(cè)物用CI方式電離，其余待測(cè)物出峰時(shí)用EI電離方式。在分析橄欖油中除草劑、殺蟲劑[43-44]，蔬菜中多種有機(jī)磷、有機(jī)氮和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留時(shí)[45-46]，需隨不同組分的色譜出峰時(shí)間切換電離方式，對(duì)分子結(jié)構(gòu)相對(duì)脆弱的農(nóng)藥使用CI電離方式。Frenich等[45]采用兩種氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(與氣相色譜聯(lián)用的空間串聯(lián)質(zhì)譜(GC-QqQ)和時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀(GC-IT)離子阱)分析19種農(nóng)藥，包括有機(jī)氯、有機(jī)磷、擬除蟲菊酯類。在10～150 μg/L濃度范圍內(nèi)，兩者標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2相當(dāng)；但在低濃度范圍內(nèi)(1～50 μg/L)，三重四極質(zhì)譜的R2更好，63.2%化合物的R2≥0.99，26.3%化合物的R2為0.99～0.98，而離子阱質(zhì)譜，只有36.8%化合物的R2≥0.99。這種時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀的另一個(gè)弱點(diǎn)是一個(gè)質(zhì)譜掃描過程所需時(shí)間比空間串聯(lián)質(zhì)譜長(zhǎng)，這就影響了一個(gè)色譜分析過程中所能容納的待測(cè)組分?jǐn)?shù)目，所以日常用于檢測(cè)的儀器和標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法多是三重四極質(zhì)譜儀[47]。

目前，基于GC-MS/MS和LC-MS/MS的農(nóng)藥多殘留檢測(cè)技術(shù)日益完善，檢測(cè)對(duì)象幾乎涵蓋了所有農(nóng)藥和各種樣品基質(zhì)，除了環(huán)境樣品[48]，食品和動(dòng)、植物來源的農(nóng)產(chǎn)品[46,49-54]，還包括基質(zhì)復(fù)雜的中草藥[55]，農(nóng)藥在人體中暴露量檢測(cè)中的血清樣品[56]、母乳樣品[57]等。串聯(lián)質(zhì)譜的選擇性減小了樣品基質(zhì)對(duì)待測(cè)物的干擾，簡(jiǎn)化了樣品前處理過程。近年來，質(zhì)譜儀仍在不斷改進(jìn)，離子化效率及傳輸效率的提高，離子聚焦和中性干擾離子的排除，二級(jí)質(zhì)譜碰撞室的改進(jìn)等，提高了儀器的穩(wěn)定性和靈敏度[58]，為多類多殘留農(nóng)藥檢測(cè)提供了豐富的技術(shù)手段。

在實(shí)際樣品的多類多殘留農(nóng)藥檢測(cè)中，樣品的提取、凈化方法必須適合理化性質(zhì)各異的多種檢測(cè)對(duì)象，這導(dǎo)致無法避免樣品中基質(zhì)共萃物的影響?；|(zhì)共萃物的影響之一是對(duì)分析結(jié)果的干擾，表現(xiàn)為等量的待測(cè)物在溶劑中(標(biāo)準(zhǔn)溶液)和在溶劑相同、含基質(zhì)共萃物的樣品提取液中響應(yīng)值有差別。對(duì)于GC-MS，基質(zhì)共萃物主要影響分析物從GC進(jìn)樣口到色譜柱的傳送過程[59]，而對(duì)于LC-MS，基質(zhì)共萃物會(huì)抑制電噴霧離子化過程[60-61]，后者往往會(huì)嚴(yán)重影響靈敏度。在實(shí)際檢測(cè)中，一般采用基質(zhì)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，用以抵消或減少其對(duì)分析結(jié)果的影響。但是被測(cè)樣本種類繁多，其基質(zhì)共萃物的種類、含量均不相同，很難選用一種樣品的基質(zhì)提取液代表其他樣品，而對(duì)每種樣品均配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液是很繁瑣的。對(duì)于GC-MS，可將極性保護(hù)劑加入到待測(cè)溶液中，使其作用于氣相色譜進(jìn)樣口以減少基質(zhì)效應(yīng)[62-63]，但是該方法無法用于LC-MS/MS。在樣品濃度足夠高，或者儀器檢出限足夠靈敏時(shí)，最簡(jiǎn)單的方法是稀釋萃取物，有些實(shí)驗(yàn)甚至需要稀釋約100倍[64]。一些研究者嘗試使用多柱多閥設(shè)備，在分析柱前加凈化柱和富集柱排除干擾，但該方法在實(shí)際工作中的應(yīng)用還不普遍[65]。

5 農(nóng)藥多殘留的高通量檢測(cè)

為了在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，快速樣品制備技術(shù)逐步發(fā)展和完善。得益于串聯(lián)質(zhì)譜的高選擇性，樣品制備過程得以簡(jiǎn)化：基于固相萃取和基質(zhì)固相分散技術(shù)開發(fā)的“QuEChERS”(quick, easy, cheap, effective, rugged and safe)樣品快速前處理方法的應(yīng)用越來越普遍[49,66]，有些樣品甚至只經(jīng)過簡(jiǎn)單提取即可進(jìn)行檢測(cè)[51]。更重要的是，超高壓液相色譜儀的產(chǎn)生提高了色譜的分離速度，質(zhì)譜的掃描速度提高到20 000 u/s甚至更高，儀器的軟件功能得到不斷提升。在質(zhì)譜儀傳統(tǒng)分段掃描模式中，無論是選擇離子掃描還是串聯(lián)質(zhì)譜掃描，都需要按照目標(biāo)化合物的保留時(shí)間，將色譜分離過程劃分為不重疊的時(shí)間段，在每個(gè)時(shí)間段內(nèi)根據(jù)流出的目標(biāo)化合物設(shè)定相應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)。隨著目標(biāo)化合物數(shù)目的增加，受質(zhì)譜掃描速度及數(shù)據(jù)掃描點(diǎn)數(shù)的限制，必然需要盡可能的細(xì)分時(shí)間段，確保每個(gè)時(shí)間段內(nèi)的組分盡可能少，以使每個(gè)待測(cè)目標(biāo)的色譜峰都能得到足夠的數(shù)據(jù)采集點(diǎn)，每次采集的各個(gè)離子都有足夠的駐留時(shí)間。因此要求色譜保留時(shí)間穩(wěn)定度極高，即使有微小漂移，也會(huì)導(dǎo)致部分化合物的出峰時(shí)間超出預(yù)定的時(shí)間段，造成樣品不能完全采集。在工作中需要定期用混合標(biāo)準(zhǔn)樣品重新定位保留時(shí)間，進(jìn)而重新分段，工作量很大。另一方面，每個(gè)時(shí)間段得到的化合物掃描點(diǎn)數(shù)可能由于掃描時(shí)間的限制而過少，以致色譜峰失真，影響定量分析的準(zhǔn)確性。近年來，由儀器軟件根據(jù)保留時(shí)間控制多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)或選擇離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)進(jìn)程使色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用越來越方便：每個(gè)待測(cè)化合物都是一個(gè)獨(dú)立的時(shí)間段，當(dāng)其出現(xiàn)的時(shí)候才對(duì)該化合物進(jìn)行掃描，而且各個(gè)時(shí)間段可以適當(dāng)調(diào)整，減少重疊部分，使儀器發(fā)揮最大的掃描效率。用戶不需要像分段掃描那樣，設(shè)置每個(gè)離子對(duì)的駐留時(shí)間，而是直接設(shè)置每個(gè)峰的掃描點(diǎn)數(shù)，由軟件自動(dòng)調(diào)節(jié)掃描速度。賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司、島津公司、安捷倫公司[67-69]分別報(bào)道了應(yīng)用這種技術(shù)同時(shí)檢測(cè)800種以上農(nóng)藥和污染物的高通量分析方法。但是目前尚未見到用戶文章。

綜上所述，色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)依據(jù)化合物的理化性質(zhì)(色譜保留值)和分子結(jié)構(gòu)信息(質(zhì)譜離子的質(zhì)量數(shù)和離子豐度)確認(rèn)被測(cè)組分，在待測(cè)物的確證上優(yōu)于色譜。質(zhì)譜既可作為色譜的通用性檢測(cè)器，也可以通過選擇離子掃描和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)精準(zhǔn)地排除干擾，成為待測(cè)物色譜峰流出時(shí)該化合物的選擇性檢測(cè)器。從質(zhì)譜全譜掃描，到選擇離子掃描、二級(jí)離子監(jiān)測(cè)，儀器的選擇性和靈敏度越來越高，但是質(zhì)譜的譜圖并不完整。為了保證在痕量分析時(shí)對(duì)目標(biāo)化合物定性分析的準(zhǔn)確性，我國(guó)采用了歐盟的標(biāo)準(zhǔn)，即除了要注意色譜保留時(shí)間和色譜峰形狀與標(biāo)準(zhǔn)品一致外，還要求待測(cè)樣品的質(zhì)譜離子質(zhì)量數(shù)和相對(duì)豐度與標(biāo)準(zhǔn)品的誤差在一定范圍內(nèi)。由于低質(zhì)量范圍內(nèi)干擾離子多，殘留分析中應(yīng)盡量注意選擇高質(zhì)量數(shù)的離子。為了評(píng)判質(zhì)譜在殘留分析中的檢測(cè)結(jié)果，2002年歐盟引入了“鑒定點(diǎn)數(shù)”方法。由于各種掃描技術(shù)中的離子在目標(biāo)化合物分子結(jié)構(gòu)確證中所發(fā)揮的作用不同，分別設(shè)定了它們的權(quán)重。以低分辨質(zhì)譜的離子為1，高分辨質(zhì)譜的離子為2，其他離子在鑒定中的作用列于表1，各個(gè)離子的權(quán)重稱為鑒定點(diǎn)數(shù)或分?jǐn)?shù)。該指導(dǎo)性文件中明確要求一般藥物在分析中需要3個(gè)鑒定點(diǎn)確認(rèn)其陽性，當(dāng)有害物殘留超標(biāo)時(shí)需要4個(gè)鑒定點(diǎn)確認(rèn)。這一規(guī)定用于建立農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法，如在用低分辨質(zhì)譜選擇離子監(jiān)測(cè)時(shí)需要選擇3～4個(gè)特征離子，在用串聯(lián)質(zhì)譜時(shí)，需要2個(gè)母離子/子離子對(duì)，其中母離子可以相同。我國(guó)在農(nóng)藥殘留的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法中也采用了這一評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

表1 不同質(zhì)譜技術(shù)的離子在目標(biāo)化合物鑒定中的權(quán)重分?jǐn)?shù)Table 1 Weight fractions of ions with different mass spectrometry techniques in identification of target compounds

色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)及儀器的發(fā)展使高通量的農(nóng)藥多類多殘留檢測(cè)得以實(shí)現(xiàn)，農(nóng)藥殘留檢測(cè)所需的技術(shù)需求為前者的發(fā)展提出更高的要求。在目標(biāo)農(nóng)藥的多殘留監(jiān)測(cè)中，即使應(yīng)用MRM技術(shù)，也曾出現(xiàn)過假陽性的情況，需要選擇性更強(qiáng)的檢測(cè)技術(shù)，例如用高分辨質(zhì)譜進(jìn)一步確定陽性樣品。殘留分析工作中不斷出現(xiàn)的實(shí)際問題是儀器功能和檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的動(dòng)力。