韓 璐， 田 文， 高 原， 廉美蘭， 樸炫春

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

紫錐菊(Echinaceapurpurea(Linn.) Moench)又名紫錐花、紫松果菊，菊科紫錐菊屬，多年生草本植物，原產(chǎn)于北美地區(qū)，是一種藥用及觀賞植物[1-3]。紫錐菊可全株入藥，含有多種有效成分，如烴基酰胺、咖啡酸衍生物及多糖等[4-5]。紫錐菊具有許多藥理活性，如免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤等藥理活性，目前主要應(yīng)用于防治感冒、支氣管炎等上呼吸道系統(tǒng)疾病，皮膚病及過(guò)敏性疾病[6-8]。因其有如此多的功效，己被廣泛應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑和保健食品。因市場(chǎng)需求量的增加，目前紫錐菊傳統(tǒng)的栽培方式無(wú)法滿足對(duì)植物材料的需求。因此，植物細(xì)胞培養(yǎng)就成為一種獲取植物材料的另一途徑。植物細(xì)胞、組織和器官具有降低生產(chǎn)成本、縮短生長(zhǎng)周期等優(yōu)點(diǎn)[9]。其中，不定根培養(yǎng)作為器官培養(yǎng)的一種，能夠短時(shí)間內(nèi)快速地獲得植物有效活性成分，與細(xì)胞培養(yǎng)相比較具有更穩(wěn)定遺傳性，是大規(guī)模生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的最佳培養(yǎng)方法。因此，不定根培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于紫錐菊的植物材料生產(chǎn)具有重要的意義。

炎癥是機(jī)體對(duì)傷害性刺激、組織損傷以及感染等的應(yīng)激反饋，是一種防御性和保護(hù)性反應(yīng)。一氧化氮(NO)是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子，由誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)誘導(dǎo)合成[10-11]。前列腺素E2(PGE2)是體內(nèi)的一種花生四烯酸代謝產(chǎn)物，它與機(jī)體的發(fā)熱、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞生長(zhǎng)及分化等生理活動(dòng)密切相關(guān)，PGE2主要由環(huán)氧化酶-2(COX-2)誘導(dǎo)合成[12-13]。體內(nèi)眾多的炎癥因子中，白介素-6(IL-6)是啟動(dòng)全身炎癥反應(yīng)最強(qiáng)的內(nèi)源性炎癥因子，是機(jī)體炎癥與疾病嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是由活化的巨噬/單核細(xì)胞產(chǎn)生，是臨床中重要的炎癥因子，可參與人體自身免疫病的病理?yè)p[14]。白介素-1β(IL-1β)是一種調(diào)節(jié)自然免疫的細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)調(diào)控其他炎性反應(yīng)介質(zhì)在多種細(xì)胞中的分泌與釋放[15]。目前關(guān)于紫錐菊抗炎方面的研究已有一些報(bào)道，如莫秋芬等[16]得出，紫錐菊植物提取物可抑制TNF-α、IL-1β等促炎因子的釋放；程學(xué)勇等[6]研究表明紫錐菊花具有良好的抗炎活性。然而，目前對(duì)紫錐菊不定根抗炎特性的研究尚處于一種空白狀態(tài)，限制著不定根的應(yīng)用。因此，探明不定根的抗炎活性，對(duì)今后不定根作為相關(guān)產(chǎn)品的應(yīng)用提供理論依據(jù)，同時(shí)還可解決紫錐菊原材料短缺的問(wèn)題。

因此，本試驗(yàn)利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)的紫錐菊不定根提取物處理LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(PMs)后，通過(guò)測(cè)定PMs中的NO、TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎介質(zhì)的釋放量及iNOS和COX-2的表達(dá)量，探明紫錐菊不定根的抗炎活性。

1 材料與方法

1.1 材料

紫錐菊不定根組培材料由大連市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。將不定根接種于含有4 L培養(yǎng)液(3/4MS+IBA 1 mg/L+50 g/L，pH值5.8)的5 L反應(yīng)器中，通氣量為100 mL/min，溫度為25 ℃條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)。將培養(yǎng)40 d的不定根作為本試驗(yàn)的試驗(yàn)材料。

1.2 藥品

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)(Gibco公司，美國(guó))，青霉素、鏈霉素和3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(Sigma公司，美國(guó))，IL-1β抗體、TNF-α抗體及IL-6抗體(Cell Signaling Technology公司，美國(guó))，LPS(Invivogen公司，美國(guó))，二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司，美國(guó))。

1.3 儀器

酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(UV-2600，日本島津公司，日本)，蛋白質(zhì)電泳及轉(zhuǎn)印設(shè)備(Bio-Rad公司，美國(guó))，凝膠成像儀(LAS-3000，F(xiàn)ujifilm公司，日本)。

1.4 動(dòng)物

6～8周齡的C578BL/6雌性小鼠，體重為(18±1) g，購(gòu)買自長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，試驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 方法

1.5.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的獲取

C57BL/6雌鼠腹腔注射3 mL的4 %巰基醋酸鹽培養(yǎng)液，4 d后犧牲小鼠，向小鼠腹腔注射10 mL預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)灌洗腹腔后，收集細(xì)胞懸液，于1 500 r/min下離心3 min，除上清，即得PMs。將細(xì)胞培養(yǎng)在含10 %FBS和抗生素(青霉素和鏈霉素，100 U/mL)的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃和25% CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h后用于試驗(yàn)。

1.5.2 不定根提取物對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活性的影響

采用MTT法研究不定根提取物對(duì)PMs活性的影響，不定根提取物用DMSO溶解用于試驗(yàn)。用DMEM培養(yǎng)基將不定根提取物分別配置成12.5、25、50、100、200、400 μg/mL后，處理孵育在96孔板中的PMs，每孔8×104個(gè)細(xì)胞。孵育24 h后棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL MTT(500 ng/mL)后繼續(xù)孵育，2 h后，棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，充分搖勻后，利用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定吸光值(OD)，波長(zhǎng)為550 nm，根據(jù)計(jì)算出的細(xì)胞活性，篩選出最適的提取物濃度。

1.5.3 不定根提取物對(duì)促炎介質(zhì)的影響

為了研究不定根提取物對(duì)NO的影響，將PMs接種于48孔板中，每孔2.5×105個(gè)細(xì)胞，孵育12 h后，棄培養(yǎng)液，溫PBS洗滌2次，每次3 min。分別加入25、50、100、200、400 μg/mL不定根提取物處理PMs，1 h后處理組和LPS組分別加入0.1 μg/mL LPS，24 h后收集細(xì)胞上清液。利用Griess試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作，于550 nm處測(cè)定OD值。

PGE2測(cè)定中對(duì)細(xì)胞的處理與NO的相同，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定PGE2，在450 nm處測(cè)定OD值，并計(jì)算出其釋放量。

為了研究不定根提取物對(duì)TNF-α、IL-6的影響，在48孔中每孔加入2.5×105細(xì)胞，孵育12 h，棄上清液，用溫PBS緩沖液洗滌2次，加入提取物處理1 h，處理組和LPS組加入0.1 μg/mL LPS處理，6 h后收集細(xì)胞上清液。參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定，450 nm處測(cè)定OD值，計(jì)算TNF-α和IL-6的釋放量。

為了研究不定根提取物對(duì)1L-1β的影響，將PMs接種到48孔板中，每孔2.5×105細(xì)胞，孵育12 h后，棄培養(yǎng)液，使用溫PBS緩沖液洗滌2次，加入0.1 μg/mL LPS處理3 h后，用提取物處理1 h，用5 mM的ATP處理1 h后收集細(xì)胞上清液。參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定，450 nm處測(cè)定OD值，計(jì)算1L-1β的釋放量。

1.5.4 不定根提取物對(duì)iNOS、COX-2的影響

采用免疫印跡試驗(yàn)法，測(cè)定不定根提取物對(duì)iNOS、COX-2表達(dá)的影響。將小鼠巨噬細(xì)胞接種于6孔板中(每孔2.6×105細(xì)胞)，孵育12 h后，棄培養(yǎng)液，用溫PBS緩沖液洗滌3次，處理組和LPS組加入0.1 μg/mL LPS處理24 h。棄上清液，用冰PBS緩沖液洗滌3次后，每孔加入100 μL裂解液，刮取細(xì)胞后，冰浴30 min。4 ℃離心(12 000 r/min)15 min后，收集上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白含量，進(jìn)行免疫印跡分析。采用SDS-PAGE電泳法分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜。室溫下，用10 %的脫脂奶封閉1 h。4 ℃條件下分別孵育一抗(iNOS、COX-2、β-actin，1∶1 000)過(guò)夜，室溫條件下，在二抗(1∶5 000)中孵育1 h。加入ECL試劑盒中，分別利用凝膠成像儀曝光成像，并利用Image J軟件對(duì)其進(jìn)行分析。

1.5.5 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)處理均采用3次重復(fù)。使用GraphPad Prism 5軟件程序，采用t測(cè)驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較；采用SPSS 21軟件程序，采用鄧肯式新復(fù)極差法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不定根提取物對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活性的影響

為了篩選出最適宜的不定根提取物濃度進(jìn)行抗炎試驗(yàn)研究，通過(guò)測(cè)定不定根提取物對(duì)細(xì)胞活性的影響，對(duì)提取物的細(xì)胞毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

由圖1可知，分別用0～400 μg/mL不定根提取物處理PMs時(shí)，其活性無(wú)明顯變化，這說(shuō)明不定根提取物在此濃度范圍內(nèi)，對(duì)PMs無(wú)毒性。因此，選取25、50和100 μg/mL 3個(gè)濃度進(jìn)行后續(xù)抗炎研究。

圖1 不定根提取物對(duì)細(xì)胞活性的影響

2.2 不定根提取物對(duì)NO和PGE2釋放量的影響

NO作為一種參與許多生理調(diào)節(jié)功能的信號(hào)分子，也是一種檢測(cè)炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)。為探明不定根提取物對(duì)LPS刺激的PMs中NO釋放量的影響，本試驗(yàn)分別采用25、50和100 μg/mL 3種濃度的不定根提取物對(duì)PMs進(jìn)行處理。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)LPS刺激后的PMs中NO的釋放量明顯高于未處理組。當(dāng)不定根提取物濃度為25 μg/mL時(shí)，與LPS組的NO釋放量無(wú)顯著性變化。當(dāng)不定根提取物濃度為50 μg/mL時(shí)，NO的釋放量為7.44 μM，顯著低于LPS組(圖2A)。

PGE2是花生四烯酸的環(huán)氧酶的代謝產(chǎn)物，是一種重要的細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，也是一種重要的促炎因子，可以反饋性誘導(dǎo)合成COX-2，從而使炎癥的強(qiáng)度和時(shí)間進(jìn)一步增加。由圖2B可以看出，經(jīng)過(guò)LPS刺激的PMs中PGE2的釋放量明顯高于空白組，當(dāng)不定根提取物濃度為25 μg/mL時(shí)，與LPS組相比較PGE2釋放量明顯有所降低。隨著提取物濃度的升高，PGE2釋放量呈下降趨勢(shì)，當(dāng)濃度為50 μg/mL時(shí)，PGE2釋放量明顯低于LPS組，為193.60 pg/mL。

注：###為與空白組比較，為0.001水平的差異顯著性；*，**，***為與LPS組比較，分別為0.05,0.01和0.001水平的差異顯著性，下同。

圖2不定根提取物對(duì)細(xì)胞NO和PGE2釋放量的影響

Fig.2EffectofadventitiousrootextractsonNOandPGE2productionincells

2.3 不定根提取物對(duì)IL-1β、IL-6和TNF-α釋放量的影響

IL-1β作為促炎細(xì)胞因子，主要表現(xiàn)在組織受到損傷后其迅速增加，還可以對(duì)其他促炎細(xì)胞因子的釋放進(jìn)行誘導(dǎo)，從而進(jìn)一步引發(fā)炎癥反應(yīng)。為了探明不定根提取物對(duì)LPS刺激的小PMs中IL-1β釋放量的影響，采用25、50和100 μg/mL 3種濃度的不定根提取物對(duì)PMs進(jìn)行處理，結(jié)果表明，不定根提取物對(duì)IL-1β釋放量具有顯著的抑制效果。(圖3A)。

IL-6作為促炎介質(zhì)不僅參與炎癥反應(yīng)和感染反應(yīng)，還參與調(diào)解代謝過(guò)程，能夠調(diào)控組織炎癥的浸潤(rùn)，是誘發(fā)炎癥過(guò)程的主要因素。由圖3B可以看出，經(jīng)過(guò)LPS刺激的PMs中IL-6釋放量顯著增加，但不定根提取物對(duì)IL-6釋放量并沒(méi)有抑制作用。

TNF-α是炎癥反應(yīng)中最早研究的促炎介質(zhì)，在炎癥反應(yīng)中起著主導(dǎo)作用，能夠激活細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步誘發(fā)相關(guān)炎癥因子的釋放。為了探明不定根提取物對(duì)LPS刺激的PMs中TNF-α釋放量的影響，分別用25、50和100 μg/mL 3種濃度的不定根提取物對(duì)PMs進(jìn)行處理，結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)LPS刺激后的PMs中TNF-α的釋放量明顯高于未處理組，但采用不定根提取物處理后的PMs中的TNF-α釋放量明顯降低，當(dāng)不定根提取物濃度為50 μg/mL時(shí)，TNF-α的釋放量顯著低于LPS組(圖3C)。

圖3 不定根提取物對(duì)細(xì)胞IL-1β、IL-6和TNF-α釋放量的影響

2.4 不定根提取物對(duì)iNOS和COX-2表達(dá)量的影響

iNOS是合成NO的關(guān)鍵酶，當(dāng)受到外界刺激被激活后，可以誘導(dǎo)合成大量的NO。本試驗(yàn)為了探明不定根提取物對(duì)iNOS表達(dá)量的影響，分別用不同濃度的提取物處理PMs，結(jié)果表明，當(dāng)不定根提取物濃度為25 μg/mL時(shí)，對(duì)iNOS的表達(dá)量有抑制作用，并隨著濃度的增加，表示出劑量依賴性(圖4A)。

COX-2是一種誘導(dǎo)型氧化酶，是PGE2合成的關(guān)鍵酶，當(dāng)生物體受到外界刺激時(shí)，此種酶的表達(dá)量會(huì)上升，以促進(jìn)炎癥反應(yīng)的進(jìn)一步發(fā)生。由圖4B可以看出，經(jīng)LPS處理的PMs中COX-2表達(dá)量顯著增加，經(jīng)不定根提取物處理的PMs中COX-2表達(dá)量明顯低于LPS組，這表明不定根提取物具有較好的抑制效果，且當(dāng)濃度為50 μg/mL時(shí)，顯著抑制了COX-2的表達(dá)量。

圖4不定根提取物對(duì)細(xì)胞iNOS和COX-2表達(dá)量的影響

3 討論與結(jié)論

紫錐菊作為一種具有多種藥理活性的天然藥用植物，含有多酚、咖啡酸衍生物、多糖、烷基酰胺、揮發(fā)油等有效物質(zhì)，具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤等藥理活性[17-20]。然而對(duì)于紫錐菊抗炎活性的研究報(bào)道主要集中在野生或栽培植株，并沒(méi)有對(duì)生物反應(yīng)器生產(chǎn)的不定根抗炎活性的研究[21]。因此本試驗(yàn)對(duì)紫錐菊不定根提取物的抗炎活性進(jìn)行了研究。

LPS刺激的巨噬細(xì)胞能夠釋放TNF-α，TNF-α通過(guò)活化模式受體，從而活化巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生相關(guān)炎癥因子，如IL-6、IL-1β、NO和PGE2[22]。IL-6能夠刺激活化B細(xì)胞增殖，分泌抗體，刺激T細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)活化，刺激肝細(xì)胞合成急性期蛋白，參與炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血細(xì)胞發(fā)育，是炎癥發(fā)生過(guò)程中重要的細(xì)胞因子[23]。IL-1β是白介素-1(IL-1)的一種存在形式，其能夠在炎癥反應(yīng)中吸引中性粒細(xì)胞，引起炎癥介質(zhì)釋放[24]。賈青輝[8]研究發(fā)現(xiàn)，紫錐菊提取可以有效的抑制TNF-α、IL-1β、PGE2等促炎因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制炎癥因子的分泌，這與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。NO作為許多生理調(diào)節(jié)功能的信號(hào)分子，也是一種檢測(cè)炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)，其合成是在iNOS的參與下完成的，iNOS主要在高活性的巨噬細(xì)胞與白細(xì)胞中表達(dá)[25]。PGE2是一類高活性的炎癥細(xì)胞因子，在正常細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，但是受到外界刺激后，會(huì)激活3個(gè)連續(xù)的酶促反應(yīng)，在COX-2催化下由花生四烯酸生成[26]。Zhai Z等[27]研究表明，紫錐菊乙醇提取通過(guò)抑制RAW 264.7細(xì)胞中NO和iNOS的表達(dá)，而達(dá)到了抗炎的效果。本試驗(yàn)的結(jié)果與其相同，這表明紫錐菊不定根同樣具有抗炎作用。

本文利用LPS刺激小鼠巨噬細(xì)胞構(gòu)造炎癥模型，測(cè)定紫錐菊不定根提取物對(duì)相關(guān)炎癥因子(TNF-ɑ、IL-6、IL-1β)與促炎介質(zhì)(NO、PGE2、iNOS、COX-2)表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，不定根提取物濃度能夠有效的降低炎癥因子(TNF-ɑ、IL-1β)與促炎介質(zhì)的(NO、PGE2、iNOS、COX-2)的表達(dá)，這說(shuō)明紫錐菊不定根具有一定的抗炎活性，因此，紫錐菊不定根可以作為紫錐菊抗炎相關(guān)產(chǎn)品的原材料。