鄭涵予， 李 越， 金香花， 趙 陽(yáng)， 羅廣軍*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000；2.敦化市大石頭林業(yè)有限公司，吉林 敦化 133702；3.延邊州森林調(diào)查規(guī)劃院，吉林 延吉 133000)

軟棗獼猴桃[Actinidiaarguta(Seib.et Zucc.)Plangch.ex Miq.]是獼猴桃科獼猴桃屬中水平和垂直分布最廣泛的多年生落葉藤本果樹(shù)[1]。分布于中國(guó)南北各地，朝鮮、日本、俄羅斯亦有分布。以中國(guó)東3省的資源最為豐富，其中，小興安嶺和長(zhǎng)白山地區(qū)較多見(jiàn)，是珍貴的抗寒果樹(shù)資源。其果實(shí)富含維生素C、酚類物質(zhì)、類胡蘿卜素和多種礦質(zhì)元素，并具有一定的藥用價(jià)值[2]。軟棗獼猴桃果汁、果酒、果醬等具有濃郁的軟棗獼猴桃特有的風(fēng)味，深受人們喜愛(ài)。目前，軟棗獼猴桃作為第3代獼猴桃受到世界各國(guó)的廣泛關(guān)注，其產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)正在蓬勃發(fā)展。然而，由于軟棗獼猴桃是雌雄異株植物，雌株經(jīng)濟(jì)價(jià)值明顯要高于雄株，另外，軟棗獼猴桃實(shí)生苗成熟需要5～7年，童期漫長(zhǎng)，且實(shí)生繁殖后代出現(xiàn)4∶1(雄∶雌)的性別分離[3]，不利于生產(chǎn)需要。幼苗期雌雄無(wú)法辨別，給軟棗獼猴桃種質(zhì)資源的改良和育種帶來(lái)巨大的困難。因此，軟棗獼猴桃性別鑒定的研究在生產(chǎn)和遺傳育種等方面都有重要的意義。

形態(tài)鑒定是植物區(qū)分雌雄的一種方法，可作為判定植物性別的一個(gè)重要性指標(biāo)，具有直觀、快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。關(guān)于雌雄異株植物性別鑒定的報(bào)道較多，早在50年代初波蘭學(xué)者Bugala[4]就通過(guò)葉色確定歐洲山楊的性別。后來(lái)研究表明，銀杏雌雄株幼苗期在植株、枝、葉、根等方面存在較大差異[5]；沙棘雌雄株在冬態(tài)、花期、生長(zhǎng)期、植株形態(tài)、植株分布等方面存在較大差異[6]；徐東生等[7]應(yīng)用多元統(tǒng)計(jì)分析中的判別分析方法判別獼猴桃(Actinidiachinensis)雌雄株，用能開(kāi)花結(jié)果的成年樹(shù)建立了判別方程，馬麗媛等[8]對(duì)黃連木(pistaciachinensisBunge)雌雄葉子形態(tài)特征進(jìn)行研究，顯示雌雄株葉片葉柄長(zhǎng)度及葉形指數(shù)具有顯著性差異；譚冬梅等[9]發(fā)現(xiàn)阿月渾子(PistaciaveraL.)雌株與雄株在葉形指數(shù)方面具有極顯著差異，吳委林[10]發(fā)現(xiàn)高山紅景天(RhodiolaSaehalinensisA.Bor.)的葉長(zhǎng)和葉寬具有極顯著差異。勒振寧等[11]對(duì)杜仲(EucommiaulmoidesOliver)的外部形態(tài)、生長(zhǎng)速度以及物候期等特征進(jìn)行了研究，證明雌雄株間也存在較大差異。

次生代謝產(chǎn)物(Secondary metabolite)是由次生代謝(Secondary metabolism)產(chǎn)生的一類并非植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的小分子有機(jī)化合物。次生代謝過(guò)程被認(rèn)為是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化中對(duì)生態(tài)環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果，它在處理植物與生態(tài)環(huán)境的關(guān)系中充當(dāng)重要角色。雌雄異株植物次生代謝產(chǎn)物的差異研究亦有不少報(bào)道。王雙明[12]發(fā)現(xiàn)銀杏雄株的光和色素的總量高于雌株；李珊等[13]和郭曉亮[14]發(fā)現(xiàn)栝樓雄株幼苗葉片中葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、光和色素總量等均高于雌株，且達(dá)到顯著差異水平。然而，軟棗獼猴桃雌雄株間植物形態(tài)和次生代謝產(chǎn)物含量差異研究報(bào)道較少，也可能是因?yàn)槿〔臅r(shí)期不夠全面尚未發(fā)現(xiàn)差異。植物在不同時(shí)期其代謝的途徑和方式有所不同，僅從某一時(shí)期的形態(tài)和生理指標(biāo)尚不能全面闡述雌雄株間差異，存在取材時(shí)期的偶然性。

為此，本課題組從2016年5—7月對(duì)軟棗獼猴桃生長(zhǎng)過(guò)程中的植株形態(tài)與主要次生代謝產(chǎn)物含量進(jìn)行調(diào)查研究，從變化趨勢(shì)和物質(zhì)含量2個(gè)角度探索軟棗獼猴桃雌雄株間的差異，進(jìn)而為軟棗獼猴桃性別鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以軟棗獼猴桃雌雄株葉片和新稍為試驗(yàn)材料，選擇樹(shù)勢(shì)中庸、無(wú)病蟲害、5年生的野生軟棗獼猴桃雌雄株各3株，于2016年5月4日—7月18日每隔15 d采收雌雄株葉片及新稍，放置低溫采樣箱后迅速帶至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行植株生長(zhǎng)狀況調(diào)查，然后把部分葉片樣品洗凈、液氮處理后，置-70 ℃超低溫冰箱中保存，供色素、酚類物質(zhì)、類黃酮等物質(zhì)含量測(cè)定。

1.2 方法

軟棗獼猴桃雌雄株物侯期參照張玉星等[15]人的描述進(jìn)行觀察記錄；葉片縱徑和橫徑以及葉柄長(zhǎng)度利用游標(biāo)卡尺測(cè)定；葉綠素a、b 及類胡蘿卜素的含量測(cè)定采用Arnon[16]的方法；花青素相對(duì)含量的測(cè)定參照張志良等[17]人的方法，花青素的相對(duì)含量(色素單位)=(測(cè)得的OD值/0.01)/樣品鮮樣質(zhì)量/g；總酚和類黃酮物質(zhì)相對(duì)含量參照曹建康等[18]人的方法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 軟棗獼猴桃雌雄株主要物侯期觀察

課題組于2014—2016年對(duì)軟棗獼猴桃雌雄株主要物侯期進(jìn)行觀察，結(jié)果如表1所示。軟棗獼猴桃在延邊地區(qū)的生育天數(shù)約為165 d，蕾期比較長(zhǎng)，花期6月1日左右，開(kāi)花持續(xù)10 d左右。雌雄株主要物侯期出現(xiàn)的時(shí)間整體上差異不大，基本一致。雄株萌芽稍早而展葉比較晚，這可能是雄株萌芽需要溫度相對(duì)雌株較低，而展葉所需溫度相對(duì)雌株較高。雌株始花期稍晚終花期亦稍晚，雌雄株花器官的差異決定了其具有不同的代謝途徑。

表1 軟棗獼猴桃雌雄株主要物侯期觀察(延邊地區(qū))Table 1 Themain phenological period of male and female Actinidia arguta in Yanbian area

2.2 軟棗獼猴桃雌雄株生長(zhǎng)過(guò)程中植株形態(tài)變化

2.2.1 葉片形態(tài)變化

軟棗獼猴桃植株在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期內(nèi)葉片不斷變大，葉柄不斷伸長(zhǎng)。從葉形指數(shù)上看，軟棗獼猴桃雌雄株葉形指數(shù)均大于1，葉片表現(xiàn)為長(zhǎng)橢圓形。花期之前(6月3日)，雌雄株葉形指數(shù)均出現(xiàn)明顯下降，葉片呈現(xiàn)出橫向生長(zhǎng)的趨勢(shì)，而從花期開(kāi)始，二者出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，即雄株顯著變寬而雌株變長(zhǎng)(圖1)。雌株花期葉片橫徑開(kāi)始顯著增長(zhǎng)，這很有可能是開(kāi)花需要積累更多的有機(jī)物，葉片光合作用是產(chǎn)生有機(jī)物的直接場(chǎng)所，寬大的葉片可以制造更多的有機(jī)物。雌雄株在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中葉柄長(zhǎng)度變化趨勢(shì)基本一致，但雌株的葉柄長(zhǎng)度顯著大于雄株(P<0.05)。

圖1 軟棗獼猴桃雌雄株生長(zhǎng)過(guò)程中葉形指數(shù)及葉柄長(zhǎng)度變化

2.2.2 新稍長(zhǎng)度變化

軟棗獼猴桃雌雄株生長(zhǎng)過(guò)程中新梢長(zhǎng)度變化，如圖2所示。軟棗獼猴桃新梢增長(zhǎng)快，當(dāng)年生新梢年平均增長(zhǎng)1 m以上。整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中雌雄株新

梢長(zhǎng)度變化趨勢(shì)一致，以坐果期(6月18日)為分界點(diǎn)，表現(xiàn)為前期快速增長(zhǎng)，后期速度變緩。坐果期之后雄株新梢增長(zhǎng)速度較雌株快，這很可能是雄株不結(jié)果所導(dǎo)致的差異。

圖2 軟棗獼猴桃雌雄株生長(zhǎng)過(guò)程中新稍長(zhǎng)度變化

2.3 軟棗獼猴桃雌雄株生長(zhǎng)過(guò)程中主要色素含量變化

2.3.1 葉綠素a含量變化

軟棗獼猴桃雌雄株生長(zhǎng)過(guò)程中葉綠素a含量變化如圖3所示。在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中，雌雄株葉綠素a變化趨勢(shì)和含量均存在差異。開(kāi)花期之前雌雄株葉綠素a含量均緩慢上升，但雄株含量顯著高于雌株。而花期之后，雄株表現(xiàn)為持續(xù)下降至最低值(1.22 mg/g)而后迅速升高至最高值(1.87 mg/g)，雌株則一直緩慢上升至最大值(2.01 mg/g)，此過(guò)程雌株葉綠素a顯著高于雄株。這很可能是雌株坐果期到果實(shí)迅速膨大期需要積累更多的能量所致，而葉綠素a在此過(guò)程中主要參與光合作用。

圖3 軟棗獼猴桃雌雄株生長(zhǎng)過(guò)程中葉綠素a含量變化

2.3.2 葉綠素b含量變化

軟棗獼猴桃雌雄株生長(zhǎng)過(guò)程中葉綠素b含量變化如圖4所示。從含量上看，雄株的葉綠素b含量在蕾期到坐果期顯著高于雌株，除此之外其他時(shí)期則相反。變化趨勢(shì)上，雄株持續(xù)增長(zhǎng)而后降低，而雌株出現(xiàn)降低-升高-降低的變化趨勢(shì)。

圖4 軟棗獼猴桃雌雄株生長(zhǎng)過(guò)程中葉綠素b含量變化

2.3.3 類胡蘿卜素含量變化

軟棗獼猴桃雌雄株生長(zhǎng)過(guò)程中類胡蘿卜素含量變化如圖5所示。含量變化上，在坐果期出現(xiàn)雄株峰值和雌株谷值，此時(shí)雌株類胡蘿卜素含量顯著高于雄株，而其它時(shí)期則是雄株高于雌株。變化趨勢(shì)上，雄株先降低后升高，而雌株則呈先升高后下降的趨勢(shì)。趨勢(shì)的差異主要出現(xiàn)在坐果期，此時(shí)期雌株依靠光合作用需要積累大量能量。類胡蘿卜素含量在此時(shí)期出現(xiàn)的反差，可以說(shuō)明在形成果實(shí)的過(guò)程中，類胡蘿卜素可能起到重要作用。

圖5 軟棗獼猴桃雌雄株生長(zhǎng)過(guò)程中類胡蘿卜素含量變化

2.3.4 花青素含量變化

軟棗獼猴桃雌雄株生長(zhǎng)過(guò)程中花青素含量變化如圖6所示。

圖6 軟棗獼猴桃雌雄株生長(zhǎng)過(guò)程中花青素含量變化

從含量上看，在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中雄株的花青素相對(duì)含量均高于雌株(P<0.05)，坐果期之前表現(xiàn)顯著差異，且開(kāi)花期差異最大，此時(shí)雄株的花青素相對(duì)含量是雌株的2倍左右。從變化趨勢(shì)上雌雄株間未見(jiàn)明顯差異，均是先增高而后降低的變化趨勢(shì)，只是雄株在花期出現(xiàn)了一個(gè)明顯峰值。

2.4 軟棗獼猴桃雌雄株生長(zhǎng)過(guò)程中總酚及類黃酮相對(duì)含量變化

軟棗獼猴桃雌雄株生長(zhǎng)過(guò)程中總酚物質(zhì)和類黃酮相對(duì)含量變化如圖7所示。總酚物質(zhì)和類黃酮相對(duì)含量變化趨勢(shì)基本一致，整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中均表現(xiàn)出雄株含量大于雌株的現(xiàn)象，尤其在花期(6月3日)出現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)。雄株整體上呈先增加降低再增加的趨勢(shì)，而雌株則是降低增加再降低的趨勢(shì)。

圖7 軟棗獼猴桃雌雄株生長(zhǎng)過(guò)程中總酚和類黃酮相對(duì)含量變化

3 討論與結(jié)論

3.1 軟棗獼猴桃雌雄株主要物侯期觀察

軟棗獼猴桃雌雄株在生長(zhǎng)過(guò)程中物侯期出現(xiàn)的時(shí)間整體上差異不大，基本一致。雄株萌芽稍早而展葉比較晚，雌株始花期稍晚終花期亦稍晚。萌芽、展葉以及開(kāi)花是雌雄株進(jìn)行花芽形態(tài)分化的時(shí)期，因此這3個(gè)時(shí)期很有可能是雌雄株出現(xiàn)差異的最佳時(shí)期。物候期是植物響應(yīng)環(huán)境多年進(jìn)化的結(jié)果，屬于比較穩(wěn)定的性狀之一。軟棗獼猴桃雌雄株響應(yīng)環(huán)境因子時(shí)具有一定的性別響應(yīng)差異[19]，雌雄株物候期差異尚不能作為直接鑒別性別的方法，但對(duì)于童期性別區(qū)分方法可以提供一定參考，處于童期狀態(tài)的雌雄株物候期差異有待進(jìn)一步討論。

3.2 軟棗獼猴桃雌雄株生長(zhǎng)過(guò)程中植株形態(tài)變化

軟棗獼猴桃在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期內(nèi)葉片不斷變大，葉柄不斷伸長(zhǎng)。從葉形指數(shù)上來(lái)看，軟棗獼猴桃雌株葉形指數(shù)均大于1，葉片表現(xiàn)為長(zhǎng)橢圓形?；ㄆ谥埃菩壑耆~形指數(shù)均出現(xiàn)明顯下降，葉片表現(xiàn)出橫向伸張的趨勢(shì)，而從花期開(kāi)始，二者出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，即雄株顯著變寬而雌株變長(zhǎng)；在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中葉柄長(zhǎng)度變化趨勢(shì)基本一致，但葉柄長(zhǎng)度雌株顯著大于雄株。葉柄長(zhǎng)度與植株整個(gè)形態(tài)及受光程度密切相關(guān)，雌株結(jié)果需要積累更多的光能，葉炳長(zhǎng)度的差異很有可能是軟棗獼猴桃進(jìn)化過(guò)程中適應(yīng)環(huán)境的表現(xiàn)。

3.3 軟棗獼猴桃雌雄株生長(zhǎng)過(guò)程中主要色素含量變化

雄株的花青素相對(duì)含量始終高于雌株，而葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素隨著時(shí)期的不同而出現(xiàn)的差異不同，但多數(shù)在展葉期、花期及坐果期具有顯著差異。軟棗獼猴桃雌雄株光合作用存在差異，色素是影響光合作用的關(guān)鍵因子，由此可見(jiàn)，色素含量差別應(yīng)該是造成軟棗獼猴桃光合作用出現(xiàn)差異的主要原因。色素含量的差異是否適合童期還待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.4 軟棗獼猴桃雌雄株生長(zhǎng)過(guò)程中總酚及類黃酮相對(duì)含量變化

軟棗獼猴桃雌雄株生長(zhǎng)過(guò)程中總酚物質(zhì)和類黃酮相對(duì)含量變化趨勢(shì)基本一致，整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中均表現(xiàn)出雄株含量大于雌株的現(xiàn)象。雄株整體上呈現(xiàn)先增加降低再增加的趨勢(shì)，而雌株則是降低增加再降低的趨勢(shì)。軟棗獼猴桃雌雄株次生代謝產(chǎn)物存在差異[20]，生長(zhǎng)過(guò)程中動(dòng)態(tài)變化同樣出現(xiàn)了差異，這表明軟棗獼猴桃次生代謝途徑存在差異，造成出現(xiàn)差異本質(zhì)原因以及是否適用于童期有待進(jìn)一步探究。