曾宇鵬 謝席勝

1閬中市人民醫(yī)院腎內(nèi)科（四川閬中637400）；2南充市中心醫(yī)院腎內(nèi)科（四川南充637000）

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）近年來發(fā)病率逐漸升高，嚴(yán)重威脅人們生命健康。CKD 具有患病率高、合并心血管疾病率高和病死率高的“三高”特點，以及知曉率低、防治率低和合并心血管疾病認(rèn)知率低的“三低”特點［1］。我國CKD 總患病率達(dá)10.8%，CKD 患者預(yù)計近1.2 億，但CKD 知曉率僅為12.5%，CKD 患者最終進(jìn)展為終末期腎病（end-stage renal disease，ESRD），患者需終生透析治療或者腎替代治療。腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是導(dǎo)致CKD 進(jìn)展為ESRD 的主要病理改變。正常情況下，腎小管上皮細(xì)胞通過自身增殖、再生等機(jī)制自我修復(fù)腎小管損傷，并能夠通過凋亡機(jī)制清除自身老化、壞死細(xì)胞，維持腎小管正常生理功能。然而病理條件下，腎小管上皮細(xì)胞過度凋亡損傷腎組織結(jié)構(gòu)和正常功能，是導(dǎo)致RIF 進(jìn)展的重要機(jī)制之一。

尿酸（uric acid，UA）是嘌呤代謝的終末產(chǎn)物，嘌呤代謝紊亂、能量代謝異常及腎臟對尿酸的排泄障礙均可引起血漿尿酸濃度升高或降低。腎臟是尿酸代謝的主要器官，體內(nèi)尿酸70%由腎臟排泄［3］。既往研究發(fā)現(xiàn)高尿酸通過線粒體途徑導(dǎo)致人腎小管上皮細(xì)胞（human renal tubular epithelial cells，HK-2）凋亡，高尿酸血癥是導(dǎo)致CKD 進(jìn)展的重要因素［4］，此外高尿酸通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)HK-2 細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化［5］，本研究重點探討尿酸抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，尿酸激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能是其重要分子機(jī)制，為治療高尿酸腎損害提供了新的線索。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎小管上皮細(xì)胞HK-2 購買自美國ATCC 細(xì)胞庫；DMED 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司，胎牛血清購自美國Hyclone 公司；尿酸和四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自美國Sigma-Aldrich 公司；4-苯基丁酸（4-PBA）購自美國Sigma-Aldrich 公司；Annexin V-FITC∕碘化丙啶雙標(biāo)記細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司；兔抗人Caspase-3∕Cleaved-Caspase-3、Caspase-12∕Cleaved-Caspase-12、BiP∕GRP78 抗體購自美國CST 公司；兔抗人IRE-1 和JNK 單克隆抗體購自美國abcam 公司；β-ACTIN抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人腎小管上皮細(xì)胞HK-2 接種于含10%胎牛血清和雙抗溶液（青霉素100 IU∕mL 和鏈霉素100 IU∕mL）的DMEM 培養(yǎng)基中，細(xì)胞呈貼壁生長，放置在37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，每隔2～3 d 細(xì)胞換液。當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)期時，用0.05%胰酶消化離心并重懸細(xì)胞，傳代于新培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）實驗檢測細(xì)胞增殖將對數(shù)生長期的HK-2 細(xì)胞按照5 000 個∕孔接種于96 孔板，每組設(shè)置5 個復(fù)孔，37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，分別加入0、50、100、150、200、250、300 mg∕L 的尿酸處理腎小管上皮細(xì)胞24 h，以及150 mg∕L 的尿酸處理腎小管上皮細(xì)胞24、48、72 h，處理后每孔加入含MTT 培養(yǎng)基200 μL，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h。吸去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，振蕩器低速振蕩10 min。待結(jié)晶物充分溶解，使用酶標(biāo)儀490 nm 處檢測各孔吸光度（OD值）。

1.4 免疫印跡法（Western blot）檢測蛋白水平 將HK-2 細(xì)胞消化離心后種于6 孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的尿酸分組繼續(xù)培養(yǎng)24 h。PBS清洗細(xì)胞3 遍，使用RIPA 裂解液裂解，提取總蛋白。采用BCA 法測定蛋白濃度，其余蛋白加入6×Loading buffer 加熱變性。取變性后蛋白20 μg ∕孔加入SDS-PAGE 凝膠電泳分離，110 V 電壓轉(zhuǎn)移至NC膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗3次，每次10 min。加特定一抗4 ℃孵育過夜。次日TBST 清洗10 min × 3 次，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗，于搖床上慢速常溫孵育1 h，TBST清洗10 min× 3 次，加入ECL 顯影液，使用化學(xué)發(fā)光熒光成像系統(tǒng)（Bio-Rad）進(jìn)行蛋白顯影。以β-actin 作為內(nèi)參計算各組蛋白的相對表達(dá)量。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 HK-2 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞密度按4.0 × 105∕孔接種于6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁，加入150 和200 mg∕L 的尿酸分別處理HK-2 細(xì)胞24 h。PBS 清洗細(xì)胞后加入胰酶消化離心，再次使用PBS 清洗2 次，每管加入250 μL 結(jié)合緩沖液，細(xì)胞計數(shù)后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1.0 × 106∕mL，吸取100 μL 細(xì)胞懸液加入流式管，加入Annexin V-FITC（150 mg∕L）和碘化丙錠（120 mg∕L）混勻，放置于避光、室溫條件下孵育15 min，加入PBS清洗細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀（FACS）檢測細(xì)胞凋亡。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗結(jié)果使用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，所得的實驗數(shù)據(jù)以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尿酸抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖能力 使用0、50、100、150、200、250、300 mg∕L 的尿酸處理腎小管上皮細(xì)胞24 h（圖1A），以及150 mg∕L 的尿酸處理腎小管上皮細(xì)胞24、48、72 h（圖1B），使用MTT 實驗檢測腎小管上皮細(xì)胞增殖能力的變化，結(jié)果顯示與對照組相比尿酸抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖能力，并呈濃度依賴性和時間依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 尿酸促進(jìn)Cleaved-Caspase-3 和Cleaved-Caspase-12 蛋白表達(dá) 實驗組150 和200 mg∕L 濃度尿酸處理腎小管上皮細(xì)胞24 h，通過Western blot檢 測Caspase-3∕Cleaved-Caspase-3 和Caspase-12∕Cleaved-Caspase-12 蛋白改變，與對照組相比尿酸促進(jìn)HK-2 細(xì)胞（圖2A 和圖2B）Cleaved-Caspase 3和Cleaved-Caspase 12 蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 尿酸促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡 使用150 和200 mg∕L 濃度尿酸處理HK-2 細(xì)胞24 h，Annexin VFITC∕PI 雙染流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡。對照組細(xì)胞凋亡率為（5.12±1.02）%，150和200 mg∕L 尿酸處理組細(xì)胞凋亡率分別為（23.69±3.62）%和（38.87±5.48）%（表1）。與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 尿酸抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖Fig.1 Uric acid inhibits the proliferation of renal tubular epithelial cells

2.4 尿酸通過IRE-1/JNK 信號通路激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡 本研究發(fā)現(xiàn)尿酸抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡發(fā)生，但其分子機(jī)制未知。文獻(xiàn)［6］報道細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與增殖和凋亡存在密切聯(lián)系，本研究繼續(xù)探究尿酸和腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間的關(guān)系。實驗組150 mg∕L和200 mg∕L 濃度尿酸處理腎小管上皮細(xì)胞24 h，Western-blot 檢測發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞BiP∕GRP78、IRE1 和JNK 蛋白表達(dá)上調(diào)（圖3A），說明尿酸激活腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。應(yīng)用4-PBA（5 μmol∕L）阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后合用尿酸處理，與尿酸處理組（200 mg∕L）相比Cleaved-Caspase-12 蛋白水平下調(diào)（圖3B），同時MTT實驗發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率升高（P= 0.004）（圖3C），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。顯示4-PBA 能夠抑制尿酸引起的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，尿酸通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑發(fā)揮功能。

3 討論

尿酸是人體嘌呤代謝的產(chǎn)物，作為人體重要小分子由腎臟排出，流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)長期高尿酸血癥是引起慢性腎臟病的重要因素［7］。隨著人們攝入富含嘌呤類或者蛋白質(zhì)類食物的增加，高尿酸血癥發(fā)病率呈逐年升高［8］。高尿酸形成結(jié)晶沉積在腎小管-腎間質(zhì)中，通過誘發(fā)機(jī)械性損傷或者炎癥反應(yīng)導(dǎo)致腎功能損害［9］。

圖2 尿酸促進(jìn)Cleaved-Caspase-3 和Cleaved-Caspase-12 蛋白表達(dá)Fig.2 Uric acid promotes the protein expression of Cleaved-Caspase-3 and Cleaved-Caspase-12

表1 尿酸對腎小管上皮細(xì)胞凋亡率的影響Tab.1 Effect of uric acid on apoptosis rate of renal tubular epithelial cells ±s

注：與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

分組對照組150（mg∕L）尿酸200（mg∕L）尿酸凋亡率（%）5.12±1.02 23.69±3.62 38.87±5.48 P 值0.001**＜0.001***

圖3 尿酸通過IRE-1∕JNK 信號通路激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡Fig.3 Uric acid activates endoplasmic reticulum stress through IRE-1∕JNK signaling pathway to regulate cell proliferation and apoptosis

腎小管上皮細(xì)胞富含尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，是尿酸代謝過程中的重要組成。腎小管上皮細(xì)胞凋亡增多是導(dǎo)致尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的重要因素［10］，本研究重點探討尿酸對腎小管上皮細(xì)胞增殖、凋亡能力的影響。不同濃度尿酸或者不同時間處理腎小管上皮細(xì)胞，MTT 實驗檢測細(xì)胞增殖能力發(fā)現(xiàn)尿酸抑制其增殖，且呈濃度依賴性和時間依賴性。同時使用Western blot 檢測不同濃度尿酸處理后凋亡蛋白水平改變，尿酸促進(jìn)Cleaved-Caspase-3 和Cleaved-Caspase-12 蛋白表達(dá)。此外，通過流式細(xì)胞儀檢測尿酸處理后腎小管上皮細(xì)胞凋亡水平，發(fā)現(xiàn)尿酸促進(jìn)其凋亡。高尿酸抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，既往文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)尿酸可激活線粒體途徑導(dǎo)致HK-2 細(xì)胞凋亡，加速腎臟病惡性進(jìn)展，然而高尿酸引起HK-2 細(xì)胞凋亡的其他分子機(jī)制尚不清楚。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）在真核生物中普遍存在，其內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常生理功能的基本條件，但很多因素可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能失衡，形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER stress，ERs），例如缺血再灌注損傷、氧化應(yīng)激、蛋白質(zhì)過度錯誤折疊、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣代謝紊亂等［11］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白GRP78∕BiP 和IRE1 是ERs 過程中重要分子，生理條件下兩者結(jié)合而失活，而ERs 發(fā)生時兩者分離而激活下游信號通路［12］。當(dāng)ERs 長期存在時，會引起細(xì)胞凋亡。IRE1 是介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子，通過與合腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（TNF receptor associated factor，TRAF2）和凋亡信號調(diào)節(jié)激酶（apoptosis-signaling kinase 1，ASK1）結(jié)合形成TRAF2-ASK1-JNK 復(fù)合體，激活下游JNK 信號通路引起細(xì)胞凋亡［17］。本研究通過Western-blot 檢測不同濃度尿酸處理后腎小管上皮細(xì)胞BiP∕GRP78、IRE1 和JNK 蛋白改變，發(fā)現(xiàn)BiP∕GRP78、IRE1 和JNK 蛋白表達(dá)升高，說明尿酸激活腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。然而尿酸是否通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)增殖和凋亡卻不能確定，本實驗使用4-PBA 阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后再使用尿酸處理，發(fā)現(xiàn)Cleaved-Caspase-12 蛋白水平下調(diào)，同時細(xì)胞存活率升高，證實了尿酸通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑發(fā)揮功能。

綜上所述，尿酸抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，并發(fā)現(xiàn)尿酸通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是其可能的分子機(jī)制，阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激治療高尿酸血癥引起的慢性腎臟病具有臨床應(yīng)用價值，進(jìn)一步深入探討尿酸損傷腎小管上皮細(xì)胞的分子機(jī)制，將有可能為高尿酸血癥的綜合治療帶來新的選擇。