周淼 李風(fēng)雷 張海龍 孫俊波

1河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院肺病科（鄭州450000）；2河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（鄭州450000）；3河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科（鄭州450000）

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種進(jìn)行性纖維化的間質(zhì)性肺炎，發(fā)病率高，藥物治療手段有限，預(yù)后不良［1］。主要病理特點(diǎn)是Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞增生，成纖維細(xì)胞積聚和肺實(shí)質(zhì)異常重塑［2］。上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是器官纖維化局灶成纖維細(xì)胞的重要來(lái)源，有研究表明Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞可通過(guò)EMT 轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，從而參與肺纖維化的病理過(guò)程［3-4］。

同源盒基因HOXB7 屬于HOX 基因家族B 簇，與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［5］。HOXB7 高表達(dá)可促進(jìn)EMT［6］，還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道證實(shí)其在IPF 中Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞EMT 中的作用。因此，本研究檢測(cè)HOXB7 對(duì)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞EMT 的作用，首次揭示其在IPF 中扮演的角色及可能的調(diào)控機(jī)制。另外，有研究表明堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）對(duì)EMT 有調(diào)節(jié)作用且可被HOXB7 調(diào)控［7］，因此筆者假設(shè)HOXB7 可通過(guò)調(diào)節(jié)bFGF 來(lái)調(diào)節(jié)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞EMT 過(guò)程，從而調(diào)控IPF 的發(fā)生、發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料 A549 細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC 公司；胎牛血清（FBS）、青霉素、鏈霉素和DMEM 購(gòu)自美國(guó)HyClone 公司；SYBR Premix Ex Taq II 和TRIZOL購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；HOXB7 鼠單抗、bFGF 鼠單抗、E-cadherin 鼠單抗、α-SMA 鼠單抗、COL1A1 鼠單抗、TGF-β1 鼠單抗、GAPDH 鼠單抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；BCA 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce 公司；Turbofect 購(gòu)自賽默飛世爾科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染后形態(tài)學(xué)觀察 人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞A549 由含10% FBS，2 mmol∕L L-glutamine，100 U∕mL 青霉素和100 μg∕mL 鏈霉素的低糖DMEM 培養(yǎng)基于5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)90%傳代。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)至70%用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 使之同步化。隨后進(jìn)行TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞EMT 過(guò)程（將TGF-β1 以5 ng∕mL 的 濃度稀釋于含0.1% BSA 的無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h）或細(xì)胞轉(zhuǎn)染。細(xì)胞分組如下：空白對(duì)照（Control組）、TGF-β1 誘導(dǎo)（TGF-β1組）、TGF-β1 誘導(dǎo)48 h 后轉(zhuǎn)染HOXB7 siRNA（β1-HOXB7 si組）、TGF-β1 誘導(dǎo)48 h 后轉(zhuǎn)染non-specific siRNA（β1-non-spe組）。最后，使用倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)改變。

1.2.2 組織采集 6例IPF 患者肺組織作為IPF組，其中男5 例，女1 例，年齡45～67 歲，平均58 歲。另外，對(duì)照組為因肺部病變行肺葉切除術(shù)，肺標(biāo)本取自遠(yuǎn)離病變部位，其中男3 例，女3 例；年齡47～60 歲，平均55 歲。組織立即冷凍。標(biāo)本均由河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院提供，患者簽署了知情同意書(shū)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)［8］TRizol 提取細(xì)胞或組織總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒以總RNA為模板合成cDNA，而后以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)程序：95 ℃4 min；95 ℃10 s，59 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。HOXB7 引物：Sense primer：5′-AAGTTCGGTTTTCGCTCCAGG-3′；Anti-sense primer：5′-ACACCCCGGAGAGGTTCTG-3′。E-cadherin 引物：Sense primer：5′-TTCTTCGGAGGAGAGCGG-3′；Anti-sense primer：5′-CAATTTCATCGGGATTGGC-3′。α-SMA 引物：Sense primer：5′-CTATGCCTCTGGACGCACAAC-3′；Anti-sense primer：5′ - CCCATCAGGCAACTCGTAACTC - 3′ 。COL1A1 引物：Sense primer：5′-AACGAGATCGAG CTCAGAGG -3′；Anti-sense primer：5′-GGGAGG TCTTGGTGGTTTTG-3′。GAPDH引物：Sense primer：5′-CGTCTTCACCACCATGGAGA- 3′ ；Anti-sense primer：5′-CGGCCATCACGCCACAGTTT-3′。反應(yīng)體系20 μL，包含10 μL SYBR Premix Ex TaqⅡ。GAPDH 為內(nèi)參，2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 免疫印記（Western blot） 收集細(xì)胞，裂解提取蛋白質(zhì)，BCA 試劑盒測(cè)定濃度且取25 μg 蛋白質(zhì)進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。5%脫脂奶粉的Tris Buffered Saline With Tween 溶液室溫封閉膜2.5 h，一抗：HOXB7 鼠單抗（1∶800）、bFGF 鼠單抗（1∶700）、E-cadherin 鼠單抗（1∶500）、α-SMA 鼠單抗（1∶500）、COL1A1 鼠單抗（1∶500）、TGF-β1 鼠單抗（1∶700）和GAPDH 鼠單抗（1∶1 000）4 ℃過(guò)夜。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗室溫孵育1 h，暗室曝光觀察結(jié)果。GAPDH 為內(nèi)參對(duì)照蛋白。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將A549（3 × 105）接種于6 孔板，37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，參照Turbofect操作說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將HOXB7 siRNA（5′-GCUAUU GUAAGGUCUUUGUTT-3′，5 μg）、non-specific siRNA（5 μg）分別與6 μL Turbofect 混合，分別加入各孔中。5%CO2條件下轉(zhuǎn)染48 h，后利用qRT-PCR和Western blot 方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)值均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，多組之間采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 纖維化組織中HOXB7 表達(dá)量升高 為研究纖維化對(duì)HOXB7 表達(dá)量的影響，利用qRT-PCR 檢測(cè)纖維化組織HOXB7 的mRNA 表達(dá)量。結(jié)果表明，纖維化組織HOXB7 mRNA（圖1）的表達(dá)量是正常組織的2 倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 特發(fā)性肺纖維化對(duì)HOXB7 表達(dá)量的影響Fig.1 The effect of IPF on HOXB7 expression

2.2 抑制HOXB7 表達(dá)量 為探究HOXB7 對(duì)細(xì)胞纖維化的作用，首先通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染HOXB7 siRNA抑制HOXB7，qRT-PCR 和Western blot 分別檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后A549 中HOXB7 mRNA 和蛋白表達(dá)量的變化。結(jié)果表明，β1-HOXB7 si組HOXB7 mRNA（圖2A）和蛋白表達(dá)量（圖2B）較β1-non-spe組顯著下調(diào)。

2.3 下調(diào)HOXB7 抑制細(xì)胞纖維化 在HOXB7 抑制的情況下，通過(guò)倒置相差顯微鏡觀察HOXB7 對(duì)A549 細(xì)胞纖維化的影響。結(jié)果表明，TGF-β1組細(xì)胞形態(tài)與control組相比，細(xì)胞由鵝卵石形或多角形轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮?、?xì)胞間連接變松散，呈間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。而β1-HOXB7 si組細(xì)胞形態(tài)又轉(zhuǎn)變?yōu)轾Z卵石形或多角形與control組相同（圖3）。

圖2 轉(zhuǎn)染后A549 中HOXB7 的表達(dá)量變化Fig.2 The change of HOXB7 expression in A549 aftertransfection

圖3 轉(zhuǎn)染后A549 形態(tài)學(xué)變化（×200）Fig.3 Morphological change of A549 after transfection

2.4 下調(diào)HOXB7 抑制細(xì)胞EMT 過(guò)程 為進(jìn)一步證實(shí)HOXB7 對(duì)A549 細(xì)胞纖維化的作用，檢測(cè)了抑制HOXB7 對(duì)A549 EMT 的標(biāo)志物分子E-cad、α-SMA 和纖維化標(biāo)志物COL1A1 表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示，與β1-non-spe組相比，β1-HOXB7 si組中，E-cadherin的表達(dá)量顯著升高，α-SMA 和COL1A1的表達(dá)顯著降低（圖4）。

2.5 HOXB7 通過(guò)調(diào)節(jié)bFGF 來(lái)調(diào)控細(xì)胞EMT為探究HOXB7 對(duì)細(xì)胞纖維化調(diào)控的可能機(jī)制，利用Western blot 檢測(cè)bFGF 蛋白表達(dá)量。結(jié)果表明，β1-HOXB7 si組中bFGF 的蛋白表達(dá)量較β1-non-spe組顯著降低（圖5A）。為了探究HOXB7 對(duì)A549 細(xì)胞纖維化的調(diào)控作用是否可以通過(guò)調(diào)控bFGF 來(lái)實(shí)現(xiàn)，用bFGF（9 ng∕mL）孵育β1-HOXB7 si組細(xì)胞5 min，發(fā)現(xiàn)E-cadherin 蛋白表達(dá)量明顯降低，α-SMA 和COL1A1 的蛋白表達(dá)量均顯著升高（圖5B）。

圖4 轉(zhuǎn)染后A549 中EMT 標(biāo)志物和COL1A1 的表達(dá)量變化Fig.4 Changes in expression levels of EMT markers and COL1A1 in A549 after transfection

3 討論

IPF 是彌漫性間質(zhì)性肺病中的特殊類(lèi)型，無(wú)特效治療方法，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。IPF 共同特點(diǎn)是大量成纖維細(xì)胞∕肌成纖維細(xì)胞聚集和細(xì)胞外基質(zhì)積聚［9］。成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞聚集是肺纖維化重要環(huán)節(jié)，肌成纖維細(xì)胞激活可分泌Ⅰ和Ⅱ膠原蛋白，同時(shí)促進(jìn)α-SMA 的表達(dá)［10-11］。Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞可通過(guò)EMT 轉(zhuǎn)化成肺成纖維細(xì)胞∕肌成纖維細(xì)胞［12］。在EMT 過(guò)程中，上皮細(xì)胞通過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞并獲得遷移能力，上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin 等表達(dá)下調(diào)，間葉標(biāo)記物α-SMA 等表達(dá)上調(diào)［13］。因此，本研究選擇E-cadherin 作為上皮細(xì)胞標(biāo)記物，α-SMA 為間葉標(biāo)記物，可以有效評(píng)價(jià)EMT 的轉(zhuǎn)化。Ⅰ型膠原蛋白（COL1A1）的表達(dá)也是纖維化的標(biāo)志［14］。本研究通過(guò)檢測(cè)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞A549 的EMT 轉(zhuǎn)化，來(lái)評(píng)定HOXB7 對(duì)肺纖維化的作用。

圖5 bFGF 對(duì)A549 中EMT 的影響Fig.5 Effect of bFGF on EMT in A549

HOXB7 是胚胎發(fā)育時(shí)期調(diào)控上皮包括肺上皮細(xì)胞增殖、分化、遷移的主控基因，而在成體時(shí)期，HOXB7 高表達(dá)可促進(jìn)上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化［15］。研究表明，HOXB7 的高表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌、口腔癌、黑色素和肺腺癌等多種癌癥細(xì)胞的增殖和EMT［16］。HUAN 等［17］發(fā)現(xiàn)，HOXB7 通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞EMT 轉(zhuǎn)化促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移。YANG 等［6］發(fā)現(xiàn)，HOXB7促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞EMT，從而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。STIEGELBAUER 等［5］報(bào)道HOXB7 被miR-196b-5p 抑制后，結(jié)腸癌細(xì)胞EMT 同樣被抑制，從而降低結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。然而，對(duì)于HOXB7是否對(duì)肺纖維化過(guò)程中EMT 有影響，目前為止還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。SHIMBORI 等［18］表明，TGF-β1 可顯著誘導(dǎo)A549 細(xì)胞纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)，IPF組織HOXB7 的表達(dá)量顯著升高。降低HOXB7 表達(dá)量有效抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的A549 形態(tài)上纖維化轉(zhuǎn)變且抑制EMT 和COL1A1 的表達(dá)，說(shuō)明A549 纖維化被抑制。因此，本研究首次發(fā)現(xiàn)HOXB7 在IPF組織中表達(dá)量上調(diào)，且干擾HOXB7 表達(dá)可抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)A549 細(xì)胞的纖維化。為IPF 的預(yù)防和治療提供了一定的理論基礎(chǔ)，但本研究側(cè)重于對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞的研究，所以在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中可以側(cè)重于體內(nèi)研究。

有研究［19］表明在口腔癌和乳腺癌細(xì)胞中，HOXB7調(diào)控bFGF，進(jìn)而影響癌癥發(fā)生、發(fā)展。bFGF具有促進(jìn)EMT 的作用，如在晶狀體上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞中等［7，20］。因此，筆者假設(shè)HOXB7 通過(guò)調(diào)控bFGF 影響A549 細(xì)胞纖維化。本研究，結(jié)果表明在TGF-β1 誘導(dǎo)細(xì)胞的情況下，降低HOXB7 顯著抑制bFGF 表達(dá)量，且bFGF 孵育上述抑制HOXB7 的A549 后，顯著消除了抑制HOXB7 對(duì)細(xì)胞EMT 的作用。因此，減少HOXB7 表達(dá)量對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞纖維化的抑制作用，可通過(guò)調(diào)控bFGF 來(lái)實(shí)現(xiàn)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)IPF組織中HOXB7 表達(dá)量顯著上升，降低HOXB7 顯著抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞形態(tài)學(xué)上纖維化的變化，且抑制EMT 和COL1A1 表達(dá)。另外。降低HOXB7 可抑制bFGF的表達(dá)，且通過(guò)調(diào)控bFGF 來(lái)抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞纖維化，為IPF 的防治提供新的潛在靶標(biāo)和理論基礎(chǔ)。