張洪蘭 陳昊 張春芳 張昶 齊冬雪 李偉 劉新麗 劉華

連云港市第一人民醫(yī)院1病理科，2中心實驗室（江蘇連云港222002）

賁門胃底癌陽性體征出現(xiàn)較晚，不易完整手術(shù)切除，多年來預(yù)后一直不見明顯改善［1］，該類胃癌發(fā)生率近年呈現(xiàn)不斷增高的趨勢。錯過最佳手術(shù)期，只能化療，而普通化療療效不明顯且副作用大，靶向化療是目前效果最明顯的治療方法。因此，進一步闡明賁門胃底癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子機制，尋找有效的靶標及相關(guān)的調(diào)節(jié)因子，對于提高該類胃癌的療效具有重要的臨床意義。

蛋白磷酸酶2A（PP2A）的癌性抑制因子（cancerous inhibitor of protein phosphatase2A，CIP2A）是一種近年來被發(fā)現(xiàn)的癌基因，可在后轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)c-Myc 蛋白表達；癌基因HER-2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）作為表皮生長因子受體家族成員之一，其介導(dǎo)的信號通路PI3K∕Akt∕mTOR 可增強c-Myc 的蛋白翻譯［2］；而原癌基因c-Myc 是具有激活和抑制雙重作用的轉(zhuǎn)錄因子，在胃癌的發(fā)生及進展中起關(guān)鍵的調(diào)控作用［3］。從目前的研究現(xiàn)狀來看，國內(nèi)外罕見賁門胃底癌福爾馬林固定石蠟包埋（formaldehyde fixed paraffinembedded，F(xiàn)FPE）組織CIP2A mRNA 水平的回顧性研究，其與HER-2 基因在c-Myc 蛋白共調(diào)控方面是否存在著協(xié)同作用，未見類似報道。本研究應(yīng)用半定量RT-PCR 方法檢測CIP2A mRNA 表達，熒光原位雜交（FISH）方法檢測HER-2 基因擴增，探討二者及其與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，為賁門胃底癌的診斷、治療和預(yù)后提供一定的依據(jù)，同時了解CIP2A 的分子調(diào)控機制。

1 資料與方法

1.1 標本收集 收集2016年5月至2017年4月間連云港市第一人民醫(yī)院手術(shù)切除的47 例賁門胃底癌石蠟包埋組織，所有病例均為進展期癌，均為RT-PCR 實驗成功者（實驗均在組織包埋成蠟塊的1年內(nèi)進行）。其中男27 例，女20 例：年齡22～73（中位年齡58）歲。進展期胃癌依據(jù)WHO 分類，分為管狀腺癌、乳頭狀腺癌、低分化腺癌（未分化癌）等；分級分3 級，包括高分化、中分化和低分化。本組病例包含管狀腺癌22 例，乳頭狀腺癌3 例，低分化腺癌22 例。賁門胃底癌的臨床分期依據(jù)2016年10月國際抗癌聯(lián)盟及美國聯(lián)合會（UICC∕AJCC）發(fā)布的第8 版胃癌TNM 分期法，TNMⅠ期5 例，Ⅱ期14 例，Ⅲ期17 例，Ⅳ期11 例。腫瘤分化程度：高分化7 例，中分化10 例，低分化30例。另選取對應(yīng)癌旁組織47 例。

1.2 主要試劑及RT-PCR 引物 HER-2 基因擴增FISH 方法檢測試劑盒購自廣州安比平有限公司；環(huán)保脫蠟液購自無錫市江源實業(yè)技貿(mào)總公司；High Pure Paraffin RNA Isolation Kit 石蠟組織總RNA 提取試劑盒，購自美國Roche 公司；Prime-ScriptTMRT reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和2×Taq PCR Mastermix 購自TaKaRa 公司；CIP2A 引物序列同文獻［4］，并在NCBI 網(wǎng)站進行了BLAST 驗證，證實為CIP2A 特異的引物：P1：5′-TACGAATTCATGCGACGGCTGCTGATC-3′（forward）；P2：5′-TACCTCGAGGGAGAAGGCGAACTGTCCGA-3′（reverse），擴增產(chǎn)物307 bp。以β-actin 基因表達產(chǎn)物為內(nèi)參照設(shè)計PCR 引物，序列如下：P1：5′-ATCGTGCGTGACATAAGGAGAAG-3′（forward）；P2：5-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′（reverse），擴增產(chǎn)物197 bp，由上海生工公司合成。

1.3 方法

1.3.1 CIP2A mRNA 提取、擴增及定量 參照以往研究［5-6］FFPE組織中RNA 提取、擴增并加以改進的方法：（1）脫蠟及洗滌：取FFPE組織，切片，每片厚度5 μm，共10 片，放入1.5 mL 無菌EP 管，加入1 mL 環(huán)保脫蠟液57 ℃恒溫水浴常規(guī)脫蠟3 次，100%乙醇洗滌，離心，除上清，共3 次，室溫空氣干燥。（2）RNA 提?。喊凑誇FPE組織總RNA 試劑盒說明操作提取總RNA，用50 μL 1‰DEPC 水溶解。（3）RNA 質(zhì)量檢測：取1 μL 樣本用紫外分光光度計檢測吸光值（A值）及濃度（ng∕μL）（確保無DNA和蛋白污染，OD260∕OD280= 2.0±0.2，OD260∕OD230≥1.7）。（4）RT-PCR：采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，取1 μg 總RNA 為模板，在10 μL 擴增反應(yīng)體系中以O(shè)ligo dT Primer 為引物，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取cDNA 2 μg 為模板，在25 μL 擴增反應(yīng)體系中進行擴增，產(chǎn)物檢測采用瓊脂糖凝膠電泳法。（5）擴增產(chǎn)物半定量分析：應(yīng)用GeneSnap 軟件系統(tǒng)分析擴增條帶。將CIP2A 基因與β-actin 基因擴增條帶吸光度的比值（CIP2A∕β-actin）計為CIP2A 基因的相對表達量。

1.3.2 HER-2 基因擴增檢測 依照試劑盒提供的標準操作方法，將標本置于全自動組織脫水程序18 h 后石蠟包埋，以4 μm 厚度切片，70 ℃烤片2 h 待用。預(yù)處理：新型環(huán)保透明脫蠟液脫蠟，水化；置于預(yù)熱至100 ℃的滅菌純化水20 min，室溫干燥；胃蛋白酶液消化。變性及雜交：吸取10 μL探針液至組織區(qū)域，85 ℃變性5 min 37 ℃雜交過夜（12 h）。次日，37 ℃洗液Ⅰ和Ⅱ洗滌，滴加DAPI，封片。避光孵化15～20 min 后，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗，雙變量相關(guān)性分析采用非連續(xù)變量Spearman 相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 CIP2A mRNA 在賁門胃底癌及癌旁組織中的轉(zhuǎn)錄水平 分析47例賁門胃底癌及其癌旁FFPE組織中CIP2A mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，賁門胃底癌組織中CIP2A mRNA 的陽性檢出率為74.5%（35∕47），高于癌旁組織中的檢出率27.7%（13∕47，P=0.000，圖1）。根據(jù)GeneSnap軟件系統(tǒng)分析擴增條帶，計算CIP2A mRNA的相對轉(zhuǎn)錄水平。t檢驗結(jié)果顯示，35例賁門胃底癌組織中CIP2A基因的平均轉(zhuǎn)錄水平為0.49±0.09，13 例癌旁組織中平均轉(zhuǎn)錄水平為（0.09±0.02），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 賁門胃底FFPE組織中CIP2A 基因RT-PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of CIP2A gene RT-PCR products in FFPE tissue of cardia-fundal carcinoma

2.2 賁門胃底癌組織中CIP2A mRNA 表達與臨床病理特征的關(guān)系 筆者采用楊雪等［4］研究中提到的統(tǒng)計學(xué)方法，將該組賁門胃底癌病例分為CIP2A mRNA 高轉(zhuǎn)錄水平組（≥0.49）22 例和低轉(zhuǎn)錄水平組（＜0.49）25 例。結(jié)合臨床資料，分析CIP2A mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平與賁門胃底癌臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，CIP2A mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平與腸型胃癌、較高的分化程度、腫瘤浸潤深度、TNM 分期、血管癌栓及神經(jīng)侵犯相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

2.3 賁門胃底癌組織中HER-2 基因的擴增與臨床病理特征的關(guān)系 47 例賁門胃底癌患者中，HER-2 基因擴增者9 例，占19.1%（圖2）。結(jié)合臨床資料，分析HER-2 基因擴增與賁門胃底癌臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，HER-2 基因的擴增與腸型胃癌、較高的分化程度及神經(jīng)侵犯相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

圖2 賁門胃底癌組織中HER-2 基因擴增Fig2 Amplification of HER-2 in cardia-fundal carcinoma

2.4 賁門胃底癌組織CIP2A mRNA 表達與HER-2 基因擴增的擴增的關(guān)系 CIP2A mRNA 與HER-2基因擴增表達呈正相關(guān)性（r= 0.410，P= 0.004）。其中CIP2A mRNA 高轉(zhuǎn)錄組，CIP2A 陽性表達率36.36%（8∕22）；CIP2A mRNA 低轉(zhuǎn)錄組，CIP2A 陽性表達率為4.00%（1∕25，表2）。

表1 賁門胃底癌組織中CIP2A mRNA 表達和HER-2 擴增與臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Expression of CIP2A mRNA and HER-2 amplification in cardia-fundal carcinoma and its relationship with clinicopathological characteristics

3 討論

胃癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，病死率較高。手術(shù)切除是目前比較有效的治療方法，但賁門胃底部癌的生存率依舊很低，因為很多患者在確診時已失去手術(shù)機會。TNM 分期是判斷胃癌預(yù)后的重要指標，但很多分期相同的患者，預(yù)后也出現(xiàn)明顯差異［7］。因此，個體化分子靶向治療是晚期胃癌的重要治療手段，多基因檢測在未來的腫瘤治療中將成為主流。 CIP2A 是近年被發(fā)現(xiàn)的一種新的癌基因，體外實驗發(fā)現(xiàn)其在維持和促進細胞惡性轉(zhuǎn)化、增殖和體內(nèi)腫瘤形成方面起關(guān)鍵作用［8-9］。因其能夠抑制蛋白磷酸酶2A（PP2A）的磷酸化活性而得名，它通過直接與癌轉(zhuǎn)錄因子c-Myc 結(jié)合，抑制PP2A 的B56α調(diào)節(jié)亞基對c-Myc 62 位絲氨酸的脫磷酸化作用，從而穩(wěn)定c-Myc 蛋白的二元磷酸化結(jié)構(gòu)，抑制其泛素化水解。同時，KHANNA 等［10］在胃癌AGS 細胞、腸型胃癌MKN-28和人纖維肉瘤HT1080 細胞中應(yīng)用c-Myc RNA 干擾技術(shù)后發(fā)現(xiàn)CIP2A 蛋白和CIP2A mRNA 表達水平顯著降低，說明c-Myc 作為癌轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子可以上調(diào)CIP2A 的表達，二者形成了一個正反饋環(huán)路。CIP2A 在人體腫瘤乳腺癌［11］、頭頸部鱗癌［12］、肝癌［4］、腦膠質(zhì)瘤［13］、非小細胞肺癌［14］、胃癌［15］等組織中存在高表達，且與腫瘤的惡性臨床病理參數(shù)和不良預(yù)后相關(guān)。

表2 賁門胃底癌組織中CIP2A mRNA 表達水平及HER-2基因擴增的關(guān)系Tab.2 Relationship between CIP2A mRNA expression and HER-2 gene amplification in cardia-fundal carcinoma例

HER-2 受體是人表皮生長因子受體家族成員之一，定位于人類17q21，蛋白從結(jié)構(gòu)上分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，后者具有酪氨酸激酶活性，與表皮生長因子受體具有同源性。其參與了多種信號通路，主要包括Ras∕MAPK 途徑、P13K∕Akt 途徑、PLCr 途徑和STAT 途徑。HER-2 可通過多種途徑參與c-Myc 基因表達，其中P13K∕Akt∕mTOR 信號通路最為明確，它可作用于c-Myc mRNA 5′非翻譯區(qū)（5′UTR）的引導(dǎo)序列（PL2），PL2 含有內(nèi)部核糖體進入位點（IRES），因而可增強c-Myc mRNA 的蛋白翻譯［2］。HER-2 基因擴增可致HER-2 蛋白高表達，導(dǎo)致細胞惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤進展見于多數(shù)人類惡性腫瘤如乳腺癌、胃癌、卵巢癌、肺癌等［16］。

c-Myc 是轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，具有多個功能域，在轉(zhuǎn)錄過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。c-Myc蛋白的N-端含有轉(zhuǎn)錄活化功能域，C-端部位含有亮氨酸拉鎖結(jié)構(gòu)和HLH 結(jié)構(gòu)，必要時形成異質(zhì)二聚體抑制轉(zhuǎn)錄。眾所周知，c-Myc 表達與細胞增殖狀態(tài)有關(guān)，增殖期c-Myc 高水平表達，休眠期c-Myc低水平表達，這也是惡性腫瘤作為高增殖體高度表達c-Myc 的重要原因。c-Myc 表達水平的調(diào)節(jié)是相當復(fù)雜的，mRNA 和蛋白具有較短的半衰期，受多點調(diào)節(jié)控制，包括起始、轉(zhuǎn)錄延長、翻譯和mRNA、蛋白質(zhì)的加工。CIP2A 和HER-2 作為c-Myc 表達后轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)的典范，二者在c-Myc 調(diào)節(jié)上是否存在一定的關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示，賁門胃底癌組織中CIP2AmRNA 與HER-2 基因擴增表達呈正相關(guān)性（r=0.410，P=0.004），提示CIP2A和HER-2 在c-Myc 表達后轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)上存在一定的協(xié)同作用，HER-2 可通過某種途徑上調(diào)CIP2A表達。

本研究結(jié)果顯示賁門胃底癌CIP2A mRNA 陽性檢出率為74.5%（35∕47），低于LI 等［8］研究中的CIP2A mRNA 陽性檢出率，可能與FFPE組織RNA降解增多和蛋白交聯(lián)提取率較低相關(guān)，但目前的RNA 提取試劑盒對于保存1年內(nèi)的蠟塊還是有較強的臨床應(yīng)用價值的。癌組織CIP2A mRNA 的相對轉(zhuǎn)錄水平為0.49，癌旁組織CIP2A mRNA 的相對轉(zhuǎn)錄水平為0.09，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明CIP2A 作為一種癌基因存在于胃癌組織中；且CIP2A mRNA 過表達與腸型、分化型、較大的TNM分期、較深的浸潤深度、癌栓及神經(jīng)侵犯相關(guān)，提示CIP2A 在某些特殊類型的胃癌中高表達，并與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等較差的預(yù)后指標相關(guān)。與張洪蘭等［17］應(yīng)用免疫組化方法檢測賁門胃底癌組織中CIP2A 蛋白表達的研究結(jié)論一致，該研究還證實CIP2A 表達與患者的總生存率相關(guān)且為獨立的預(yù)后危險因素，因此檢測CIP2A 基因的高表達更有助于賁門胃底癌惡性程度的判斷、評估預(yù)后和提供準確的治療靶點。另外，賁門胃底癌HER-2基因擴增者占19.1%（9∕35），HER-2 擴增與腸型胃癌、較高的分化程度及神經(jīng)侵犯相關(guān)，與況麗萍等［18］應(yīng)用免疫組化方法檢測胃癌中HER2 表達的結(jié)論一致，提示HER-2 基因擴增與患者較差的預(yù)后因素不完全相關(guān)，不能作為胃癌患者獨立的預(yù)后指標，或許HER-2 在對c-Myc 后轉(zhuǎn)錄水平和CIP2A 的調(diào)節(jié)在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著更重要的作用。

值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)CIP2A 和HER-2表達呈正相關(guān)，二者高表達與賁門胃底癌較高的分化程度和腸型胃癌相關(guān)，與LI 等［8］和HER-2 研究全國合作組［19］的研究結(jié)論一致，提示二者在腫瘤的去分化中部分丟失，且可能與腸型胃癌特定的細胞亞群相關(guān)。這是CIP2A 區(qū)別于其他癌基因的兩大特點，故筆者推測CIP2A 在賁門胃底癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著一種有異于一般癌基因的角色，同時受到HER-2 基因的正調(diào)節(jié)，它必將成為一種特殊的腫瘤治療靶點，同時有研究證實CIP2A高表達還與胃癌患者順鉑耐藥相關(guān)［20］。