孫順濤 楊宏宇 羅娟 余術(shù)宜 楊輝俊

口腔癌是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤，以鱗狀細(xì)胞癌為主。口腔癌的治療方法較多，免疫基因治療是重要的一種手段[1]。機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫主要依靠T細(xì)胞免疫。T細(xì)胞活化和增殖依賴于雙重信號(hào)，一是抗原呈遞細(xì)胞呈遞的抗原肽-主要組織相容性復(fù)合物組成的第一信號(hào)；二是共刺激信號(hào)[2-3]。T細(xì)胞只有識(shí)別這兩個(gè)信號(hào)才能得到有效增殖，進(jìn)而發(fā)揮其細(xì)胞免疫功能。T細(xì)胞若缺乏共刺激信號(hào)，則進(jìn)入無(wú)反應(yīng)狀態(tài)，甚至發(fā)生凋亡[4]。CD28/B7、4-1BB/4-1BBL是激發(fā)有效抗腫瘤免疫效應(yīng)所必需的重要共刺激分子[5-9]。基于此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建的真核表達(dá)載體pEGFP-4-1BBL-B7-H3轉(zhuǎn)染人口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞，觀察4-1BBL-B7-H3的體外抗腫瘤免疫作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞由上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科腫瘤生物實(shí)驗(yàn)室提供，Tca8113-4-1BBL、Tca8113-B7-H3腫瘤細(xì)胞疫苗由北京大學(xué)深圳醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建[10-11]。小牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、G418購(gòu)自美國(guó)Gibco公司（批號(hào)：1227693），IFN-γELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司（批號(hào)：20130013）；CCK-8購(gòu)自日本Dojindo公司（批號(hào)：KM671）；兔抗人4-1BBL一抗購(gòu)自美國(guó)CHEMICON公司，CD3單抗購(gòu)自美國(guó)ProMab公司。Trizol、Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Ivitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自立陶宛Fermantas公司，PCR試劑盒購(gòu)自北京博大泰克公司，人外周血淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自深圳達(dá)科維公司。流式細(xì)胞儀表型分析儀、Thermo NanoDrop紫外分光光度計(jì)、常規(guī)試劑、超速離心機(jī)、超低溫冰箱、羅氏定量PCR儀LC480等由北京大學(xué)深圳醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 真核表達(dá)載體pEGFP-4-1BBL-B7-H3的轉(zhuǎn)染與鑒定 按Lipofectamine 2000試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，將pEGFP-4-1BBL-B7-H3真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞。24h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和轉(zhuǎn)染效率。加入 G418（400~600μg/ml）進(jìn)行 4-1BBL 陽(yáng)性細(xì)胞篩選，1周后用有限稀釋法篩選單克隆。由于人4-1BBL-B7-H3完整的引物難以設(shè)計(jì)，故分別檢測(cè)4-1BBL mRNA和B7-H3 mRNA在腫瘤組織中的表達(dá)情況。RT-PCR引物如下。4-1BBL上游引物：5′-CGGGCTCCGTTTCACTTGCG-3′；下游引物：5′-AGTCCGGCTGGGATTTCG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng) 271 bp。B7-H3 上游引物：5′-CGCACGGCTCTGTCACCATCA-3′；下游引物：5′-TCAGAGGCTGCAGGGCTGTCTTG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)591bp。挑選高表達(dá)克隆并命名為Tca8113-4-1BBLB7-H3細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用Trizol從轉(zhuǎn)染pEGFP-4-1BBL-B7-H3的Tca8113細(xì)胞中提取總RNA，然后用RT-PCR檢測(cè)4-1BBL-B7-H3的表達(dá)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表型，采用RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中4-1BBLB7-H3 mRNA的表達(dá)。

1.2.2 腫瘤細(xì)胞疫苗的制備 收集培養(yǎng)的Tca8113-4-1BBL-B7-H3 細(xì)胞，PBS 液洗 2 次，細(xì)胞數(shù)調(diào)至 1×107/ml，以20μg/ml絲裂霉素C處理后，于37℃、5%二氧化碳環(huán)境中處理1.5h，PBS液洗3次，以含10%小牛血清的RPMI1640重懸細(xì)胞，制成腫瘤細(xì)胞疫苗備用。

1.2.3 人外周血淋巴細(xì)胞的獲得、培養(yǎng)與純化 采用Ficoll分離的方法獲得健康人的外周血單個(gè)核細(xì)胞，再經(jīng)尼龍毛柱分離、純化獲得T淋巴細(xì)胞。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，純化后的T細(xì)胞純度可達(dá)90%以上。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）殺傷活性將已用絲裂霉素 C（10μg/ml）處理的 Tca8113、Tca8113-4-1BBL、Tca8113-B7-H3、Tca8113-4-1BBL-B7-H3細(xì)胞株調(diào)整濃度為1×106/ml。分別與純化后的T細(xì)胞按1∶2.5混合，分成4組。Ⅰ組：T細(xì)胞+滅活Tca8113腫瘤細(xì)胞疫苗（TCV-Tca8113）組；Ⅱ組：T細(xì)胞+滅活TCV-4-1BBL組；Ⅲ組：T細(xì)胞+滅活TCV-B7-H3組；Ⅳ組：T細(xì)胞+滅活TCV-4-1BBL-B7-H3組。4組細(xì)胞均接種于96孔板培養(yǎng)，100μl/孔，并設(shè)復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24、48、72h棄去培養(yǎng)基，PBS洗2遍，分別各加入100μl無(wú)色培養(yǎng)基和10μl CCK-8試劑，在培養(yǎng)箱培育3h，于波長(zhǎng)450nm處測(cè)定吸光度A值，檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。CTL殺傷活性按以下公式計(jì)算：CTL的殺傷活性（%）=[1-（靶細(xì)胞對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值）/靶細(xì)胞對(duì)照組A值]×100%。

1.2.5 細(xì)胞因子檢測(cè) 活化后T細(xì)胞可分泌IFN-γ等細(xì)胞因子。分別于培養(yǎng)24、48、和72h，采用ELISA法檢測(cè)4組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IFN-γ水平。

1.3 觀察指標(biāo) （1）轉(zhuǎn)染細(xì)胞表型分析結(jié)果；（2）轉(zhuǎn)染細(xì)胞4-1BBL-B7-H3 mRNA的表達(dá)情況；（3）比較4組細(xì)胞體外誘導(dǎo)CTL殺傷活性；（4）比較4組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞表型分析結(jié)果 pEGFP-4-1BBL-B7-H3質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染入Tca8113細(xì)胞中，采用綠熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表型，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染的細(xì)胞能穩(wěn)定高表達(dá)4-1BBL，見(jiàn)圖1。

2.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞4-1BBL-B7-H3 mRNA的表達(dá)情況RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果表明，4-1BBL擴(kuò)增產(chǎn)物的大小約271bp，B7-H3擴(kuò)增產(chǎn)物的大小約591 bp，與預(yù)期大小一致，見(jiàn)圖2。這表明人4-1BBL-B7-H3質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染成功，Tca8113-4-1BBL-B7-H3細(xì)胞構(gòu)建成功。

圖1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞表型分析流式細(xì)胞圖（a：mock/Tcca8113細(xì)胞；b:4-1BBL/Tca8113細(xì)胞）

圖2 Tca8113細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-4-1BBL-B7-H3質(zhì)粒后的PT-PCR產(chǎn)物電泳圖

2.3 4組細(xì)胞體外誘導(dǎo)CTL殺傷活性比較 培養(yǎng)24、48、72h，4組細(xì)胞體外誘導(dǎo)CTL殺傷活性比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；且與其他3組比較，Ⅳ組細(xì)胞體外誘導(dǎo)CTL殺傷活性最強(qiáng)（均P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 4組細(xì)胞體外誘導(dǎo)CTL殺傷活性比較

2.4 4組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ水平比較 培養(yǎng)24、48、72h，4組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與其他3組比較，Ⅰ組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ水平最低（均P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 4組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ水平比較

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中，筆者將構(gòu)建的pEGFP-4-1BB7-H3質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染人口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞，并獲得穩(wěn)定高表達(dá)，經(jīng)絲裂霉素C處理后，與純化的人外周血中的T淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)，結(jié)果顯示T細(xì)胞增殖、分泌IFN-γ及抗腫瘤免疫作用明顯。4-1BBL-B7-H3作為共刺激分子，能顯著提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性，協(xié)助誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，激發(fā)特異性抗腫瘤免疫作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4-1BBL-B7-H3提供的共刺激信號(hào)能促進(jìn)T細(xì)胞分泌IFN-γ。IFN-γ分泌水平也是反映T細(xì)胞活化水平的重要指標(biāo)，IFN-γ可有效地增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞表面MHCⅠ類和Ⅱ類抗原分子的表達(dá)，有增強(qiáng)抗原遞呈和免疫應(yīng)答的作用；促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞的分化，誘導(dǎo)CTL的產(chǎn)生；在促進(jìn)激活T細(xì)胞的殺傷能力方面具有重要作用[12]。另一方面，IFN-γ亦可促進(jìn)其他免疫細(xì)胞（如NK細(xì)胞）對(duì)腫瘤細(xì)胞的非特異性殺傷作用[13]。

T細(xì)胞收集純化后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)純度均達(dá)90%以上，其中混有少量B細(xì)胞等單核細(xì)胞，共同培養(yǎng)后細(xì)胞增殖主要是以CD4+Th和CD8+Tc細(xì)胞為主。體內(nèi)外研究表明，腫瘤細(xì)胞往往由于缺乏或低表達(dá)這些共刺激分子而不能活化T細(xì)胞，介導(dǎo)有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答[14-16]。介導(dǎo)共刺激信號(hào)的分子有多種，B7-H3-TLT-2共刺激信號(hào)主要在T細(xì)胞活化的前期起作用，促進(jìn)T細(xì)胞增殖并維持其短期的存活；4-1BB/4-1BBL信號(hào)主要在T細(xì)胞反應(yīng)后期維持T細(xì)胞的生存及在免疫記憶應(yīng)答中起重要作用。腫瘤細(xì)胞及T細(xì)胞表面的一些其它相互作用分子可能對(duì)形成第一信號(hào)的三聯(lián)體有一定的促進(jìn)作用。

綜上所述，4-1BBL-B7-H3雙基因修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗可為口腔鱗癌的治療提供高效、特異的免疫活性細(xì)胞和具有廣譜抗腫瘤活性的天然免疫細(xì)胞，這對(duì)完善腫瘤基因免疫治療提供了一條新的途徑。