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(大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023)

中國幅員遼闊，海水資源豐富，海水可養(yǎng)殖面積為2600.11 km2[1]。中國海水貝類養(yǎng)殖產(chǎn)量占海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的80%，占世界貝類總產(chǎn)量的60%[2]， 2015年，中國扇貝產(chǎn)量達(dá)到 179萬t，約占貝類養(yǎng)殖總產(chǎn)量的13%[3]。隨著凍貝柱、干貝柱的加工和出口量越來越大，扇貝裙邊數(shù)量也日益增多[4]，約占扇貝總質(zhì)量的27.8%。扇貝裙邊的營養(yǎng)組成與扇貝柱相似[5]，是理想的高蛋白、低脂肪、低糖類原料，故可作為開發(fā)活性肽的重要資源。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin convert enzyme，ACE)是一種含Zn2+輔基的二肽羧肽酶[6]，在生物體的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-Angiotensin System，RAS)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(Kallikrein-kinin system，KKS)中可催化無活性的血管緊張素Ⅰ(AngⅠ)轉(zhuǎn)化成具有收縮血管作用的血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)，促使血壓升高，而血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽(Angiotensin convert enzymepeptides，ACE抑制肽)是一類具有ACE抑制活性的多肽物質(zhì)，大多由2～12個氨基酸組成，極個別由更多個氨基酸組成[7]，其可通過抑制ACE酶的活性，達(dá)到預(yù)防和治療高血壓等相關(guān)疾病的目的[7-8]。

目前，常見的具有ACE抑制作用的降血壓藥物有卡托普利、依那普利、阿拉普利和賴諾普利等，雖然此類藥物的藥效明顯，但由于其是化學(xué)合成藥物，均存在一定的副作用，如過敏反應(yīng)、皮膚皮疹、咳嗽、味覺紊亂等[9-10]。所以，近年來人們開始從各種食物中不斷探求具有ACE抑制活性的天然成分，用天然具有ACE抑制活性的肽作為合成藥物的替代品[11]。然而，一些食源性ACE抑制肽在消化道內(nèi)可能會被消化酶分解，降低其ACE抑制活性和降血壓效果[12]，因此，需要通過體內(nèi)活性檢測(即動物試驗)來進(jìn)一步評價ACE抑制肽的降血壓效果。

本研究中，從蝦夷扇貝Patinopectenyessoensis裙邊酶解液中分離純化ACE抑制肽，并通過動物試驗驗證ACE抑制肽的降血壓效果，旨在為來源于扇貝裙邊的ACE抑制肽的開發(fā)和利用提供依據(jù)，實現(xiàn)扇貝裙邊的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗原料與試劑 試驗用扇貝裙邊來自大連某食品加工廠下腳料，于-18 ℃下冷凍貯存。

試驗用主要試劑有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、馬尿酰-組氨酸-亮氨酸(Hip-His-Leu，HHL)、硼酸、硼砂、甲醇均購自Sigma公司；木瓜蛋白酶購自上海蓮冠生物化工有限公司；氫氧化鈉、冰醋酸均購自天津大茂化學(xué)試劑廠；三氟乙酸、乙腈(色譜級)均購自天津博迪化工股份有限公司。

1.1.2 試驗儀器設(shè)備 勻漿機(jī)(上海標(biāo)本模型廠)、Scientz-10N冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)、HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)、721型紫外可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、高效液相色譜儀Aglient 1260 (安捷倫公司)、90-2低速臺式離心機(jī)[上海醫(yī)療器械(集團(tuán))有限公司]、精密pH計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、Orbitrap Q Exactive質(zhì)譜儀(美國Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 扇貝裙邊酶解物的制備 將扇貝裙邊流水解凍后，在料液比為 1∶3(g∶mL)、木瓜蛋白酶為2%、pH為7.0、酶解溫度為60 ℃的條件下酶解1 h，于95 ℃沸水中滅酶10 min，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH至7.0，以9000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min，取上清液冷凍干燥后即為扇貝裙邊酶解物。

1.2.2 ACE抑制活性的色譜條件與測定 采用大連依利特Hypersil BDS C18色譜柱，檢測波長為228 nm，流動相流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為30 μL。

RP-HPLC系統(tǒng)流動相的配制： 300 mL甲醇中加入0.5 mL冰醋酸和1 mL三氟乙酸(TFA)，用蒸餾水稀釋定容至1000 mL后，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至3.3。

底物(HHL)的配制：用含有608 mmol/L NaCl的0.2 mol/L硼酸鹽緩沖液(pH 8.3)，將底物Hip-His-Leu配制成7.6 mmol/L的溶液。

在0.5 mL的Eppendof管中分別加入5 μL扇貝裙邊酶解物(5 mg/mL)和15 μL ACE(60 mU/mL)，置于37 ℃下保溫5 min后，再加入25 μL HHL(7.6 mmol/L)在37 ℃下反應(yīng)25 min，加入5 μL 0.1% TFA溶液終止反應(yīng)，冷卻至室溫，經(jīng)孔徑為0.22 mm的醋酸纖維膜過濾后，采用RP-HPLC定量ACE與底物反應(yīng)生成馬尿酸的量，來判斷ACE抑制活性。ACE抑制率計算公式為

ACE抑制率=(對照馬尿酸峰面積-樣品馬尿酸峰面積) / 對照馬尿酸峰面積×100%。

1.2.3 Sephadex LH-20凝膠層析 扇貝裙邊酶解產(chǎn)物采用Sephadex LH-20層析柱進(jìn)行分離，流動相為30%的甲醇溶液，流速為0.6 mL/min，樣品濃度為0.5 g/mL，上樣體積為10 mL，檢測波長為280 nm，自動收集器以10 min/管的速度收集樣品。

1.2.4 RP-HPLC分離純化 將ACE抑制活性高的組分凍干收集，經(jīng)反相高效液相色譜分離純化。第一次RP-HPLC分離樣品質(zhì)量濃度為5 mg/mL，上樣量為20L，色譜柱為Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為含有0.1% TFA的20%乙腈，流速為1 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為215 nm，多次收集分離組分，凍干后進(jìn)行ACE抑制活性檢測。第二次RP-HPLC分離條件中，除流動相為含有0.1% TFA的10%乙腈外，其余條件與第一次均相同。

1.2.5 ESI MS/MS鑒定 ESI MS/MS條件：采用電噴霧正離子掃描模式，質(zhì)量掃描范圍(質(zhì)荷比 m/z)為 100～1500，分辨率為 70 000；選擇其中強(qiáng)度較高的5個母離子峰采用高能碰撞誘導(dǎo)解離(HCD)的方式碎裂母離子，同時在靜電場軌道阱(Orbitrap)內(nèi)進(jìn)行二級MS/MS 碎片離子掃描分析，其分辨率為 17 500。其中，一級譜的自動增益控制(AGC)為 3e6，最大離子注射時間設(shè)置為 100 ms，動態(tài)排除時間為10 s；二級譜的自動增益控制(AGC)為 5e5，最大離子注射時間設(shè)置為 120 ms。系統(tǒng)的操作和數(shù)據(jù)的采集都使用Xcalibur 2.1軟件(Thermo 公司)完成。

1.2.6 動物試驗樣品的制備與分組 將扇貝裙邊酶解液通過截留相對分子量3000的超濾膜，獲得相對分子量范圍為3000以下(含上述ACE抑制肽)的酶解液組分，冷凍干燥后，進(jìn)行動物試驗。

試驗用雄性原發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously hypertensive rats,SHR)購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，SPF級，體質(zhì)量為240～280 g，12周齡，心臟收縮血壓(Systolic blood pressure,SBP)均高于180 mmHg。SHR適應(yīng)環(huán)境3 d后，隨機(jī)分成空白對照組、陽性對照組(卡托普利)和酶解物組(表1)，采用灌胃法進(jìn)行試驗。

動物飼養(yǎng)條件：SHR飼養(yǎng)房間要保持SPF級，12/12 h明暗室，溫度為(23±2)℃，自由攝食且飲水，每5 d更換一次墊料，每天早8:00—9:00和晚20:00—21:00，各灌胃一次，灌胃28 d后，持續(xù)觀察7 d SHR的心臟收縮壓變化。

表1 試驗動物分組Tab.1 Grouping of the test animals

1.2.7 心臟收縮血壓(SBP)的測定 采用尾套法測定SHR的心臟收縮壓。每天上午灌胃結(jié)束后，開始檢測SHR的尾部動脈心臟收縮壓。檢測血壓前，先將固定籠子預(yù)熱到37 ℃，再將SHR固定在尾部測壓儀上，分別在第0、1、3、5、9、14、23、26、28、30、32、35天時測定SHR的心臟收縮壓，對每只SHR測定3次，取其平均值，整個飼養(yǎng)過程中記錄其體質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sephadex LH-20層析柱對酶解產(chǎn)物的分離

如圖1所示，扇貝裙邊酶解產(chǎn)物通過Sephadex LH-20層析柱分離，得到7個組分峰(F1～F7)，對Sephadex LH-20分離的組分每隔一管測ACE抑制活性，發(fā)現(xiàn)組分峰F5、F6、F7具有ACE抑制活性，ACE抑制活性在70%以上。

對其半抑制濃度(IC50)進(jìn)行測定，結(jié)果如表2所示，F(xiàn)5、F6、F7的IC50值分別為1.4、2.3、1.7 mg/mL。因此，對F5、F6、F7進(jìn)行進(jìn)一步分離。

圖1 扇貝裙邊酶解物經(jīng)Sephadex LH-20層析柱分離及ACE活性測定的結(jié)果Fig.1 Separation of scallop soft part excluding adductor hydrolyzate by Sephadex LH-20 and ACE activity determination

表2SephadexLH-20分離組分的IC50值

Tab.2IC50valuesofcomponentsseparatedbySephadexLH-20

峰號peak相關(guān)指數(shù)R2半抑制濃度IC50/(mg·mL-1)F50.991.4F60.992.3F70.991.7

2.2 RP-HPLC對活性組分的純化

將Sephadex LH-20層析柱分離得到的具有ACE抑制活性的F5、F6、F7組分，通過RP-HPLC C18分離，結(jié)果如圖2所示。經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)5-3、F7-4有ACE抑制活性。

圖2 具有ACE抑制活性組分的RP-HPLC圖譜Fig.2 RP-HPLC analysis of ACE inhibitory components

對圖2所得F5-3、F7-4組分通過RP-HPLC(10%乙腈)進(jìn)一步純化，結(jié)果如圖3所示。其中F5-3、F7-4中僅有F5-3-3、F7-4-3經(jīng)檢測有ACE 抑制活性，根據(jù)出峰時間相同推測，F(xiàn)5-3-3和F7-4-3有可能含有同種序列的ACE 抑制肽，因此,僅對F5-3-3組分進(jìn)行質(zhì)譜分析。

圖3 F5-3和F7-4 組分RP-HPLC圖譜Fig.3 RP-HPLC analysis of F5-3 and F7-4 portions

2.3 ACE抑制肽的ESI MS/MS鑒定

F5-3-3經(jīng)一級質(zhì)譜圖(圖4)和二級質(zhì)譜(圖5)鑒定獲得多肽序列，根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果和肽段序列可信度及構(gòu)效關(guān)系篩選出一個二肽，相對分子質(zhì)量為304.17，氨基酸序列為Val-Trp(VW)。經(jīng)合成后測定其ACE活性，相關(guān)指數(shù)R2為0.99,IC50為86.9 μmol/L。

圖4 F5-3-3組分的一級質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectrum of F5-3-3 portion

2.4 動物試驗

2.4.1 SHR體質(zhì)量的變化 如圖6所示，空白組、陽性對照組、扇貝裙邊酶解物組3組SHR的體質(zhì)量隨時間的變化均有所增加，其中，扇貝裙邊酶解物組體質(zhì)量增加最多，在第28天停止灌胃后取試驗鼠血液進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測，可能導(dǎo)致3組SHR的體質(zhì)量一定程度地下降，而后體質(zhì)量又繼續(xù)增加。

試驗過程中，SHR正處于生長期，其體質(zhì)量隨時間延長而增加。然而，不同給藥組SHR的體質(zhì)量變化存在著較大的差別。如表3所示，空白對照組在第28天時體質(zhì)量增加了(17±9)g，陽性對照組增加了(9±5)g，酶解物組增加了(22±12)g，但各組間均無顯著性差異(P>0.05)。通過對SHR體質(zhì)量的監(jiān)測，說明灌胃的扇貝裙邊酶解物不會損害SHR的正常生長狀態(tài)。

圖5 F5-3-3組分的二級質(zhì)譜圖Fig.5 Tandem mass spectrum of F5-3-3 portion

注：*表示與空白對照組有顯著性差異(P<0.05)Note: *means significant difference compared with the blank control (P<0.05)圖6 雄性原發(fā)性高血壓大鼠的體質(zhì)量隨時間的變化Fig.6 Changes in SHR body weight with time after treatment

表328d中雄性原發(fā)性高血壓大鼠的體質(zhì)量變化

Tab.3ChangesinbodyweightSHRofmalewithin28days

組別groupSHR體質(zhì)量body weight of SHR/g0 d 28 d 差值 difference空白對照blank control 268±11280±1817±9陽性對照positive control 271±8273±129±5酶解物組enzymatic hydrolysate 269±6291±1222±12

2.4.2 SHR心臟收縮壓的變化 從圖7可見：空白對照組SHR的心臟收縮壓在整個檢測中無明顯變化，始終保持在(191±3) mmHg；陽性對照組的心臟收縮壓在28 d中隨時間的延長而逐漸降低，在灌胃5 d時降低到(164±5)mmHg，之后保持恒定并同空白對照組相比一直表現(xiàn)出極顯著性差異(P<0.01)，在第28天時其心臟收縮壓降到了(140±3)mmHg；酶解物組的SBP在28 d中隨時間的延長也逐漸降低，在灌胃9 d時達(dá)到(172±7)mmHg，之后基本保持恒定并同空白對照組相比一直表現(xiàn)出極顯著性差異(P<0.01)，在第28天時其心臟收縮壓降到(161±3) mmHg，與陽性對照組保持著基本相同趨勢，但心臟收縮壓卻一直高于陽性對照組。

停止灌胃后，繼續(xù)跟蹤觀察SHR的心臟收縮壓變化情況。陽性對照組和酶解物組的心臟收縮壓在停止灌胃后隨時間的延長而開始上升，但在持續(xù)觀察的7 d內(nèi)，同空白對照組的心臟收縮壓相比仍都表現(xiàn)出了極顯著性差異(P<0.01)，此結(jié)果與Wang 等[13]研究結(jié)果相似，Wang等將牡蠣蛋白酶解物進(jìn)行長效動物試驗，第28天時心臟收縮壓降低到(158±4)mmHg，而在停藥后第7天時心臟收縮壓上升到(171±8) mmHg。

注：**表示與空白對照組有極顯著性差異(P<0.01)Note: **means very significant difference compared with the control(P<0.01)圖7 雄性原發(fā)性高血壓大鼠的SBP隨時間的變化Fig.7 Changes in SBP of male SHP with time

3 討論

目前，以水產(chǎn)品為原料的ACE抑制肽研究較多，已發(fā)現(xiàn)以大海馬Hippocampusramulosus[14]、刺參體壁Apostichopusjaponicus[15]、沙丁魚Sardinamelamosticta[16]、青柳蛤Mactrachinenesis[17]等為原料，通過酶解手段獲得具有ACE抑制活性的降血壓肽，如海馬蛋白來源的組分PH-I3,其IC50為0.896 mg/mL，該組分具有良好的pH穩(wěn)定性；刺參酶解產(chǎn)物小于相對分子量為3000的組分具有較高的ACE抑制活性，IC50為0.8 mg/mL，對ACE表現(xiàn)為非競爭性抑制。此外，很多學(xué)者對以貝類為原料的ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)鑒定也展開研究。Wang等[13]從牡蠣酶解液中分離純化出VVYPWTORF九肽，其IC50為66mol/L；吳秉宇等[18]也以扇貝裙邊為原料通過酶解制備ACE抑制肽，發(fā)現(xiàn)一個LVIVP五肽具有較強(qiáng)的ACE抑制活性。本研究中從扇貝裙邊中鑒定出VW二肽，IC50為86.9 μmol/L，由于其肽鏈短，在化學(xué)合成制藥過程中具有一定優(yōu)勢。

鑒于ACE抑制肽可能在消化道中被消化酶酶解，其降血壓效果需要通過動物試驗進(jìn)行驗證。目前，以水產(chǎn)品為原料的ACE抑制肽表現(xiàn)為短效的降壓活性，如用刺參ACE抑制肽灌胃SHR 4 h后，心臟收縮壓下降26 mmHg，此后血壓逐漸回升，24 h后與空白組大鼠無顯著性差異[15]；而長效動物試驗多采用含有ACE抑制肽的酶解組分進(jìn)行研究，如沙丁魚酶解產(chǎn)物和青柳蛤酶解產(chǎn)物表現(xiàn)出長效的降壓活性，連續(xù)灌胃28 d，SHR心臟收縮壓均明顯低于對照組大鼠[16-17]。本研究中以扇貝裙邊酶解產(chǎn)物連續(xù)灌胃SHR 28 d后，又繼續(xù)觀察停藥后大鼠的心臟收縮壓情況，結(jié)果表明，停藥7 d內(nèi)，SHR的心臟收縮壓保持穩(wěn)定，顯著低于空白對照，說明以扇貝裙邊為原料的ACE抑制肽降壓效果良好，并在停藥后仍表現(xiàn)出降壓持效性，因此，以扇貝裙邊酶解產(chǎn)物開發(fā)降壓藥物或降壓保健食品具有一定的優(yōu)越性。此外，對扇貝裙邊酶解產(chǎn)物的降壓機(jī)制進(jìn)行分析時發(fā)現(xiàn)，給SHR灌胃后，能引起RAS系統(tǒng)中如ACE、AngⅡ(血管緊張素Ⅱ)、ATG(血管緊張素原酶)、ALD(醛固酮)等相關(guān)指標(biāo)下降(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)，結(jié)果與鬼針草水提物[19]、牡蠣配伍葛根[20]、水解酪蛋白肽粉[21]等成分的降血壓機(jī)制類似，進(jìn)一步說明扇貝裙邊酶解產(chǎn)物是開發(fā)降壓藥物或保健食品的良好原料。

綜上所述，扇貝裙邊酶解產(chǎn)物具有良好的降血壓效果，扇貝裙邊資源豐富、價格低廉，可作為開發(fā)降血壓肽的良好原料，對其進(jìn)行開發(fā)利用,能極大地提高扇貝裙邊附加值，具有廣闊的應(yīng)用前景。