，，，

(1.蘇州檢驗檢疫局綜合技術(shù)中心，江蘇 蘇州 215104； 2.蘇州華博日化品檢測服務(wù)有限公司，江蘇 蘇州 215104)

由于水產(chǎn)品種分布的多樣性, 鮮活水產(chǎn)品跨地區(qū)、長時間運輸已成為常態(tài)[1]。因此，在長途運輸中對水產(chǎn)品進(jìn)行有效?；罹惋@得非常重要[2]，在水產(chǎn)品運輸中使用麻醉劑可以降低魚類的耗氧量和氨氮排放量，可有效防止其在運輸時激烈活動造成的傷害，從而增加運輸距離和運輸量，提高其存活率[3]。常用的漁用麻醉劑主要有MS-222、丁香酚類化合物、二氧化碳等[4]。其中，丁香酚以其高效、低價、代謝快的特點，受到廣泛關(guān)注，但其對肝細(xì)胞具有一定毒性。目前，關(guān)于丁香酚對人體的危害及作為漁用麻醉劑的安全性在國際上仍具有一定的爭議，日本、韓國、澳大利亞、新西蘭、智利等國認(rèn)定丁香酚是合法的漁用麻醉劑[5]。MS-222作為水生動物麻醉劑具有易處理、效力迅速、安全性高等特性[6-8]，是美國FDA批準(zhǔn)在指定種類水產(chǎn)品中使用的麻醉劑[9-11]，但要經(jīng)過21 d停藥期才能上市銷售。

目前, 中國對丁香酚類、MS-222等麻醉劑在水產(chǎn)品中的使用并未制定相關(guān)的政策法規(guī)和限量標(biāo)準(zhǔn)。因為監(jiān)管制度的滯后，國內(nèi)現(xiàn)缺乏對魚用麻醉劑使用安全性的權(quán)威判定，如不及時加以引導(dǎo)和監(jiān)管，可能會越來越多地引起公眾對魚用麻醉劑安全性的擔(dān)憂和恐慌，同時也不利于漁業(yè)經(jīng)濟(jì)的健康發(fā)展。但現(xiàn)有方法僅針對單一種類麻醉劑，且方法檢出線較高，基質(zhì)干擾較嚴(yán)重，因此，需開發(fā)制定快速、高效且適合中國國情的檢測方法。本研究中，利用三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，建立了能同時檢測水產(chǎn)品中7種麻醉劑的前處理方法和高靈敏度、抗基質(zhì)干擾、高準(zhǔn)確性和高穩(wěn)定性的三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀(GC-MS/MS)檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗儀器：氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀(Agilent公司)、氮吹儀(Organomation公司)、渦旋混合器(IKA公司)、超純水器(Milliporeco公司)、離心機(jī)(湘儀公司)和電子天平(METTLER公司)。

試驗試劑：丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品(Dr.Ehrenstorfer公司)，乙酸丁香酚酯、甲基異丁香酚、三卡因標(biāo)準(zhǔn)品(CNW公司)，乙酸異丁香酚酯標(biāo)準(zhǔn)品(Chroma Dex公司)，3-氨基苯甲酸甲酯內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品(TCI公司)，丁子香酚-D3內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品(Accu Standard公司)、Silica 500 mg/6 cc、PRiME HLB 200 mg/6 cc、HLB 500 mg/6 cc、MCX 60 mg/3 cc固相萃取柱(Waters公司)，Dispersive SPE(Agilent公司，15 mL)，Cleanert MAS-Q(迪馬公司)；乙腈、正己烷、乙酸乙酯和丙酮為色譜純，無水硫酸鈉為分析純(經(jīng)550 ℃干燥4 h)，所有用水均為超純水。

1.2 方法

1.2.1 試驗溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(1 mg/mL)：準(zhǔn)確稱取丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚、三卡因、甲基異丁香酚、乙酸丁香酚酯、乙酸異丁香酚酯、丁香酚-D3、3-氨基苯甲酸甲酯7種標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，分別用乙腈溶解后定容至10 mL，配制成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，置于冰箱(-18 ℃)中冷藏保存。

標(biāo)準(zhǔn)稀釋溶液(10.0 μg/mL)：準(zhǔn)確吸取7種麻醉劑標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液各100 μL，用乙腈定容至10 mL，配制成10.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)稀釋溶液，置于冰箱(4 ℃)中冷藏保存。

內(nèi)標(biāo)稀釋溶液(10.0 μg/mL)：準(zhǔn)確吸取兩種麻醉劑內(nèi)標(biāo)儲備溶液各100 μL，用乙腈定容至10 mL，配制成10.0 μg/mL內(nèi)標(biāo)稀釋溶液，置于冰箱(4 ℃)中冷藏保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取適量的標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，用乙酸乙酯與乙腈的混合液(體積比為3∶2)稀釋，使標(biāo)準(zhǔn)品終濃度為1、5、10、25、50、75、100 μg/L，內(nèi)標(biāo)濃度均為10.0 μg/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 前處理方法 參照GB/T 30891—2014采樣方法[12]，稱取5.00 g樣品，置于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入1 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，再依次加入5 g無水硫酸鈉、10 mL正己烷及兩粒陶瓷均質(zhì)子，渦旋混勻1 min，超聲提取15 min，以8000 r/min離心5 min，取上清液至干凈離心管中，殘渣用5 mL正己烷重復(fù)提取1次，合并上清液，待固相萃取凈化。

將樣品提取液全部加入硅膠柱(6 mL正己烷活化)中，控制流速小于0.5 mL/min，用2 mL正己烷淋洗，抽干后加8 mL乙酸乙酯洗脫，收集液體在低于45 ℃條件下，用氮氣吹至3 mL，然后用乙腈定容至5 mL，渦旋混合1 min，過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，濾液供GC-MS/MS測定。

1.2.3 儀器條件

GC條件：載氣為高純氦氣(99.9995%)，恒流流速為1.5 mL/min；進(jìn)樣口溫度為280 ℃,傳輸線溫度為260 ℃；升溫程序為初始溫度為80 ℃, 保持0.5 min，然后以8 ℃/min升至152 ℃，保持0 min，再以2 ℃/min升至160 ℃, 并保持0 min, 最后以60 ℃/min升至270 ℃，保持4 min；進(jìn)樣方式為不分流，進(jìn)樣體積為1.0 μL；色譜柱為HP-5MS UI毛細(xì)管柱(30 m×0.320 mm×0.25 μm)。

MS-MS條件：離子源為EI源，離子源溫度為230 ℃；離子化能量為70 eV；溶劑延遲為5.0 min；四級桿溫度為150 ℃；淬滅氣為高純氦氣，2.25 mL/min；碰撞氣(用于MRM)為高純氮氣，1.5 mL/min。

在選定的色譜條件下，通過分析7種麻醉劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的單桿全掃描(MS1 Scan)質(zhì)譜得到每種物質(zhì)的總離子流圖，選擇質(zhì)荷比(m/z)和相對豐度較高的一級碎片為目標(biāo)化合物的母離子，確定保留時間和前級離子；在產(chǎn)物離子掃描(Product Ion)模式下，設(shè)定合適的碰撞電壓，使目標(biāo)物母離子與碰撞氣體(高純氮氣)進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，進(jìn)一步裂解產(chǎn)生碎片離子得到二級質(zhì)譜圖，分別選取豐度較強(qiáng)且基質(zhì)干擾較小的碎片離子作為定量和定性子離子；選擇電子轟擊離子源多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，進(jìn)一步優(yōu)化碰撞能量，使特征碎片離子產(chǎn)生的離子對強(qiáng)度均達(dá)到最大，各目標(biāo)物最佳參數(shù)見表1。

表17種麻醉劑及其內(nèi)標(biāo)的離子監(jiān)測參數(shù)

Tab.1Monitoringparametersofionsandinternalcompoundsin7anesthetics

化合物compound保留時間/minretention time 前級離子質(zhì)荷比precursor ion產(chǎn)物離子質(zhì)荷比product ion碰撞能量/VCE丁香酚 Eugenol7.86164.0131.0*12164.0104.015丁香酚-D3 Eugenol-D37.86167.0131.0*12167.0103.025甲基丁香酚 Methyl eugenol8.56178.0107.0*18178.0147.073-氨基苯甲酸甲酯3-Aminobenzoic acid methyl9.18151.0120.0*12151.092.025異丁香酚 Isoeugenol9.27164.1131.0*12164.1104.115三卡因 MS-22210.34165.0120.0*20165.093.012甲基異丁香酚 Methyl isoeugenol9.98178.1147.18178.1107.1*18乙酸丁香酚酯 Eugenyl acetate10.47206.0164.02164.0149.0*8乙酸異丁香酚酯 Acetisoeugenol12.14206.0148.9*22164.0149.110

注：*為定量離子

Note: *denotes quantitative ions

2 結(jié)果與分析

2.1 總離子流圖

在“1.2.3”節(jié)儀器條件下，魚肉加標(biāo)樣品的總離子流圖如圖1所示，13 min內(nèi)所有目標(biāo)化合物均已出峰，目標(biāo)化合物不僅達(dá)到完全分離，峰形良好，且在目標(biāo)物出峰處無雜質(zhì)干擾。因此，可選擇三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用法。

圖1 MRM模式下魚肉加標(biāo)樣品總離子流圖Fig.1 TIC of derivatives in 7 anesthetic residues in fish by MRM mode

2.2 線性關(guān)系和檢出限、定量限

在“1.2.3”節(jié)儀器條件下，對標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行進(jìn)樣分析，以目標(biāo)物濃度(x)為橫坐標(biāo)，其峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)(表2)，其相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999，說明0～100 μg/L 范圍內(nèi)7種麻醉劑的濃度和峰面積線性關(guān)系良好。

表2 魚肉中7種麻醉劑線性回歸方程及其相關(guān)系數(shù)Tab.2 Linear equations and R2 in 7 anesthetics in fish

依據(jù)定性、定量離子色譜峰的信噪比(S/N)大于3為檢出限(LOD)，以S/N大于10為定量限(LOQ)，確定本方法中7種麻醉劑的檢出限為2.0 μg/kg，定量限為5.0 μg/kg。

2.3 準(zhǔn)確度及精密度

在空白樣品中添加待測物，使之理論含量為5.0、10.0、50.0 μg/kg，經(jīng)上述試驗步驟處理后，對3個水平進(jìn)行回收率測試(表3)，每個濃度平行測定6次，分別考察3 d，以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)計算批內(nèi)和批間精密度。結(jié)果表明，此方法的回收率為73.93%～119.97%，且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差滿足GB/T 27404—2008[13]要求，說明其準(zhǔn)確度和精密度較高，可以滿足日常檢測需求。

2.4 實際樣品分析

用上述方法分別檢測市售鮮活淡水魚、蝦類(包括黑魚、鯽、草魚、河蝦等)和海水魚、蝦、貝、蟹類(包括鱈、黃魚、多寶魚、石斑魚、斑節(jié)蝦、花蛤、梭子蟹等)35個樣品，考察試驗結(jié)果，其中一批草魚、兩批鱈、一批長江回魚、一批金鯧魚和一批千島湖鯽共6批次樣品中檢出丁香酚類麻醉劑，檢出率為17.1%，最高殘留量達(dá)298 μg/kg(長江回魚)；MS-222均未被檢出。

3 討論

3.1 凈化方法的選擇

丁香酚類微溶于水而易溶于有機(jī)溶劑[14]，MS-222易溶于水[15]，兩種類型麻醉劑的理化特性完全不同，同時提取凈化是個難點。本試驗中考察了不同萃取方式，結(jié)果表明，采用HLB小柱凈化后6種丁香酚類化合物均損失嚴(yán)重，MS-222的回收率偏低；6種丁香酚類化合物在MCX小柱的回收率優(yōu)于HLB小柱，但結(jié)果偏低；采用PRiME HLB小柱和硅膠柱處理后，6種丁香酚類化合物回收率可以滿足檢測要求，但是MS-222經(jīng)PRiME HLB小柱處理后損失較大；而采用硅膠柱對所有目標(biāo)物都有較好的保留；此外，嘗試Dispersive SPE和Cleanert MAS-Q兩種不同分散固相萃取方法，回收率均可以滿足要求，但是后期試驗發(fā)現(xiàn)，分散固相萃取方法的凈化效果沒有硅膠柱好，因此，本試驗的前處理采用硅膠柱進(jìn)行富集凈化。

3.2 色譜柱的選擇

參照相關(guān)資料，并考慮方法的通用性，本試驗中選用甲基聚硅氧烷固定相的DB-5MS毛細(xì)管色譜柱，7種麻醉劑在該色譜柱的分離效果如圖2所示，丁香酚、異丁香酚和MS-222出現(xiàn)明顯的拖尾，且化合物出峰時間集中在4 min內(nèi)，分離效果不理想；而改用HP-5MS UI毛細(xì)管柱后，在相同儀器條件下，目標(biāo)物的峰寬均小于0.12 min，拖尾現(xiàn)象得到改善，基線噪音顯著降低，目標(biāo)化合物峰形對稱且其分離度和靈敏度均有所提高。故本試驗中最終采用HP-5MS UI毛細(xì)管柱。

表3 魚肉中7種麻醉劑的回收率和精密度(相對標(biāo)準(zhǔn)偏差)Tab.3 Recoveries and repeatability (RSD) of 7 anesthetics in fish %

圖2 不同色譜柱中7種麻醉劑的色譜圖Fig.2 Chromatograms of 7 anesthetic residues by different columns

3.3 儀器方法的選擇

目前，國內(nèi)已報道的檢測方法中，僅檢測單一種類的丁香酚類化合物[16]，主要有液相色譜法[17-18]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[19]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[20-21]。對于MS-222殘留檢測，較常見的是液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[22-23]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10]。本試驗中采用三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜分析方法，7種目標(biāo)物和兩種內(nèi)標(biāo)在多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下的質(zhì)譜圖見圖3。

本實驗室前期試驗比對了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氣質(zhì)聯(lián)用法和三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用法的檢測效果。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法僅適用于MS-222殘留檢測，而丁香酚類由于揮發(fā)性太強(qiáng)、沸點低，在液質(zhì)上碎片離子較小容易受干擾，檢測結(jié)果不穩(wěn)定。用氣質(zhì)聯(lián)用法能同時分析7種麻醉劑，但檢出限較高，基質(zhì)干擾明顯。丁香酚和其同位素內(nèi)標(biāo)丁香酚-D3打碎后得到了相同特征碎片離子，由于保留時間相同，在氣質(zhì)中無法區(qū)分，而在三重四級桿氣質(zhì)中，兩物質(zhì)的前級離子不同，即使其產(chǎn)物離子和保留時間均一致，也可以完全區(qū)分開；此外，質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用分段多反應(yīng)監(jiān)測模式，根據(jù)目標(biāo)物出峰時間分成4段，縮短掃描所需的循環(huán)時間，使每個峰上得到的數(shù)據(jù)點數(shù)增多，大大提高了分析通量，確保了結(jié)果的穩(wěn)定性和靈敏度，7種麻醉劑檢出限均可達(dá)到2 μg/kg，而使用普通氣質(zhì)聯(lián)用法時丁香酚檢出限為5 μg/kg[24]。

◆表示前級離子；△▲表示產(chǎn)物離子Note:◆，precursor ion；△▲，product ion圖3 MRM模式下7種麻醉劑及其內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrum of 7 anesthetic residues and internal compounds by MRM mode

4 結(jié)論

本試驗中基于氣相色譜聯(lián)用三重四級桿質(zhì)譜分析技術(shù)，建立的GC-MS/MS檢測方法，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式，根據(jù)保留時間、特征離子及其豐度對比，可對魚蝦等水產(chǎn)品中7種麻醉劑同時進(jìn)行篩選、定量和確證，具有靈敏度高、抗基質(zhì)干擾、高準(zhǔn)確性和高穩(wěn)定性的特點，能滿足水產(chǎn)品中丁香酚類和MS-222麻醉劑殘留量的檢測要求，對保障消費者的健康，維護(hù)中國水產(chǎn)品的正常進(jìn)出口貿(mào)易具有一定的意義。