，，，，，，、

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118； 2.吉林省水產(chǎn)技術(shù)推廣站，吉林 長(zhǎng)春 130012；3.通化師范學(xué)院，吉林 通化 134000)

氧化應(yīng)激是指機(jī)體活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平過(guò)高，超出了抗氧化防御系統(tǒng)的清除能力，導(dǎo)致機(jī)體氧化物與抗氧化物不平衡的狀態(tài)[1]。ROS主要來(lái)源于細(xì)胞線粒體呼吸鏈的電子泄露[2]。因此，一般能量代謝強(qiáng)度較大，線粒體呼吸作用活躍的組織容易發(fā)生電子泄露，如心肌、骨骼肌、性腺等都是ROS過(guò)量積累的場(chǎng)所[2-3]。氧化應(yīng)激給人類健康和現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的危害。已有研究表明，細(xì)胞高水平的ROS與一些心腦血管疾病、神經(jīng)性疾病，甚至癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，進(jìn)而會(huì)誘發(fā)多種疾病，嚴(yán)重威脅著人類的健康[4-5]；氧化應(yīng)激能夠同時(shí)降低畜禽動(dòng)物的采食量和飼料轉(zhuǎn)化效率，降低動(dòng)物對(duì)疾病的抵抗能力，誘導(dǎo)相關(guān)疾病的發(fā)生[6]。與畜禽動(dòng)物相比，水產(chǎn)動(dòng)物更容易受到氧化應(yīng)激的影響，引發(fā)生長(zhǎng)性能降低、脂肪酸組成改變及抵抗力下降[7-8]。

L-肉堿是一種易溶于水的維生素，其最重要的生理功能是攜帶長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體，促進(jìn)脂肪酸的β-氧化，為機(jī)體提供更多的三磷酸腺苷酶(ATP)[9]。近年來(lái)，L-肉堿的抗氧化功能成為人類醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。對(duì)L-肉堿在養(yǎng)殖動(dòng)物抵抗氧化應(yīng)激方面的研究尚處于起步階段，尤其是在轉(zhuǎn)錄水平上，L-肉堿對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物影響的資料信息缺乏[10]。魚類肌肉組織負(fù)責(zé)完成運(yùn)動(dòng)行為，而性腺則負(fù)責(zé)產(chǎn)生生殖細(xì)胞完成繁殖活動(dòng)，這兩種組織對(duì)能量的需求均較高，線粒體呼吸作用較強(qiáng)，ROS易過(guò)度積累而發(fā)生氧化應(yīng)激。本研究中，在體外條件下，以胖頭鱥肌肉細(xì)胞(Fathead minnow muscle cell line，F(xiàn)HM)和草魚性腺細(xì)胞(Ctenopharyngodonidellusovary cell line，GCO)兩種鯉科魚細(xì)胞為研究對(duì)象，用不同濃度的L-肉堿作用細(xì)胞，探討其對(duì)超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)和谷胱甘肽連接酶(γ-GCS)等抗氧化酶活性及其基因相對(duì)表達(dá)量的影響，旨在為L(zhǎng)-肉堿抗氧化作用機(jī)理的揭示及作為抗氧化劑應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用胖頭鱥肌肉細(xì)胞(FHM)和草魚性腺細(xì)胞(GCO)購(gòu)自天津市水產(chǎn)研究所。

試驗(yàn)試劑：細(xì)胞總RNA提取試劑RNAiso(D9108B)購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；PCR Master mix試劑盒(KT201)購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(4368814)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；SYBR Green 熒光定量PCR試劑盒(600830)購(gòu)自美國(guó)安捷倫科技有限公司；SOD(A001-2-1)、CAT(A007-1-1)、GPX(A005)和γ-GCS(A091-1)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。胎牛血清(16000-044)和M199培養(yǎng)基 (11150-059)均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

試驗(yàn)儀器：梯度PCR儀 (Life Eco)為杭州博日科技有限公司產(chǎn)品，熒光定量PCR儀(StepOne TM)購(gòu)自美國(guó)ABI公司，熒光倒置相差顯微鏡(CKX31-A12PHP)購(gòu)自日本Olympus公司，722型可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自北京鑫潤(rùn)科諾儀器儀表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 經(jīng)復(fù)蘇后的FHM和GCO細(xì)胞在含有10%胎牛血清和M199完全培養(yǎng)基(青霉素100萬(wàn)單位/mL，鏈霉素100萬(wàn)單位/mL)的恒溫培養(yǎng)箱(25 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)，每?jī)商鞊Q液一次，待細(xì)胞單層生長(zhǎng)貼壁率達(dá)到90%時(shí)，分別用0.1%的胰酶消化1 min后，用含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打，置于倒置顯微鏡下觀察均為單個(gè)細(xì)胞后分瓶，按此方法進(jìn)行至3～4代后，選擇長(zhǎng)勢(shì)良好的細(xì)胞進(jìn)行正式試驗(yàn)。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 取長(zhǎng)勢(shì)良好的對(duì)數(shù)期FHM和GCO細(xì)胞，經(jīng)0.1%胰蛋白酶消化后，用完全培養(yǎng)基吹打細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，每種細(xì)胞以接種密度1×106cells/孔分別接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置恒溫培養(yǎng)箱(25 ℃、5% CO2)中貼壁培養(yǎng)24 h。棄舊培養(yǎng)基，用無(wú)血清M199清洗每孔，將每種細(xì)胞分為6組，對(duì)照組不做任何處理，繼續(xù)換新的無(wú)血清M199培養(yǎng)，其余5組分別加入含不同濃度L-肉堿(0.001、0.01、0.1、0.5、1、5 mmol/L)的無(wú)血清M199，每組3個(gè)復(fù)孔，每孔添加2 mL，置恒溫培養(yǎng)箱 (25 ℃、5% CO2) 中繼續(xù)孵育。FHM細(xì)胞孵育6 h，GCO細(xì)胞孵育12 h(兩種細(xì)胞的孵育時(shí)間由預(yù)試驗(yàn)結(jié)果篩選得到)。棄上清液，每孔分別用無(wú)血清M199清洗兩遍后，參考王秋舉等[11-12]的方法進(jìn)行細(xì)胞裂解和總RNA提取。

1.2.3 抗氧化酶活性的測(cè)定 采用羥胺法測(cè)定細(xì)胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性，分別采用可見(jiàn)光法、比色法和微量定磷法測(cè)定過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)和谷胱甘肽連接酶(γ-GCS)活性，具體操作均按照南京建成生物工程研究所試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)及合成 本試驗(yàn)中銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)基因的引物設(shè)計(jì)參考Craig等[13]所設(shè)計(jì)的序列，CAT、GPX、谷胱甘肽連接酶合成亞基(GCLC)和β-actin基因所使用的引物由實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)結(jié)果所得，具體設(shè)計(jì)參考王秋舉等[11-12]所設(shè)計(jì)的序列，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.5 細(xì)胞總RNA的提取 根據(jù)RNAiso試劑盒說(shuō)明書提取FHM和GCO細(xì)胞中總RNA，以紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度和純度(OD260 nm/OD280 nm=1.8～2.0)，細(xì)胞總RNA質(zhì)量采用12 g/L變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 用實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR法檢測(cè)4種抗氧化酶基因的相對(duì)表達(dá)量 用隨機(jī)引物對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，反應(yīng)體系為20 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物儲(chǔ)存在-20 ℃中。采用SYBR Green熒光定量PCR試劑盒和熒光定量?jī)x進(jìn)行熒光定量PCR試驗(yàn)。

目的基因和內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)品分別按102、103、104、105、106、107、108、109梯度稀釋，每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)重復(fù)組，每個(gè)重復(fù)組均取2 μL進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，分析各基因熒光定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。確定目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率差均小于5%后，以2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

熒光定量PCR反應(yīng)體系(20 μL)：ddH2O 6.5 μL，樣本模板cDNA 2 μL，q-PCR Mater mix 10 μL，正、反向引物各0.5 μL，染料0.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 下預(yù)變性30 s；95 ℃下循環(huán)變性10 s，退火50.6 ℃(CuZn-SOD)或56.4 ℃(CAT)或58.3 ℃(GPX)或59.1 ℃(GCLC)或58.3 ℃(β-actin)，72 ℃下延伸30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度 L-肉堿對(duì)FHM和GCO細(xì)胞SOD活性的影響

從表1、表2可見(jiàn)：FHM細(xì)胞中SOD活性呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，GCO細(xì)胞中SOD活性呈現(xiàn)先平穩(wěn)后升高的趨勢(shì)；隨著L-肉堿濃度的逐漸升高(0.001～5 mmol/L)，L-肉堿組FHM細(xì)胞SOD活性除0.001 mmol/L 組外，其余L-肉堿組SOD 活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；GCO細(xì)胞SOD 活性僅5 mmol/L L-肉堿組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其余L-肉堿組與對(duì)照組均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.2 不同濃度L-肉堿對(duì)FHM和GCO細(xì)胞CAT酶活性的影響

L-肉堿的添加對(duì)FHM和GCO細(xì)胞CAT活性的調(diào)節(jié)作用并不完全一致。從表1可見(jiàn)：隨著L-肉堿濃度的增加，F(xiàn)HM細(xì)胞CAT活性逐漸增強(qiáng)；與對(duì)照組相比，除0.001 mmol/L 組外，0.01～5 mmol/L L-肉堿組FHM細(xì)胞CAT活性均顯著高于對(duì)照(P<0.05)。

從表2可見(jiàn)：GCO細(xì)胞CAT活性隨著L-肉堿濃度的增加呈現(xiàn)先平緩后升高的趨勢(shì)；僅5 mmol/L L-肉堿組CAT活性顯著高于其他組(P<0.05)，其余L-肉堿組與對(duì)照組均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.3 不同濃度L-肉堿對(duì)FHM和GCO細(xì)胞GPX活性的影響

從表1可見(jiàn)：隨著L-肉堿濃度的增加，F(xiàn)HM細(xì)胞GPX活性呈現(xiàn)先增強(qiáng)后逐漸減弱的趨勢(shì);僅0.01 mmol/L L-肉堿組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其余L-肉堿組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

從表2可見(jiàn):隨著L-肉堿濃度的逐漸增加，GCO細(xì)胞GPX活性呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)；與對(duì)照組相比，僅5 mmol/L L-肉堿組GPX活性顯著升高(P<0.05)，其余L-肉堿組無(wú)顯著性變化(P>0.05)。

2.4 不同濃度 L-肉堿對(duì)FHM和GCO細(xì)胞γ-GCS活性的影響

從表1可見(jiàn)：隨著L-肉堿添加水平的升高，F(xiàn)HM細(xì)胞γ-GCS活性呈先升高后降低的變化趨勢(shì)；僅0.1 mmol/L與0.5 mmol/L L-肉堿添加組顯著高于對(duì)照組和5 mmol/L組(P<0.05)，其余各組間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

從表2可見(jiàn)：GCO細(xì)胞γ-GCS活性變化呈波動(dòng)變化的趨勢(shì)；僅0.01、0.5、5 mmol/L L-肉堿添加組與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)，且5 mmol/L L-肉堿添加組的γ-GCS活性顯著高于其他各L-肉堿添加組(P<0.05)。

表1 L-肉堿對(duì)FHM細(xì)胞抗氧化酶活性的影響Tab.1 Effects of L-carnitine on activities of antioxidase in FHM cells

注：同列中標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，下同

Note:The means with different letters within the same column are significantly different in the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same column are not significant differences, et sequentia

表2 L-肉堿對(duì)GCO細(xì)胞抗氧化酶活性的影響Tab.2 Effects of L-carnitine on activities of antioxidase in GCO cells

2.5 不同濃度L-肉堿對(duì)FHM和GCO細(xì)胞CuZn-SOD mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

從表3、表4可見(jiàn)：與對(duì)照組相比，隨著L-肉堿濃度的逐漸升高(0.001～5 mmol/L)，兩種細(xì)胞CuZn-SOD mRNA相對(duì)表達(dá)量均呈先升高后降低的趨勢(shì)；所有L-肉堿組FHM細(xì)胞CuZn-SOD mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，僅0.5 mmol/L L-肉堿組CuZn-SOD mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于1 mmol/L L-肉堿組(P<0.05)；濃度為0.001、0.01、0.1 mmol/L L-肉堿組GCO細(xì)胞CuZn-SOD mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而濃度為0.5、1、5 mmol/L的L-肉堿組GCO細(xì)胞CuZn-SOD mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.6 不同濃度L-肉堿對(duì)FHM和GCO細(xì)胞CAT mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

添加不同濃度的L-肉堿對(duì)FHM和GCO細(xì)胞CAT mRNA相對(duì)表達(dá)量的調(diào)節(jié)作用并不完全一致。從表3可見(jiàn)：隨著L-肉堿濃度的增加，F(xiàn)HM細(xì)胞CAT mRNA相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，并逐漸趨于平緩；除0.001 mmol/L與0.1 mmol/L L-肉堿組FHM細(xì)胞CAT mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)外，其余L-肉堿組均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

從表4可見(jiàn)：GCO細(xì)胞CAT mRNA相對(duì)表達(dá)量隨著L-肉堿濃度的增加(0.001～5 mmol/L)呈逐漸升高后緩慢降低趨勢(shì)，所有L-肉堿組均上調(diào)了GCO細(xì)胞CAT mRNA相對(duì)表達(dá)水平；與對(duì)照組相比，僅0.1 mmol/L L-肉堿組顯著升高(P<0.05)，而其余L-肉堿組均與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表3 L-肉堿對(duì)FHM細(xì)胞 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Tab.3 Effects of L-carnitine on relative expression levels of mRNA in FHM cells

表4 L-肉堿對(duì)GCO細(xì)胞 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Tab.4 Effects of L-carnitine on relative expression levels of mRNA in GCO cells

2.7 不同濃度 L-肉堿對(duì)FHM和GCO細(xì)胞GPX mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

添加不同濃度的L-肉堿對(duì)FHM和GCO細(xì)胞GPX mRNA相對(duì)表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用差異較大。從表3可見(jiàn)：L-肉堿孵育6 h時(shí)對(duì)FHM細(xì)胞GPX mRNA相對(duì)表達(dá)量均無(wú)顯著性影響(P>0.05)。

從表4可見(jiàn)：隨著L-肉堿濃度的逐漸增加，GCO細(xì)胞GPX mRNA相對(duì)表達(dá)水平呈先升高后降低的趨勢(shì)，最高值出現(xiàn)在0.5 mmol/L L-肉堿組；與對(duì)照組相比，0.5 mmol/L L-肉堿組GCO細(xì)胞GPX mRNA相對(duì)表達(dá)量達(dá)到顯著水平(P<0.05)，其他L-肉堿組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.8 不同濃度L-肉堿對(duì)FHM和GCO細(xì)胞GCLC mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

從表3、表4可見(jiàn)，隨著L-肉堿添加水平的逐漸升高，F(xiàn)HM和GCO細(xì)胞GCLC mRNA相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)。從表3可見(jiàn)：與對(duì)照組相比，僅0.1 mmol/L L-肉堿組顯著上調(diào)了FHM細(xì)胞的GCLC mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，并顯著高于其他L-肉堿添加組(P<0.05)。

從表4可見(jiàn)：GCO細(xì)胞GCLC mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)與FHM細(xì)胞相似，但其最高值與FHM細(xì)胞不同，GCO細(xì)胞GCLC mRNA相對(duì)表達(dá)量最高值出現(xiàn)在1 mmol/L L-肉堿組；與對(duì)照組相比，L-肉堿添加濃度為0.5～5 mmol/L時(shí)，GCO細(xì)胞GCLC mRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.05)，而L-肉堿添加濃度為0.001～0.1 mmol/L時(shí)，GCO細(xì)胞GCLC mRNA相對(duì)表達(dá)水平雖逐漸升高，但與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

3 討論

3.1 魚類在精養(yǎng)模式下氧化應(yīng)激的發(fā)生與防御

隨著生活水平的不斷提高，人們對(duì)水產(chǎn)品的需求量不斷增加，中國(guó)現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)正朝向集約化、規(guī)?；姆较虬l(fā)展。同時(shí)，養(yǎng)殖環(huán)境中的各種應(yīng)激因子也隨之增加，不同程度地導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物應(yīng)激行為的發(fā)生，而長(zhǎng)期處于不良脅迫下的養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)原有的氧化還原平衡狀態(tài)極易受到破壞，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，進(jìn)一步影響各組織器官功能的正常運(yùn)行，造成抵抗力和生產(chǎn)性能的下降，從而影響其經(jīng)濟(jì)效益?？寡趸δ軐?duì)于魚類的健康疾病起著至關(guān)重要的作用，尤其是在現(xiàn)代化精養(yǎng)模式下，魚類生長(zhǎng)速度雖快，但對(duì)環(huán)境應(yīng)激的抵抗能力卻普遍較弱，易受到氧化損傷而導(dǎo)致疾病的發(fā)生[8,14]。機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)包括抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)兩類，抗氧化酶系統(tǒng)是指SOD、CAT、GPX等酶類，SOD催化ROS超氧陰離子轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2，而CAT和GPX可以將具有強(qiáng)氧化性的H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O，從而解除超氧陰離子對(duì)動(dòng)物體的氧化損傷作用。非酶系統(tǒng)是指存在于細(xì)胞中的天然抗氧化劑，主要包括抗壞血酸、谷胱甘肽、維生素E等[15]，這兩個(gè)系統(tǒng)相互作用、有機(jī)結(jié)合，共同發(fā)揮清除過(guò)多ROS的作用。

3.2 L-肉堿對(duì)動(dòng)物抗氧化系統(tǒng)的影響

對(duì)哺乳動(dòng)物的研究證明，L-肉堿具有明顯的抗氧化功能，可以上調(diào)動(dòng)物的T-SOD、CAT、GPX和γ-GCS等抗氧化酶活性[2,11-12,16]，增加動(dòng)物機(jī)體的抗壞血酸、谷胱甘肽、維生素E等非酶抗氧化物質(zhì)的含量[5,17-18]，維持組織細(xì)胞中含硫氨基酸水平[19]。目前，在基因水平上探討營(yíng)養(yǎng)素對(duì)魚類抗氧化酶基因表達(dá)影響方面的研究較為缺乏。姜維丹[20]研究表明，飼料中適量肌醇的補(bǔ)充能顯著上調(diào)幼建鯉腸道抗氧化酶CuZn-SOD、Mn-SOD、CAT和GPX活性及其基因表達(dá)量，抑制了腸道的氧化損傷，證明了肌醇對(duì)幼建鯉腸道抗氧化功能的積極促進(jìn)作用。Wu等[21]報(bào)道，適當(dāng)水平的鋅能提高鮑魚CuZn-SOD、Mn-SOD和CAT抗氧化酶mRNA表達(dá)量。對(duì)于L-肉堿抗氧化功能的研究，在哺乳動(dòng)物上開展的相對(duì)較早，但在水生動(dòng)物方面的研究尚處于起步階段。王秋舉等[22]對(duì)L-肉堿抗氧化功能進(jìn)行了探索，研究結(jié)果表明，0.1～1 mmol/L L-肉堿能顯著提高魚細(xì)胞抗氧化酶活性，但在對(duì)抗氧化相關(guān)蛋白基因表達(dá)的影響還未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。為此，本研究中以FHM和GCO兩種魚類細(xì)胞為研究對(duì)象，在轉(zhuǎn)錄水平上探討了L-肉堿對(duì)水生動(dòng)物抗氧化功能的影響。結(jié)果表明，適宜濃度的L-肉堿均顯著上調(diào)兩種魚細(xì)胞抗氧化酶基因表達(dá)，這與在哺乳動(dòng)物上的研究結(jié)果具有相似之處，并且L-肉堿的添加濃度與CuZn-SOD和GCLC兩個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。綜上所述，本研究中設(shè)定的0.1～1 mmol/L L-肉堿水平是提高FHM和GCO細(xì)胞抗氧化性的適宜添加量，這一結(jié)果與王秋舉等[22]的研究結(jié)果一致。

3.3 L-肉堿抗氧化功能的機(jī)制研究

L-肉堿對(duì)哺乳動(dòng)物和魚類均展現(xiàn)出明顯的抗氧化功能，能在酶活代謝層面和轉(zhuǎn)錄水平上分別發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，但其機(jī)制尚不清楚。目前，學(xué)術(shù)上對(duì)這一問(wèn)題的揭示逐步傾向Nrf2-ARE(NF-E2-related factor 2/antioxidant response element)信號(hào)通路這條途徑。Nrf2-ARE信號(hào)通路是迄今為止被人們發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞中最為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激防御機(jī)制，該信號(hào)通路的啟動(dòng)意味著細(xì)胞抗氧化能力的增強(qiáng)[23]。核相關(guān)因子-2(Nrf2)在細(xì)胞的抗氧化、脂質(zhì)和鐵等多種代謝途徑中起到重要的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)Nrf2也是調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的最關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子，是Nrf2-ARE信號(hào)通路的中樞調(diào)節(jié)者，在增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化功能進(jìn)而預(yù)防疾病方面起到尤為重要的作用[24-25]。正常狀態(tài)下，Nrf2存在細(xì)胞質(zhì)中，處于鈍化狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到相應(yīng)刺激時(shí)，Nrf2會(huì)移動(dòng)至細(xì)胞核中與抗氧化作用原件(ARE)相結(jié)合，上調(diào)下游抗氧化酶(如SOD、CAT等)和Ⅱ相解毒酶的基因表達(dá)水平，從而提高細(xì)胞酶活力達(dá)到抵抗氧化應(yīng)激的作用[26-27]。對(duì)哺乳動(dòng)物的研究表明，Nrf2能保護(hù)細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激因子對(duì)細(xì)胞的氧化作用。Cao等[28]的研究中，建立了L-肉堿對(duì)Nrf2核轉(zhuǎn)錄因子的聯(lián)系，結(jié)果顯示，L-肉堿能顯著上調(diào)鼠神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核Nrf2蛋白表達(dá)和γ-GCS蛋白的表達(dá)量。已有結(jié)果表明，在一定條件下，L-肉堿能夠激活Nrf2-ARE信號(hào)通路，從而上調(diào)細(xì)胞的抗氧化功能，而L-肉堿的這一功能在魚類上的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，細(xì)胞培養(yǎng)基中添加適宜濃度的L-肉堿作用6 h時(shí)，能明顯提高FHM細(xì)胞CAT和GCLC基因相對(duì)表達(dá)水平；添加適宜濃度的L-肉堿作用12 h時(shí)，能明顯上調(diào)GCO細(xì)胞CuZn-SOD、CAT、GPX和GCLC基因相對(duì)表達(dá)水平。在體外條件下，推薦L-肉堿的適宜添加濃度為0.1～1 mmol/L。