任小青，馬儷珍，儲(chǔ)炬

（1.華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2.天津農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)系，天津 300384；3.天津市農(nóng)產(chǎn)品加工科技創(chuàng)新與成果轉(zhuǎn)化基地，天津 300384）

鯰魚（Catfish）屬鯰形目，鯰科，是古老魚類之一，具有適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖率高等特點(diǎn)，是極為重要的經(jīng)濟(jì)魚類[1]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)以鯰魚為主的淡水漁業(yè)得到了飛速發(fā)展，由天津農(nóng)學(xué)院和天津德仁水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司共同承擔(dān)的“革胡子鯰設(shè)施化高效養(yǎng)殖技術(shù)研究項(xiàng)目”，通過(guò)高密度、集約化養(yǎng)殖，使革胡子鯰單位年產(chǎn)量提高了近40倍[2]。隨著鯰魚產(chǎn)量的增加，鯰魚被加工成不同的產(chǎn)品，在加工過(guò)程中，大量的魚頭、魚骨、魚皮、內(nèi)臟等廢棄物產(chǎn)生，這些下腳料若不加以有效利用，不僅造成極大的浪費(fèi)，而且還會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染[3]。本實(shí)驗(yàn)室以鯰魚加工下腳料魚骨為原料，通過(guò)胃蛋白酶酶解得到了具有抑菌性能的酶解物[4]。在此基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步研究該酶解物的抑菌能力，為實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

鯰魚：天津市德仁水產(chǎn)養(yǎng)殖中心。胃蛋白酶（pH 3.0，活力1.25萬(wàn)U/g）：購(gòu)自天津諾奧酶制劑公司。供試菌種大腸桿菌（E.coli）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）和藤黃微球菌（M.luteus）為天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)系生物工程教研室保存。培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配方：牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，pH 7.2。

電子分析天平（FA1104A）、電子天平（JT3101N）：上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電熱恒溫水浴鍋（WHY-2）：天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；離心機(jī)（TDL-5）：上海安亭科學(xué)儀器廠；冰箱（BCD-241WE/Y）：海爾科技有限公司；滅菌鍋（YX2808）：上海三申醫(yī)療器械有限公司；超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)箱：天津市天宇技術(shù)實(shí)業(yè)有限公司；722型可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鯰魚骨酶解物的制備[4]

將新鮮鯰魚的魚頭、魚骨清洗干凈，進(jìn)行蒸煮、干燥和粉碎處理后以胃蛋白酶進(jìn)行酶解。酶解的工藝條件為：底物濃度0.15 g/mL，加酶量1.97 g/100 g，酶解溫度40℃，酶解時(shí)間4.0 h，pH 3.5。酶解后85℃滅酶10 min，離心20 min（4000 r/min）得上清液，上清液冷凍干燥制得具有抑菌性能的酶解物，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌種的活化培養(yǎng)

將-18℃甘油保藏菌種大腸桿菌（E.coli）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）和藤黃微球菌（M.luteus）按1%接種量接種于液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中或于固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，反復(fù)三次進(jìn)行活化。

1.2.3 瓊脂孔穴擴(kuò)散法測(cè)定抑菌活性

在直徑為9 cm的平皿內(nèi)傾倒15 mL牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基以及調(diào)整好濃度的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各株細(xì)菌，使培養(yǎng)基內(nèi)的細(xì)菌終濃度為106CFU/mL，待其凝固后用無(wú)菌打孔器打直徑為6 mm的孔，孔中加入35 μL骨酶解液，將平皿置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)18 h，測(cè)量其抑菌圈直徑。

1.2.4 最低抑菌濃度的測(cè)定（Minimal Inhibitory Concentration，MIC）

采用瓊脂稀釋法，用融化并保溫在50℃的固體培養(yǎng)基將骨酶解物配成不同濃度，分別為10 mg/mL，8、6、4、2和0，倒平板，待其凝固，吸取0.1 mL培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期濃度為106CFU/mL的菌液，用滅菌涂棒涂布均勻，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并記錄結(jié)果，以與培養(yǎng)基表面無(wú)菌落生長(zhǎng)相對(duì)應(yīng)的最小酶解物濃度為酶解物對(duì)各菌的最低抑菌濃度。以不加酶解物的各菌平板為對(duì)照。

1.2.5 最低殺菌濃度的測(cè)定（Minimal Bactericidal Concentration，MBC）

將1.2.4中大于及等于最低抑菌濃度的培養(yǎng)基表面用無(wú)菌水沖洗，將沖洗液接種到無(wú)酶解物的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，用滅菌涂棒涂布均勻，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以與培養(yǎng)基表面無(wú)菌落生長(zhǎng)相對(duì)應(yīng)的最小酶解物濃度，即為酶解物對(duì)各菌的最低殺菌濃度。

1.2.6 比濁法測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)抑制曲線

稱取一定量的骨酶解物，用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基將其稀釋成為各菌MIC，各菌種接種量均為5%，以不加酶解物的培養(yǎng)基接種作為空白對(duì)照，置于37℃下恒溫振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定其吸光度值，用吸光度值的變化反映濁度的變化，即細(xì)菌數(shù)量的變化。

1.2.7 加熱時(shí)間對(duì)鯰魚骨酶解物抑菌性能的影響

以大腸桿菌為供試菌，將其對(duì)應(yīng)的最低抑菌濃度的酶解物在沸水浴中加熱5、10、15、20、30、60 min，用1.2.3方法檢測(cè)其抑菌活性變化，同時(shí)以未煮沸的最低抑菌濃度的酶解物作對(duì)照。

1.2.8 不同pH對(duì)鯰魚骨酶解物抑菌性能的影響

以大腸桿菌為供試菌，配制緩沖液調(diào)節(jié)最低抑菌濃度的酶解物的pH至5、6、7、8、9，用1.2.3的方法檢測(cè)其抑菌活性變化，同時(shí)以未調(diào)pH的最低抑菌濃度的酶解物作對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 最低抑菌濃度MIC和最低殺菌濃度MBC的測(cè)定

將鯰魚骨酶解物采用瓊脂稀釋法配成10 mg/mL，8，6，4，2和0不同濃度分別測(cè)定其對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌的MIC和MBC。測(cè)定結(jié)果見表1和表2。

表1 鯰魚骨酶解物對(duì)各菌最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定Table 1 Minimal inhibitory concentration（MIC）of enzymatic hydrolysis of catfish bone

表2 鯰魚骨酶解物對(duì)各菌最低殺菌濃度（MBC）的測(cè)定Table 2 Minimal bactericidal concentration（MBC）of enzymatic hydrolysis of catfish bone

從表1和表2可以看出，鯰魚骨酶解物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌均具有很好的抑制作用，其中對(duì)藤黃微球菌抑制作用最強(qiáng)，其MIC和MBC分別是6 mg/mL和8 mg/mL。

2.2 比濁法測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)抑制曲線

以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌為對(duì)象菌，研究鯰魚骨酶解物對(duì)其抑制效果，圖1～圖3分別為骨酶解物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌的生長(zhǎng)抑制曲線圖。

由圖1～圖3可以看出，分別以正常培養(yǎng)的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌為陰性對(duì)照，當(dāng)加入鯰魚骨酶解物后，各菌的生長(zhǎng)曲線均發(fā)生了明顯的變化。這說(shuō)明鯰魚骨酶解物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌均有抑制作用而且抑制作用均發(fā)生在延遲期和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期。

圖1 鯰魚骨酶解物對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis of catfish bone on E.coli growth curve

圖3 鯰魚骨酶解物對(duì)藤黃微球菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis of catfish bone on M.luteus growth curve

2.3 加熱時(shí)間對(duì)鯰魚骨酶解物抑菌性能的影響

將8 mg/mL的鯰魚骨酶解物在沸水浴中加熱5、10、15、20、30、60 min，檢測(cè)其對(duì)大腸桿菌抑制活性變化，結(jié)果見圖4。

圖4 加熱時(shí)間對(duì)鯰魚骨酶解物抑菌性能的影響Fig.4 Effect of heating time on the antibacterial activity of enzymatic hydrolysis of catfish bone

由圖4可以看出，最低抑菌濃度的酶解物在沸水浴中加熱不同時(shí)間后，隨處理溫度的升高，對(duì)大腸桿菌的抑菌活性略有下降，但是整個(gè)曲線的變化過(guò)程較為平緩，抑菌圈直徑與對(duì)照相差不大。這說(shuō)明高溫長(zhǎng)時(shí)間處理對(duì)鯰魚骨酶解物的抑菌活性影響較小，提取物具有較好的熱穩(wěn)定性。

2.4 不同pH對(duì)鯰魚骨酶解物抑菌性能的影響

配制緩沖液調(diào)節(jié)8 mg/mL的鯰魚骨酶解物pH至5、6、7、8、9，檢測(cè)其抑菌活性變化，結(jié)果見圖5。

圖5 pH對(duì)鯰魚骨酶解物抑菌性能的影響Fig.5 Effect of pH on the antibacterial activity of enzymatic hydrolysis of catfish bone

由圖5可以看出，8 mg/mL的鯰魚骨酶解物的抑菌性能受pH影響較大，隨著pH的增大，抑菌性能迅速降低，這可能是由于堿性環(huán)境破壞了鯰魚骨酶解物中抑菌活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鯰魚骨酶解物均能很好的抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌的生長(zhǎng)，其中對(duì)藤黃微球菌抑制作用最強(qiáng)，其MIC和MBC分別是6 mg/mL和8 mg/mL。而且鯰魚骨酶解物的抑菌活性具有較好的熱穩(wěn)定性但隨著pH的增大，抑菌性能迅速降低。

[1]何順昌.革胡子鯰池塘精養(yǎng)高產(chǎn)技術(shù)[J].中國(guó)水產(chǎn)，2009(2):34-35

[2]周潤(rùn)健.新技術(shù)使鯰魚產(chǎn)量提高近40倍 [N].中國(guó)食品質(zhì)量報(bào)，2006-5-23(4)

[3]Yang H,Wang Y,Jiang M,et al.2-step optimization of the extraction and subsequent physical properties of channel catfish（Ictalurus punctatus）skin gelatin[J].Journal of Food Science，2007，72(4):188-195

[4]Ren X,Ma L,Chu J,et al.&An,H.Optimization of enzymatic hydrolysis of channel catfish bones for preparing antibacterial agents[J].Journal of Aquatic Food Product Technology,accepted,in press