，，，，，

(1.天津市晨輝飼料有限公司 天津市水族動物功能性飼料企業(yè)重點實驗室，天津 301800；2.天津農(nóng)學院 水產(chǎn)學院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384)

葉酸和維生素B12(VB12)均屬于B族維生素，是一類具有輔酶功能的水溶性維生素，在動物營養(yǎng)中起著重要作用[1]。葉酸作為一碳基團的供體或受體，其輔酶以四氫葉酸的形式參與許多生化反應，在氨基酸和核苷酸等物質代謝中起著重要的作用[2]。VB12是甲基鈷胺的輔酶，參與體內一碳基團的代謝，與葉酸一起合成甲硫氨酸和膽堿，在生物代謝過程中起到轉甲基的作用[3]。方春林等[4]認為，葉酸和VB12是衡量水產(chǎn)動物營養(yǎng)狀況的指標，魚類體內缺乏葉酸和VB12時，均表現(xiàn)為食欲減退，生長性能低下。趙志勇[5]、吳凡等[6]通過研究發(fā)現(xiàn)，葉酸、VB12均對魚體生長有明顯的促進作用。

黃顙魚Pelteobagrusfulvidraco俗稱黃姑、黃臘丁、嘎魚等，隸屬于鲇形目Siluriformes、鲿科Bagridae、黃顙魚屬Pelteobagrus，廣泛分布于中國各大水系[7]。隨著市場需求的擴大，天然水域中的黃顙魚數(shù)量銳減，多數(shù)通過人工養(yǎng)殖來滿足市場需求[8]。然而，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大和養(yǎng)殖密度的增加，黃顙魚病害頻發(fā)，使其品質大幅降低。黃顙魚病害頻發(fā)主要與自身攝取營養(yǎng)不足、免疫力低下有關。因此，研究黃顙魚的營養(yǎng)免疫有助于提高其免疫功能和抗病能力，推動其養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[9]。葉酸和VB12為黃顙魚健康生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)物質，參與生物體內許多重要反應和重要物質的合成，因魚體自身不能合成葉酸和VB12，只能從飼料中攝取。目前，有關葉酸和VB12對黃顙魚生長、免疫力影響的研究尚未見報道。本試驗中，在飼料中添加不同含量的葉酸和VB12，以探究其對黃顙魚生長及免疫力的影響，旨在為黃顙魚養(yǎng)殖技術的提升提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用黃顙魚購自天津市和來科技有限公司，在天津市晨輝飼料有限公司循環(huán)水養(yǎng)殖實驗室對魚體消毒并暫養(yǎng)一周后，挑選體格健壯、規(guī)格一致的黃顙魚900尾，隨機分為9個試驗組和1個對照組進行試驗，每個試驗組設3個重復，每個重復為30尾魚。

1.2 方法

1.2.1 飼養(yǎng)管理 試驗在藍色塑料周轉箱(58 cm×68 cm×40 cm)中進行,養(yǎng)殖周期為56 d，每天7:00、19:00飼喂兩次，日投喂量為體質量的3%～6%，養(yǎng)殖期間水溫為24～30 ℃，pH為7.5～8.0，溶解氧為7.3～8.0。每天記錄死亡魚數(shù)及投餌量。

1.2.2 試驗飼料的制備 本試驗中以葉酸、VB12為影響因素，葉酸水平為0.15%、0.30%、0.45%，VB12水平為0.05%、0.10%、0.15%，采用雙因素試驗設計中的“3×3因子設計”法，配制成Diet 1、Diet 2、Diet 3、Diet 4、Diet 5、Diet 6、Diet 7、Diet 8、Diet 9共9種飼料，以不添加葉酸和VB12的飼料作為對照組。

表1 試驗飼料組成(風干基礎)Tab.1 Ingredients of the test diets (air-dry basis) w/%

注：1) 預混料為每千克飼料提供：Cu (CuSO4) 3.50 mg，F(xiàn)e (FeSO4) 140 mg，Mn (MnSO4) 15 mg，Zn (ZnSO4) 40 mg，I (KI) 0.50 mg，Se (H2NaOSe) 0.30 mg，Co 0.25 mg，Mg 100 mg，Na 100 mg，VA 6000 IU，VD32000 IU，VB19 mg，VB29 mg，VB545 mg，VB67.50 mg，VC 90 mg，VE 60 mg，VK310 mg，煙酸 45 mg，D-泛酸 30 mg，肌醇 80 mg，膽堿 2000 mg

Note：1) The premix provides the following(per kg of diet)：Cu (CuSO4) 3.50 mg，F(xiàn)e (FeSO4) 140 mg，Mn (MnSO4) 15 mg，Zn (ZnSO4) 40 mg，I (KI) 0.50 mg，Se (H2NaOSe) 0.30 mg，Co 0.25 mg，Mg 100 mg，Na 100 mg，VA 6000 IU，VD32000 IU，VB19 mg，VB29 mg，VB545 mg，VB67.50 mg，VC 90 mg，VE 60 mg，VK310 mg，nicotinic acid 45 mg， D-pantothenic acid 30 mg，inositol 80 mg，and choline 2000 mg

表2試驗飼料營養(yǎng)成分(干物質基礎)

Tab.2 Nutrient levels of the test diets (air-drybasis)w/%

注：飼料營養(yǎng)水平均為實測值

Note：Nutrient levels are measured and expressed as average values

1.2.3 指標測定與計算

(1) 生長指標。養(yǎng)殖試驗結束后，禁食24 h，分別稱取每個重復中黃顙魚的體質量。生長指標計算公式為

增重率(WGR)=100%×(lnWt-lnW0)/W0，

特定生長率(SGR)=100%×(lnWt-lnW0)/t，

飼料系數(shù)(FCR)=F/(Wt-W0)。

其中：Wt、W0分別為試驗終末和初始魚體質量(g)；F為飼料攝入量(干質量，g)；t為試驗時間(d)。

(2) 免疫指標。從每個重復中隨機取5尾魚，用1 mL注射器從尾靜脈取血，后將血液轉移至1.5 mL離心管中，于4 ℃下靜置6 h，以4000 r/min離心10 min，分離血清于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩２裳髮ⅫS顙魚在冰浴條件下進行解剖，剝取肝臟。

黃顙魚血清和肝臟組織中的補體C3、補體C4、一氧化氮(NO)含量、一氧化氮合酶(NOS)活性均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定，試驗操作嚴格按照說明書方法進行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示(mean±S.D.)。采用SPSS 18.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單、雙因子方差分析(ANOVA)，采用Duncan法進行組間多重比較，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 飼料中葉酸、VB12水平對黃顙魚生長性能的影響

從表3可見：各試驗組飼料中葉酸和VB12水平對黃顙魚終末體質量、增重率及特定生長率均有極顯著性影響(P<0.01)，添加葉酸和VB12的試驗組黃顙魚終末體質量、增重率、特定生長率和飼料系數(shù)均顯著優(yōu)于對照組(P<0.05)；二者的交互作用對黃顙魚終末體質量、增重率、特定生長率、飼料系數(shù)均無顯著性影響(P>0.05)。在其中一因素水平固定的情況下，黃顙魚終末體質量、增重率、特定生長率均隨著另一因素水平的增加而增加，飼料系數(shù)有下降趨勢；在葉酸水平為0.15%時，VB12水平變化對黃顙魚生長無顯著性影響(P>0.05)；在葉酸水平為0.30%和0.45%時，隨VB12水平的升高，黃顙魚終末體質量、增重率、特定生長率顯著升高(P<0.05)。當飼料葉酸/VB12水平為0.45%/0.15%時，黃顙魚終末體質量、增重率及特定生長率最高且飼料系數(shù)最低，除與葉酸/VB12水平為0.15%/0.15%、0.30%/0.15%、0.45%/0.10%無顯著性差異(P>0.05)外，均顯著高于其他組(P<0.05)。

表3飼料中葉酸和VB12水平對黃顙魚生長指標的影響

Tab.3EffectsofdietaryfolicacidandvitaminB12levelsonthegrowthperformanceofyellowcatfishPelteobagrusfulvidraco

組別group葉酸/%folic acidVB12/%vitamin B12終末體質量/gfinal body weight增重率/%weight gain rate特定生長率/(%·d-1)specific growth rate飼料系數(shù)food conversion ratioDiet 10.150.0555.67±1.44c75.04±4.15c1.00±0.04c3.04±0.03bDiet 20.150.1057.93±1.51bc80.48±4.62bc1.05±0.04bc2.99±0.12bcDiet 30.150.1560.64±0.91abc92.16±3.95abc1.17±0.04abc2.65±0.06dDiet 40.300.0556.53±1.17c77.77±3.69c1.03±0.01bc3.03±0.03bDiet 50.300.1059.40±0.50bc86.21±1.77bc1.11±0.02abc2.79±0.04bcdDiet 60.300.1563.42±1.61ab99.41±4.57ab1.23±0.04ab2.74±0.05cdDiet 70.450.0558.53±1.17bc84.10±4.29bc1.09±0.04bc2.95±0.03bcDiet 80.450.1061.49±1.78abc93.87±6.84abc1.18±0.06abc2.78±0.02bcdDiet 90.450.1566.92±0.89a108.67±2.06a1.31±0.02a2.66±0.08d對照control44.51±1.30d38.95±6.39d0.59±0.05d3.37±0.01a兩因素主效應檢驗 main effect test of the two factors0.1558.081b82.559b1.073b2.894a0.3059.783ab87.799ab1.123ab2.857a0.4562.314a95.544a1.194a2.799a0.0559.910c78.969b1.038b3.011a0.1059.609b86.852b1.114b2.856b0.1563.660a100.081a1.237a2.683c雙因子方差分析(P值) Two-way ANVOA(P Value)葉酸 folic acid0.003**0.005**0.006**0.161VB120.000**0.000**0.000**0.000**葉酸×VB120.7360.9350.9660.197

注：同列中標有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)；*表示有顯著性影響(P<0.05),**表示有極顯著性影響(P<0.01)，下同

Note:The means with different letters within the same column are significantly different among the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same column are not significant differences;*means significant effect(P<0.05)，** means very significant effect(P<0.01), et sequentia

因素水平效應檢測表明：飼料中添加葉酸的最優(yōu)水平為0.45%，在此水平下，黃顙魚的終末體質量、增重率、特定生長率均最高，且與0.15%葉酸水平組有顯著性差異(P<0.05)，對黃顙魚飼料系數(shù)影響不顯著(P>0.05)；飼料中添加VB12的最優(yōu)水平為0.15%，在此水平下，黃顙魚的各項生長指標均最好，且顯著好于其他VB12水平組(P<0.05)。

2.2 飼料中葉酸和VB12水平對黃顙魚血清中補體C3、補體C4含量的影響

從表4可見：葉酸、VB12各水平及其交互作用對黃顙魚血清中補體C3、補體C4含量均無顯著性影響(P>0.05);葉酸/VB12水平為0.45%/0.15%時，黃顙魚血清中補體C3、補體C4含量最高，對照組含量最低，各試驗組間無顯著性差異(P>0.05)。

表4飼料中葉酸和VB12水平對黃顙魚血清中補體C3、補體C4含量的影響

Tab.4EffectsofdietaryfolicacidandvitaminB12levelsonserumcomplementC3andcomplementC4contentsofyellowcatfishPelteobagrusfulvidraco

組別 group葉酸/% folic acid VB12/%vitamin B12補體/(mg·dL-1)complement C3補體/(mg·dL-1) complement C4Diet 10.150.055.95±0.213.26±0.20Diet 20.150.106.05±0.383.14±0.14Diet 30.150.157.15±.0153.47±0.29Diet 40.300.056.12±0.613.12±0.12Diet 50.300.106.33±0.313.50±0.46Diet 60.300.156.23±0.442.93±0.29Diet 70.450.056.44±0.113.41±0.26Diet 80.450.107.03±0.123.02±0.71Diet 90.450.157.35±0.403.87±0.15對照 control5.87±0.342.86±0.14兩因素主效應檢驗 main effect test of the two factors0.156.3833.2900.306.2273.1810.456.9383.4320.056.1683.4170.106.5763.2170.156.8043.270雙因子方差分析(P值) Two-way ANVOA (P value)葉酸 folic acid0.0520.476VB120.1090.601葉酸×VB120.2270.117

2.3 飼料中葉酸和VB12水平對黃顙魚肝臟補體C3、補體C4含量的影響

從表5可見：葉酸、VB12各水平及其交互作用對黃顙魚肝臟補體C3、補體C4含量無顯著性影響(P>0.05)；葉酸/VB12水平為0.45%/0.15%時，黃顙魚肝臟補體C3、補體C4含量最高，對照組含量較低，各試驗組間無顯著性差異(P>0.05)。

表5飼料中葉酸和VB12水平對黃顙魚肝臟中補體C3、補體C4含量的影響

Tab.5EffectsofdietaryfolicacidandvitaminB12levelsonlivercomplementC3andcomplementC4contentsofyellowcatfishPelteobagrusfulvidraco

組別 group葉酸/%folic acidVB12/%vitamin B12補體 /(mg·mg-1 prot)complement C3補體/(mg·mg-1 prot)complement C4Diet 10.150.0578.53±4.1027.76±2.64Diet 20.150.1082.25±1.8725.76±1.27Diet 30.150.1584.14±2.2628.37±1.09Diet 40.300.0584.19±1.5326.91±2.13Diet 50.300.1079.49±0.7527.03±1.57Diet 60.300.1580.65±2.5728.16±2.51Diet 70.450.0581.33±0.9024.28±1.28Diet 80.450.1081.41±2.7225.35±2.25Diet 90.450.1586.57±1.5028.89±2.30對照 control 79.97±1.5320.81±0.75兩因素主效應檢驗 main effect test of the two factors0.1583.52827.6770.3082.23427.3700.4580.42325.9740.0584.02926.6940.1081.04726.0500.1581.11028.097雙因子方差分析(P值) Two-way ANVOA (P value)葉酸 folic acid0.3200.471VB120.2600.447葉酸×VB120.5420.801

2.4 飼料中葉酸和VB12水平對黃顙魚血清中免疫指標的影響

從表6可見：飼料中葉酸和VB12水平對黃顙魚血清中NO含量、NOS活性均有極顯著性影響(P<0.01)，二者的交互作用對黃顙魚血清中NO含量、NOS活性無顯著性影響(P>0.05)；在VB12添加水平固定的情況下，0.45%葉酸水平試驗組黃顙魚NO含量及NOS活性均顯著高于0.15%組(P<0.05)；在葉酸/VB12水平為0.45%/0.15%時，NO含量、NOS活性均達到最高。因素水平效應檢測表明：葉酸各水平間黃顙魚血清中NO含量有顯著性差異(P<0.05)，0.30%、0.45%葉酸水平組NOS活性顯著高于0.15%水平組(P<0.05)，最優(yōu)水平為0.45%；VB12各水平間黃顙魚血清中NO含量有顯著性差異(P<0.05)，0.10%、0.15% VB12水平組NOS活性顯著高于0.05%水平組(P<0.05)，最優(yōu)水平為0.15%。

表6飼料中葉酸和VB12水平對黃顙魚血清中NO、NOS的影響

Tab.6EffectsofdietaryfolicacidandvitaminB12levelsonserumNOcontentandNOSactivityofyellowcatfishPelteobagrusfulvidraco

組別 group葉酸/%folic acidVB12/% vitamin B12NO/(μmoL·L-1)NOS/(U·mL-1)Diet 10.150.054.01±0.05c8.14±0.05bDiet 20.150.104.12±0.12c8.19±0.22bDiet 30.150.154.30±0.09c8.26±0.15abDiet 40.300.054.41±0.13bc8.22±0.23abDiet 50.300.104.46±0.09bc8.69±0.47abDiet 60.300.154.93±0.20ab9.20±0.23abDiet 70.450.054.95±0.09ab9.22±0.13abDiet 80.450.105.20±0.10a9.47±0.17aDiet 90.450.155.41±0.10a9.48±0.30a對照 control 3.33±0.18d6.78±0.32c兩因素主效應檢驗 main effect test of the two factors0.154.147c5.543b0.304.601b6.051a0.455.189a6.241a0.054.459c5.646b0.104.595b6.006a0.154.883a6.184a雙因子方差分析(P值) Two-way ANVOA (P value)葉酸 Folic acid0.000**0.000**VB120.001**0.001**葉酸×VB120.6350.129

2.5 飼料中葉酸和VB12水平對黃顙魚肝臟免疫指標的影響

從表7可見：飼料中葉酸和VB12水平對黃顙魚肝臟中NO含量均有極顯著性影響(P<0.01)，二者的交互作用對黃顙魚血清中NO含量、NOS活性均無顯著性影響(P>0.05)；在VB12添加水平固定的情況下，0.45%葉酸水平組NO含量及NOS活性均高于0.15%組；在葉酸/VB12水平為0.45%/0.15%時，NO含量、NOS活性均達到最高。因素水平效應檢測表明：葉酸0.45%水平組黃顙魚血清中NO含量和NOS活性含量顯著高于0.15%水平組(P<0.05)，最優(yōu)水平為0.45%；0.15% VB12水平組黃顙魚血清中NO含量顯著高于0.05%水平組(P<0.05)， VB12各水平組NOS活性無顯著性差異(P>0.05)，最優(yōu)水平為0.15%。

表7飼料中葉酸和VB12水平對黃顙魚肝臟組織NO、NOS的影響

Tab.7EffectsofdietaryfolicacidandvitaminB12levelsonliverNOcontentandNOSactivityofyellowcatfishPelteobagrusfulvidraco

組別 group葉酸/%folic acidVB12/%vitamin B12NO/(μmoL·g-1 prot)NOS/(U·g-1 prot)Diet 10.150.055.07±0.04c6.31±0.14bcDiet 20.150.105.57±0.06bc6.41±0.10abcDiet 30.150.155.98±0.10ab6.46±0.27abcDiet 40.300.055.93±0.10ab6.53±0.31abcDiet 50.300.106.18±0.17ab6.62±0.32abcDiet 60.300.156.04±0.25ab6.78±0.22abDiet 70.450.055.93±0.17ab6.84±0.18abDiet 80.450.106.26±0.09ab7.02±0.05abDiet 90.450.156.53±0.17a7.45±0.29a對照 control4.89±0.16c5.54±0.13c兩因素主效應檢驗 main effect test of the two factors0.155.543b6.394b0.306.051a6.643ab0.456.241a7.107a0.055.646b6.561a0.106.006a6.686a0.156.184a6.898a雙因子方差分析(P值) Two-way ANVOA (P value)葉酸 folic acid0.000**0.004**VB120.001**0.215葉酸×VB120.1290.864

3 討論

3.1 飼料中葉酸和VB12水平對黃顙魚生長的影響

葉酸和VB12均為機體非常重要的水溶性維生素，二者分別參與機體一碳單位的轉移及代謝，對生物合成和細胞分裂生長具有重要的作用[3,5,10]。趙智勇[5]在研究草魚Ctenopharyngodonidellus魚種葉酸需要量的試驗中發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加3.6～4.3 mg/kg的葉酸可促進草魚的生長，還可提高草魚的飼料利用率。魏建軍等[11]探討葉酸和VB12對中華絨螯蟹Eriocheirsinensis生長、非特異性免疫和免疫力的影響時發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加葉酸和VB12可顯著促進中華絨螯蟹幼蟹的生長，葉酸/VB12的添加水平為2.3/0.2 mg/kg時幼蟹生長最佳。吳凡等[6]研究VB12對草魚幼魚生長的影響時發(fā)現(xiàn)，當飼料中VB12的添加量為0.10 mg/kg時，草魚幼魚的特定增長率和增重率最高。本試驗中通過在飼料中添加葉酸和VB12發(fā)現(xiàn)，葉酸、VB12對黃顙魚的生長均具有顯著性影響。在葉酸/VB12水平為0.45%/0.15%時，黃顙魚的增重率和特定增長率最高，飼料系數(shù)最低，這與上述學者的研究結果基本一致，表明飼料中添加適宜的葉酸和VB12可提高黃顙魚的生長性能，提高飼料利用率。

3.2 飼料中葉酸和VB12水平對黃顙魚組織中補體C3、補體C4含量的影響

目前，魚類抗應激系統(tǒng)如何形成還未見明確報道，但在淋巴器官和免疫能力成熟之前，先天防御機制是至關重要的，而補體系統(tǒng)是非特異性免疫中非常重要的組成部分，參與機體的防御功能，并且可以增強機體在應急條件下維持穩(wěn)態(tài)的能力[12]。目前，有關維生素對黃顙魚體內補體C3、補體C4的影響鮮有報道。Sesay等[13]研究表明，飼料中葉酸含量為2.0、5.0 mg/kg時，武昌魚Megalobramaamblycephala血清中補體C3、補體C4含量得到顯著提升。本試驗中發(fā)現(xiàn)，葉酸和VB12水平對黃顙魚肝臟及血清中補體C3、補體C4含量無顯著性影響，但當葉酸/VB12添加量為0.45%/0.15%時，黃顙魚肝臟及血清中補體C3、補體C4含量最高，這與上述學者的研究結果基本一致，說明葉酸和VB12的添加對提升黃顙魚組織及血清中補體C3、補體C4含量有一定的促進作用。

3.3 飼料中葉酸和VB12水平對黃顙魚組織中NO含量、NOS活性的影響

一氧化氮NO是第一個被發(fā)現(xiàn)的參與體內信號轉導的氣體信號分子[14]，在神經(jīng)、免疫、呼吸等系統(tǒng)中均發(fā)揮著重要作用[15]。NO的生物合成主要受NOS調節(jié)，此外，其還受底物濃度和輔助因子的調節(jié)[16-17]。目前，尚未見有關葉酸和VB12對魚類組織中NO及NOS影響的報道。姜雅秋[18]研究表明，葉酸和VB12可顯著降低Hhcy造成的血管內皮的損傷，使血漿中NO含量上升，NOS活性提高；賈文斌等[19]的試驗表明，給予適當?shù)陌被岷途S生素制劑干預，可明顯減輕力竭疲勞大鼠Rattusnorvegicus骨骼肌的損傷，使保護性物質NO、NOS增高。本試驗結果表明，飼料中添加葉酸和VB12對黃顙魚肝臟組織和血清中的NO含量、NOS活性有顯著性影響，在添加的葉酸/VB12水平為0.45%/0.15%時，肝臟組織和血清中NO含量、NOS活性均達到最高。這與姜雅秋[18]、賈文斌等[19]的研究結果一致，但劉歡[20]研究發(fā)現(xiàn)，葉酸能提高腦缺血大鼠抗氧化能力，使NO含量降低，這種結果的差異可能與試驗對象不同有關。

4 結語

黃顙魚攝食缺乏葉酸和VB12的飼料會表現(xiàn)出生長緩慢、飼料轉化率低等癥狀，在飼料中添加葉酸和VB12可改善黃顙魚的生長性能，提高免疫力。本試驗結果表明，葉酸水平為0.45%、VB12水平為0.10%時，可顯著促進黃顙魚的生長，提高黃顙魚的免疫力，明顯降低飼料成本。