路金金，王曉佳

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193)

豬偽狂犬病病毒(PRV)又稱豬皰疹病毒I型、奧耶斯基氏病毒，具有嗜神經(jīng)組織性，可導(dǎo)致新生仔豬致命性腦炎、生長育肥豬呼吸系統(tǒng)疾病和母豬繁殖障礙，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。PRV作為典型的皰疹病毒，常被用作基因治療、腫瘤治療，以及神經(jīng)元電路示蹤的研究工具或模型。PRV可感染多種動物，除了豬、牛、羊、犬和貓外，還有野生動物和肉食動物也易感染。2018年6月“華山戰(zhàn)狼團(tuán)隊(duì)”暴出了PRV感染人的病例[1]，這震驚了國內(nèi)外學(xué)者。于此同時，趙偉麗等將2016年12月至2017年12月間北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)科的樣品進(jìn)行檢測，確診4例PRV病例，患者均是從事生豬及生豬肉產(chǎn)銷的人員，其腦炎、視網(wǎng)膜炎等癥狀明顯[2]。這提醒我們，PRV已跨越物種屏障而感染人類，對全球公共衛(wèi)生造成嚴(yán)重威脅！人們必須重新認(rèn)識PRV，提高防控意識，在危害擴(kuò)大之前及時遏止該病毒的突變與傳播速度。

流行病學(xué)調(diào)查表明，PRV及其變異株在我國多個省市廣泛出現(xiàn)，且流行區(qū)域有擴(kuò)大的趨勢，給我國豬偽狂犬病的凈化帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。本文從PRV流行病學(xué)、分子致病機(jī)理、疫苗與抗病毒制劑3個方面，將近幾年的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為該疫病的綜合防控提供科學(xué)資料與有效策略。

1 流行病學(xué)

PRV有廣泛的宿主群，然而易感動物中只有豬是PRV的貯存宿主，各階段的豬均可被感染，其中以兩周齡的仔豬癥狀最為嚴(yán)重，死亡率高達(dá)100%。隨年齡的增長，病死率逐漸下降，成年豬常呈隱性感染或潛伏感染，在外周神經(jīng)系統(tǒng)終生攜帶該病毒，并將其傳播給其他動物。PRV可通過呼吸道、消化道、垂直傳播、配種、輸精等途徑直接傳播，也可通過接觸被病豬、帶毒豬或其排瀉物、流產(chǎn)胎兒等污染的用具、飼料、飲水等媒介物間接傳播。不表現(xiàn)明顯臨床癥狀的隱形感染豬是豬場PRV暴發(fā)的重要因素，病豬、康復(fù)帶毒豬和帶毒鼠也是重要傳染源。成熟PRV在感染其自然宿主豬的過程中，首先侵入豬表面黏膜的上皮細(xì)胞，之后進(jìn)入神經(jīng)纖維末梢，最后入侵外周神經(jīng)節(jié)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)[3]。

豬偽狂犬病一年四季均可發(fā)生，較易發(fā)生在寒冷的春冬兩季。1990-2011年間，經(jīng)典疫苗株Bartha-K61(gE基因缺失苗)安全有效地控制了PRV在我國的傳播。2011年下半年出現(xiàn)Bartha-K61株疫苗免疫過的豬群中暴發(fā)偽狂犬病的報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)PRV出現(xiàn)了變異，經(jīng)典疫苗株不能再為其提供完全的保護(hù)，這給我國養(yǎng)豬業(yè)敲響了警鐘。2013-2016年間有學(xué)者在山東省跟蹤了395例臨床案例和收集了5 033份豬血清樣本。經(jīng)檢測395例樣品中110例為PRV gE基因陽性，并從其中分離到了15種PRV變異株；收集的5 033份豬血清樣本中，57.8%呈現(xiàn)PRV gE抗體陽性[4]，這表明PRV變異株在山東省豬場普遍存在。也有學(xué)者分析了2013-2016年間PRV變異株在我國各地繁育豬場的流行情況，發(fā)現(xiàn)PRV變異株陽性率在我國總趨勢是逐漸下降的(從22.17%降至13.14%)，不同地區(qū)間有所差異[5]。PRV血清型單一，不斷出現(xiàn)新的傳播能力和毒性都增強(qiáng)的變異株，毒株間毒力和生物學(xué)特性差異明顯。毋庸置疑，PRV變異問題需要被學(xué)界與業(yè)界充分關(guān)注，各大規(guī)模化豬場對偽狂犬病的控制與凈化做出規(guī)劃。

2 致病機(jī)理

PRV病毒屬于皰疹病毒科，甲型皰疹病毒亞科，水痘病毒屬，病毒呈圓形或橢圓形，直徑為150～180 nm。PRV成熟的病毒顆粒由4種形態(tài)上不同的結(jié)構(gòu)構(gòu)成：包含著病毒線性雙鏈DNA基因組的核仁、包裹著核仁的保護(hù)性二十面體核衣殼、由蛋白質(zhì)基質(zhì)形成的殼皮，以及包裹著殼皮并含有幾種病毒糖蛋白的脂質(zhì)膜構(gòu)成的囊膜[6]。PRV基因組為線性雙鏈DNA，長度約為150 kb，其中G+C平均含量達(dá)74%。2004年Klupp B G等完成了PRV基因組基因序列的測定[7]，極大地推進(jìn)了學(xué)者們對PRV基因及蛋白功能的進(jìn)一步研究。2006年P(guān)omeranz L E 等統(tǒng)計(jì)，PRV基因組由72個閱讀框組成，可編碼70種蛋白質(zhì)[8]。近年來對PRV病毒與宿主細(xì)胞的相互作用研究越加深入，為病毒致病機(jī)制的研究奠下扎實(shí)的基礎(chǔ)。

2.1 基因組US/UL獨(dú)特區(qū)域 皰疹病毒基因組分為6級，用字母A-F表示，PRV基因組同水痘帶狀皰疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)一樣屬于D類，特征在于存在長獨(dú)特(Unique long,UL)與短獨(dú)特(Unique short,US)區(qū)域，其中US區(qū)位于內(nèi)部重復(fù)序列(IRS)和末端反向重復(fù)序列(TRS)兩側(cè)。UL和US線性排列長度分別為110 kb和9 kb，在基因組中與IRS和TRS共同形成UL-IRS-US-TRS的序列。早期的學(xué)者根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)建立了良好的基因組圖譜，將UL內(nèi)不同的基因片段依次命名為UL1-UL54，將US內(nèi)的基因依次命名為US1-US9。

皰疹病毒衣殼的出核由保守的核出口復(fù)合物(Nuclear egress complex,NEC)介導(dǎo)，其由膜錨定的pUL34及其核質(zhì)相互作用配偶體pUL31組成。2014年P(guān)a?vogel L等鑒定出pUL34中兩個天冬酰胺殘基(N75,N103)和一個二亮氨酸基序(LL166 / 167)是維持NEC功能所必需的。pUL34-N75A突變體不能與pUL31相互作用，而pUL34-N103A突變體則失去功能[9]。Zhang R等研究表明pUL50不僅具有dUTP酶活性，還能通過促進(jìn)IFN受體的降解而抑制Ⅰ型干擾素通路，從而有助于PRV逃脫宿主的免疫消除[10]。Zhao H等發(fā)現(xiàn)，pUL56和豬白細(xì)胞抗原1類分子相互作用可導(dǎo)致后者泛素化程度加強(qiáng)，也可能與免疫逃避有關(guān)[11]。Richards A L等發(fā)現(xiàn)，UL37表達(dá)的蛋白表面R2區(qū)有一種神經(jīng)侵襲性效應(yīng)器，該區(qū)域突變會導(dǎo)致PRV失去沿軸突逆向傳播到動物外周神經(jīng)節(jié)的能力[12]。Ye C等構(gòu)建UL41缺失變異株，與野生型相比，該變異株體外的增殖能力和體內(nèi)的神經(jīng)侵襲性均受損[13]。這些發(fā)現(xiàn)為一種新型弱毒活疫苗的研發(fā)提供了方向。

2009年有學(xué)者提出US3表達(dá)蛋白pUS3激酶活性是肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)整所必需的[14]，而pUS3激酶誘導(dǎo)的細(xì)胞骨架重排和細(xì)胞延伸，與病毒向周圍細(xì)胞的擴(kuò)散密切相關(guān)[15]。2015年Jacob T等進(jìn)一步證明，pUS3表達(dá)可導(dǎo)致PKA依賴性RhoA 磷酸化，而這有助于pUS3誘導(dǎo)的肌動蛋白細(xì)胞骨架重排[16]。最近Lyu C等用豬大腦皮層原代培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)US2缺失型PRV，發(fā)現(xiàn)與野生型PRV相比，病毒的滴度反而較高[17]。這為深入了解PRV致病機(jī)理提供新數(shù)據(jù)。

2.2 病毒編碼miRNA 微小RNA(microRNA,miRNA)是一種含22～24個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，主要參與轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控，在所有植物和動物中都表達(dá)，包括DNA病毒。目前發(fā)現(xiàn)的病毒miRNA多來自皰疹病毒，這是由于皰疹病毒基因組較大，單個病毒就能編碼出大量的miRNA(一些成員能表達(dá)超過30種miRNA前體)。這些miRNA通常成簇聚集在皰疹病毒基因組中，存在于潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄物(Latency-associated transcript,LAT)基因座內(nèi)或其附近。研究表明，LAT基因座中miRNA簇的缺失，會影響PRV在豬三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)建立潛伏期后引起的宿主應(yīng)答[18]。最近發(fā)現(xiàn)，miRNA在皰疹病毒的感染中發(fā)揮著基因調(diào)控作用，miRNA簇與PRV病毒的復(fù)制與毒力密切相關(guān)[19]。

2.3 病毒糖蛋白 目前已有11種PRV糖蛋白被報(bào)道，分別為gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM和gN。2011年接種過PRV疫苗的豬群中暴發(fā)了高致病性偽狂犬病病毒變異株ZJ01的感染，其較強(qiáng)的毒力被證明與gE和gI的變異相關(guān)[20]。漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDC)在抗病毒免疫反應(yīng)中起重要作用，這類細(xì)胞能夠產(chǎn)生大量的I型干擾素(TI-IFN)。而Lamote J A等指出gE / gI糖蛋白復(fù)合物等夠抑制pDC產(chǎn)生TI-IFN[21]。Tang Y D等構(gòu)建了病毒基因gE、gI、gG、gN、gM、US2、US9、US3、早期蛋白0(EP0)分別缺失的突變病毒，發(fā)現(xiàn)糖蛋白gM突變體的病毒毒力明顯下降[22]，表明gM對PRV的毒力至關(guān)重要。

PRV病毒入侵過程中，gD介導(dǎo)與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，gH和gL形成異二聚體激活gB，從而促進(jìn)病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜融合。研究表明，gH的N末端多糖對gH的功能有顯著的調(diào)節(jié)作用，但這種調(diào)節(jié)作用不是必需的[23]，而gH 的跨膜錨定結(jié)構(gòu)域是gH發(fā)揮功能所必需的[24]。此外，Zhi-qing Yu等發(fā)現(xiàn)gB具有良好的免疫原性[25]，這為靶向gH與gB設(shè)計(jì)抗病毒阻斷劑提供新資料。

2.4 宿主細(xì)胞應(yīng)答 在PRV感染所引起的天然免疫應(yīng)答中，I型干擾素及其受體依賴性免疫穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)是宿主防御所必需的，IFN-α/β受體缺乏會增加機(jī)體對PRV的易感性[26]。ISG15是一種天然免疫中刺激IFN產(chǎn)生的泛素樣蛋白，參與IFN-β介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答，然而PRV可通過干擾豬體內(nèi)ISG15的表達(dá)來抵制其介導(dǎo)的抗病毒作用[27]。同時，PRV感染細(xì)胞后能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬水平增加，其程度與病毒的毒力成正相關(guān)，表明自噬對于病毒復(fù)制非常重要[28]。此外，毒性PRV感染機(jī)體能發(fā)生特異性的全身性炎性反應(yīng)，這種炎性反應(yīng)可導(dǎo)致小鼠死亡[29]。核苷酸內(nèi)焦磷酸磷酸二酯酶(Ectonucleotide pyrophosphotase/ phosphodiesterase,ENPP1)與GMP-AMP循環(huán)合酶(Cyclic GMP-AMP [cGAMP)] synthase,cGAS)協(xié)同作用維持cGAMP含量的穩(wěn)定并參與PRV的感染。感染PRV的細(xì)胞中，NEPP1過量表達(dá)則PRV的感染程度增強(qiáng)，提示其是重要的病毒作用靶位[30]。這些進(jìn)展為進(jìn)一步揭示該疫病致病機(jī)理提供了新思路。

3 PRV新型防控技術(shù)進(jìn)展

3.1 新型疫苗 疫苗免疫接種仍是我國控制PRV發(fā)生的首選措施。1970年我國從匈牙利引入偽狂犬病疫苗Bartha-K61株，自1990年國內(nèi)廣泛使用該疫苗以來，我國豬偽狂犬病得到了有效的控制。然而，2011年后半年，PRV變異株開始大范圍地出現(xiàn)。Bartha-K61株屬基因型Ⅰ型，而近幾年我國流行的PRV變異株形成了另一個獨(dú)立的基因型分支即基因型Ⅱ型，我國的經(jīng)典疫苗株已不能再為其提供完全的保護(hù)。新型PRV疫苗的研究在我國緊密展開。2016年Wang J等用PRV AH02LA株構(gòu)建gE基因缺失的PRV LA-LB感染克隆，將其輔以佐劑制備成滅活疫苗免疫3周齡的PRV陰性仔豬。結(jié)果表明，在PRV攻毒后，該滅活疫苗不僅能明顯減少病毒脫落，且能提供完全的臨床保護(hù)[31]。2017年Yin Y等利用同源DNA重組，在PRV的變異株XJ株基礎(chǔ)上去除gE/gI，構(gòu)建了一個新的弱毒疫苗株rPRV XJ-delgI/gE-EGFP。用該弱毒疫苗免疫斷奶仔豬，免疫后仔豬沒有表現(xiàn)出任何臨床癥狀，并在體內(nèi)檢測到了高水平的gB特異性抗體。28天后用PRV變異株FJ攻毒，除了輕微發(fā)燒外沒有任何其他臨床癥狀，而沒有免疫該弱毒疫苗的仔豬出現(xiàn)典型的臨床癥狀并在5天內(nèi)全部死亡[32]。同年Jing D等進(jìn)一步去除TK基因，構(gòu)建TK/gE/gI三基因缺失苗。與雙基因缺失苗相比，三基因缺失苗免疫豬具有較低的致病性和更高的保護(hù)力，是我國預(yù)防PR的理想候選疫苗株[33]。

此外，Liang C等還采用體外高溫傳代的方法，將PRV變異株JS-2012在Vero細(xì)胞中40 ℃條件下持續(xù)傳代到第120代，獲得PRV減毒株JS-2012-F120，該減毒苗免疫仔豬可保護(hù)仔豬免受經(jīng)典毒株和新出現(xiàn)強(qiáng)變異毒株的攻擊[34]。

3.2 抗病毒阻斷劑 針對PRV的治療，目前尚無特效藥。在發(fā)病早期應(yīng)用抗偽狂犬病病毒高免或丙種免疫球蛋白效果較好，但若已開始出現(xiàn)神經(jīng)癥狀則效果不佳。目前國內(nèi)外學(xué)者將PRV的新藥開發(fā)提上日程，希望為緊急治療提供資料。近年來研究表明，PRV在感染細(xì)胞的過程中能夠借助DNA聚合酶輔助亞基UL42蛋白來進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位，Changjie Lv等針對此機(jī)理發(fā)現(xiàn)伊維菌素通過靶向UL42蛋白核定位信號而具有抗PRV作用[35]。2014年魏子貢等人研發(fā)了一種抗PRV增殖的重組蛋白，可顯著抑制病毒感染宿主細(xì)胞[36]。2017年Li X等針對gB鑒定出15中具有良好中和病毒活性的單克隆抗體，其中14種單抗靶向PRV gB的結(jié)構(gòu)域IV并通過補(bǔ)體效應(yīng)阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞；另1種單抗可識別gB結(jié)構(gòu)域I，阻止病毒入侵且不依賴于補(bǔ)體作用[37]。2018年Zhao X等發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠抑制PRV的復(fù)制，減輕病毒感染引起的炎癥，因此可明顯降低PRV感染仔豬的死亡率，同時改善其生長性能[38]。天然產(chǎn)物具有抑制病毒復(fù)制、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等功效，靶向宿主細(xì)胞的抑制物亦可最大限度地減少耐藥性可能。而多靶位抗病毒制劑的聯(lián)用有望進(jìn)一步安全、有效地發(fā)揮病毒防治效果。

4 展望與現(xiàn)狀

隨著對PRV研究的持續(xù)關(guān)注與推進(jìn)，近年來偽狂犬病的綜合防控取得了很大進(jìn)展。新研制的TK/gE/gI三基因缺失苗有望成為候選疫苗株，多種新型抗病毒制劑的開發(fā)也成為該疫病緊急防控策略的重要組成部分。疫病檢測方面，我國學(xué)者研究出雙重液滴數(shù)字PCR (Duplex droplet digital PCR)與實(shí)時RPA檢測方法(Real-time RPA)，前者具有良好的線性和可重復(fù)性，靈敏度較實(shí)時熒光定量PCR高16倍[39]；后者快速簡便，在39 ℃下20 min即可完成PRV檢測[40]。兩種方法均有較高的準(zhǔn)確性，且均能區(qū)分野毒株和gE缺失苗，為設(shè)定該疫病的防控策略提供了重要參考。然而，目前的形勢也越發(fā)嚴(yán)峻，PRV變異株在我國多個省市廣泛出現(xiàn)，毒力和傳播能力也較Bartha-K61株有所增強(qiáng)；此外生產(chǎn)中常出現(xiàn)PRV與豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型或大腸桿菌、副豬嗜血桿菌混合感染的情況。我國PRV的凈化之路仍然任重道遠(yuǎn)！農(nóng)業(yè)部在2017年3月的指導(dǎo)意見中，對偽狂犬病的防治提出了明確意見，要求我國所有國家核心種豬場必須在2020年前做到PRV陰性。及時遏止PRV的突變與傳播速度，不僅需要基礎(chǔ)病原學(xué)的快速發(fā)展，同樣也依賴于規(guī)?；i場精準(zhǔn)的防控措施和合理的免疫程序。相信在學(xué)界和業(yè)界的一致努力以及緊密合作，我國偽狂犬病的凈化道路一定會越走越穩(wěn)。