肖 霞，李維靜，胡 雪，顧夢恬，卜仕金

(揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州225009)

為評(píng)價(jià)我國研制的頭孢洛寧干乳期乳房注入劑防治乳腺炎的有效性，本試驗(yàn)擬通過體外敏感性試驗(yàn)、臨床藥效試驗(yàn)，研究頭孢洛寧乳房注入劑對(duì)干乳期奶牛乳腺炎的防治效果，并和氯唑西林乳房注入劑防治干乳期乳腺炎的有效性進(jìn)行比較，以評(píng)價(jià)頭孢洛寧乳房注入劑防治干乳期奶牛乳腺炎的有效性，為制定臨床給藥方案提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株 質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌(ATCC29213第3代)和大腸桿菌(ATCC25922第3代)，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。臨床菌株由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。其中金黃色葡萄球菌(27株)、大腸桿菌(20株)、乳房鏈球菌(9株)、停乳鏈球菌(8株)和無乳鏈球菌(15株)共計(jì)79株，均來自揚(yáng)州某奶牛場患有臨床或亞臨床型乳房炎牛奶中分離和鑒定的細(xì)菌，分離日期為2012年7-8月。

1.2 藥品及試劑 芐星頭孢匹林、頭孢洛寧、阿莫西林、氯唑西林原料藥，購自德國Augburg公司；頭孢洛寧干乳期乳房注入劑：規(guī)格含量250 mg/支，批號(hào)111006，由中國牧工商(集團(tuán))總公司提供；氨芐西林-芐星氯唑西林乳房注入劑(干乳期)：規(guī)格含量4.5 g/支，批號(hào)(2012)01005-2056，北京立時(shí)達(dá)藥業(yè)有限公司。培養(yǎng)基由上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供；BMT檢測液：北京市奶牛研究所；Reagent C 裂解液：荷蘭ChemoMetec；新生牛血清：浙江天杭生物科技有限公司。

1.3 體外藥敏試驗(yàn) 根據(jù)CLSI準(zhǔn)則測定藥物對(duì)細(xì)菌的最小抑菌濃度(MIC)。根據(jù)規(guī)定配置藥液，用MH肉湯倍比稀釋藥液，取100 μL藥液加入96孔板中，用生理鹽水將菌液校正到 0.5 麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，再用 MH 肉湯1∶100稀釋(含菌量約106CFU/mL)，然后每孔接種100 μL。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照-接種菌液，不加抗菌藥；陰性對(duì)照-不接種菌液，不加抗菌藥。35 ℃～37 ℃孵育16～20 h。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 干乳期奶牛由揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場提供。動(dòng)物入選標(biāo)準(zhǔn)為：(1)治療時(shí)擁有臨床健康乳區(qū)的臨床健康奶牛(無臨床型乳房炎的跡象，如乳區(qū)腫脹等)；(2)在治療前2個(gè)月內(nèi)未用抗生素治療的奶牛。干奶前7 d檢查產(chǎn)奶量。

1.5 臨床試驗(yàn)分組及給藥 試驗(yàn)設(shè)2組，即受試藥物組、對(duì)照藥物組。將入選的奶牛按耳標(biāo)進(jìn)行分組，其中偶數(shù)耳標(biāo)分配至治療組，奇數(shù)耳標(biāo)分配到對(duì)照組中。每組動(dòng)物數(shù)不少于30頭。進(jìn)入干乳期的奶牛在進(jìn)行最后一次擠奶，待奶牛的每個(gè)乳區(qū)的乳汁完全擠干后立即由農(nóng)場熟練技術(shù)人員經(jīng)乳管向每個(gè)乳區(qū)分別注入1管受試藥物或?qū)φ账?。給藥后輕輕按摩乳區(qū)以便藥物分散至乳腺的乳池內(nèi)。給藥后奶牛不再擠奶直至產(chǎn)后重新開始泌乳。

1.6 樣品采集及處理 在藥物治療至產(chǎn)后14 d內(nèi)，每天對(duì)受試奶牛進(jìn)行臨床型乳房炎檢查。在干奶前、干奶期以及產(chǎn)后1、3、5 d，對(duì)每頭奶牛的4個(gè)乳區(qū)分別取不少于10 mL奶樣作為檢測樣本。對(duì)乳樣進(jìn)行體細(xì)胞計(jì)數(shù)(SCC)和細(xì)菌學(xué)檢查。

1.7 數(shù)據(jù)處理 通過計(jì)算各組治愈率、新近感染率及細(xì)菌分離培養(yǎng)情況，并與藥物對(duì)照組及未用藥處理組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析比較，以確定受試藥物防治干乳期乳房炎的有效性。其中，治愈指如果一種病原體在干奶之前被分離出來且同樣的病原體在產(chǎn)后采集的此乳區(qū)樣本中未發(fā)現(xiàn)，同時(shí)奶牛在干奶期未患有臨床型乳房炎的，則可認(rèn)為該乳區(qū)被治愈；新近感染指如果在產(chǎn)后分離出的一種病原體，而在治療前的樣本中不存在該病原體，則可認(rèn)為該乳區(qū)新近被感染。臨床型乳房炎的統(tǒng)計(jì)單位為奶牛頭數(shù)，對(duì)細(xì)菌學(xué)分離和SCC測定結(jié)果的統(tǒng)計(jì)單位為乳區(qū)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法采用卡方檢驗(yàn)。SCC結(jié)果經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后采用t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 體外抑菌試驗(yàn) 4種抗菌藥物(頭孢洛寧、頭孢匹林、阿莫西林、氯唑西林)對(duì)5種細(xì)菌的MIC結(jié)果見表1。其中頭孢洛寧、頭孢匹林、阿莫西林、氯唑西林對(duì)奶牛乳腺炎大腸桿菌的MIC50分別為4、8、8 μg/mL和>128 μg/mL，MIC90分別為64、64 μg/mL、>128 μg/mL和>128 μg/mL。結(jié)果表明，頭孢匹林和頭孢洛寧對(duì)革蘭陰性菌具有一定的抗菌活性，與阿莫西林對(duì)大腸桿菌的抗菌活性相似。4種藥物對(duì)乳房鏈球菌MIC50分別為4、8、16 μg/mL 和128 μg/mL，MIC90分別為8、16、64 μg/mL和>128 μg/mL；停乳鏈球菌MIC50分別為8、8、8 μg/mL 和128 μg/mL，MIC90分別為16、8、128 μg/mL和>128 μg/mL；無乳鏈球菌MIC50分別為0.25、4、0.25 μg/mL和32 μg/mL，MIC90分別為4、16、4 μg/mL和>128 μg/mL；MIC測定結(jié)果表明，頭孢匹林、頭孢洛寧和阿莫西林對(duì)鏈球菌比氯唑西林具有更好的抗菌活性。4種抗菌藥對(duì)金黃色葡萄球菌MIC50分別為0.125、0.25、2 μg/mL和1 μg/mL，MIC90分別為16、16、32 μg/mL和128 μg/mL。試驗(yàn)結(jié)果表明，頭孢匹林和頭孢洛寧對(duì)金黃色葡萄球菌高度敏感。

表1 頭孢洛寧等對(duì)自奶牛乳房炎分離的大腸桿菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌體外敏感性試驗(yàn)結(jié)果 (μg/mL)

2.2 治愈情況 治療前每個(gè)乳區(qū)細(xì)菌學(xué)分離情況見表2，給藥至產(chǎn)犢后細(xì)菌學(xué)治愈率見表3。受試藥物組和對(duì)照藥物組微生物清除率差異不顯著，由此可見，受試藥物可以有效的防治奶牛干乳期病原菌的感染。

2.3 新近感染發(fā)生情況 干奶期及產(chǎn)犢后出現(xiàn)新感染情況見表4，從表中數(shù)據(jù)可以看出新感染率較低，大多數(shù)乳區(qū)仍維持陰性狀態(tài)，由此表明，兩組藥物都有預(yù)防奶牛乳腺炎新感染發(fā)生的功效。

2.4 產(chǎn)后體細(xì)胞數(shù) 產(chǎn)后體細(xì)胞數(shù)檢測結(jié)果見表5，以兩組乳區(qū)個(gè)數(shù)為個(gè)體，統(tǒng)計(jì)體細(xì)胞數(shù)，從表中5可以看出在初乳期間隨著泌乳天數(shù)和泌乳量的增加，體細(xì)胞數(shù)逐漸下降，回歸至正常泌乳期的體細(xì)胞值，兩組數(shù)據(jù)對(duì)比P>0.5，差異不顯著。

表2 干奶前分離出細(xì)菌的乳區(qū)數(shù) /%

N*：檢查的乳區(qū)數(shù)量；N：檢出細(xì)菌的乳區(qū)數(shù)量；P：百分率(%)；a：受試藥物組；b：對(duì)照藥物組

表3 給藥至產(chǎn)后亞臨床傳染性乳房炎的治愈率 /%，以乳區(qū)數(shù)表示

表4 干奶期及產(chǎn)犢后出現(xiàn)新感染情況 /%

N：檢查的乳區(qū)數(shù)量

表5 產(chǎn)后體細(xì)胞數(shù)檢測結(jié)果 /個(gè)

結(jié)果表明，干奶前收集的樣品中組間細(xì)菌學(xué)檢查沒有發(fā)現(xiàn)明顯的差異。用受試藥物和對(duì)照藥物的治愈率均較好。產(chǎn)后體細(xì)胞數(shù)也與對(duì)照藥物差異不顯著?？梢园l(fā)現(xiàn)受試藥物適用于防治干乳期奶牛乳腺炎的發(fā)生。

3 討論

奶牛乳腺炎發(fā)病率高，危害大， 引發(fā)該病的因素多種多樣，其中微生物感染是最主要的因素[1]。干乳期不但是乳腺感染的高危時(shí)期也是防治乳腺炎的理想時(shí)期[2]。對(duì)于許多病原菌來說，干乳期用藥的治愈比例比在泌乳期治愈的比例要高[3]。頭孢洛寧對(duì)酸和β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，對(duì)革蘭陰性菌和革蘭陽性菌，尤其對(duì)引起奶牛乳腺炎的主要病原菌均具有良好的抗菌活性[4]。體外藥敏試驗(yàn)顯示，除金黃色葡萄球菌對(duì)氯唑西林的MIC50低于耐藥折點(diǎn)以外，其余菌屬的MIC50均高于32 μg/mL，表現(xiàn)為高度耐藥。無乳鏈球菌及金黃色葡萄菌對(duì)阿莫西林MIC50低于耐藥折點(diǎn)，表現(xiàn)為敏感，其余細(xì)菌對(duì)其高度耐藥。該結(jié)果說明，揚(yáng)州地區(qū)與奶牛乳腺炎有關(guān)細(xì)菌對(duì)青霉素類藥物耐藥嚴(yán)重。而董翔宸等的報(bào)道顯示，氨芐西林對(duì)從甘肅及周邊地區(qū)奶牛分離的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及腸球菌的抑菌效果較好，MIC50分別為1.58、2.66、1.61 μg/mL，而對(duì)鏈球菌的MIC50為1.28 μg/mL[1]。分析發(fā)現(xiàn)，本研究中細(xì)菌對(duì)青霉素類抗生素的敏感性要低于其報(bào)道的結(jié)果，可能的原因是不同地區(qū)奶牛乳腺炎的發(fā)病情況不同，使用藥物種類不同，細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性存在差異。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，揚(yáng)州地區(qū)奶牛產(chǎn)業(yè)中使用青霉素類抗生素較多，因而其對(duì)青霉素類藥物耐藥性較為嚴(yán)重。所有細(xì)菌對(duì)頭孢洛寧及頭孢匹林的MIC50均低于耐藥折點(diǎn)，說明揚(yáng)州地區(qū)與奶牛乳腺炎有關(guān)細(xì)菌對(duì)頭孢菌素類藥物敏感。該結(jié)果與已有報(bào)道一致，Moroni等測定了68株分離自乳腺炎奶牛的金黃色葡萄菌，發(fā)現(xiàn)頭孢洛寧對(duì)其的MIC50及MIC90為2、16 μg/mL[5]。與阿莫西林和氯唑西林相比，頭孢洛寧和頭孢匹林對(duì)從亞臨床奶牛乳腺炎中分離的細(xì)菌具有更高的抗菌活性，該結(jié)果與已有報(bào)道一致[5]。

臨床試驗(yàn)表明，氨芐西林-芐星氯唑西林乳房注入劑對(duì)不同細(xì)菌的治愈率介于50%～87.5%，治療效果與其他文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似。Cummins和McCaskey報(bào)道，通過在干奶期每個(gè)乳區(qū)注射一支氯唑西林，治愈率可達(dá)到73.6%[6]。無論從治愈率、新近感染情況及產(chǎn)后體細(xì)胞數(shù)檢測結(jié)果分析，頭孢洛寧乳房注入劑對(duì)奶牛乳腺炎的防治效果與已上市的氨芐西林-芐星氯唑西林乳房注入劑均相當(dāng)。Parkinson等比較了氯唑西林與頭孢洛寧對(duì)于奶牛乳腺炎的療效，結(jié)果顯示，兩者在防治作用上無差異，但頭孢洛寧組的體細(xì)胞數(shù)低于氯唑西林組[7]。McDougall 比較了自主研發(fā)的頭孢洛寧乳房注入劑及先靈葆雅公司產(chǎn)品Cepravin，結(jié)果顯示治愈率均達(dá)到90%以上，無顯著差異[8]。

研究顯示，奶牛干奶期通過乳房單次給藥頭孢洛寧不但可以提高奶牛乳腺炎的治愈率，而且可以有效的減少新感染的發(fā)生，同時(shí)，使初乳期間隨著泌乳天數(shù)和泌乳量的增加，體細(xì)胞數(shù)逐漸下降，回歸至正常泌乳期的體細(xì)胞值。該結(jié)果與Hogan，Hassan，Schukken等的研究結(jié)果相符[9-11]。

4 結(jié)論

頭孢洛寧對(duì)揚(yáng)州地區(qū)亞臨床乳腺炎分離細(xì)菌(大腸桿菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌)敏感性略高于頭孢匹林，但遠(yuǎn)高于氯唑西林、阿莫西林。頭孢洛寧干乳期乳房注入劑和氨芐西林-芐星氯唑西林干乳期乳房注入劑對(duì)于奶牛乳腺炎的防治效果差異不顯著。說明頭孢洛寧適合用于干乳期防治乳腺炎的防治。對(duì)干乳期奶牛每乳區(qū)灌注一管250 mg頭孢洛寧干乳期乳房注入劑能有效治療干乳期隱性乳腺炎和預(yù)防新的乳腺炎感染。