尹玉偉，尹玉林，馬世宏，茆安婷，秦亞寧，代 靜，李月紅

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118；2.內(nèi)蒙古烏蘭察布市獸醫(yī)監(jiān)察所，內(nèi)蒙古烏蘭察布012000；3.河南科技大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南洛陽471003)

鉛是一種生物機(jī)體非必須的重金屬，其能破壞機(jī)體正常生理功能、免疫功能、神經(jīng)功能。隨著工業(yè)的發(fā)展，造成鉛廣泛存在于大氣、水體以及土壤。重金屬中，鉛的毒性最強(qiáng)[1]，并且鉛對生物的毒性不存在最小毒性劑量，因此鉛只要存在機(jī)體便有毒[2]。通過食物鏈對鉛的富集作用，使人較容易攝入高濃度鉛[3]。

人參作為“東北三寶”之一，是一種藥食兩用植物。它能夠提高機(jī)體抗氧化能力、免疫力，此外還具有抗癌作用，起主要調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)是人參皂苷和人參多糖[4]。鉛作為一種重金屬，其能夠造成機(jī)體氧化應(yīng)激，刺激金屬轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)[5]，而人參對動物重金屬減毒作用研究較少，本試驗通過萃取的方式的保護(hù)人參皂苷和人參多糖，將Rs添加入GCO細(xì)胞培養(yǎng)基中，來探究其對鉛暴露細(xì)胞后的減毒作用，為后續(xù)Rs在生產(chǎn)中的使用打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試劑 GCO細(xì)胞，購自天津水產(chǎn)研究所；胎牛血清(FBS)和M199培養(yǎng)基，購自美國Gibco公司；人參粉，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院饋贈；醋酸鉛，購自北京化工廠；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒，均購自南京建成生物工程公司；TRIZol，購自大連TaKaRa；FastStart Universal SYBR Green Master購自，Roche公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自江蘇愚公科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 醋酸鉛的配制和人參浸出液的制備 鉛溶液母液：3.7934 g三水合醋酸鉛。溶于10 mL雙蒸水中，配成0.01 mol/L的母液，梯度稀釋后進(jìn)行試驗。人參浸出液(Rs)的制備：人參粉加水萃取，萃取之后用蒸發(fā)皿蒸發(fā)成晶體，取10～15 g晶體溶于5 mL ddH2O，使之飽和，獲得人參浸出飽和溶液，使用0.22 μm濾膜進(jìn)行過濾，按試驗濃度加入培養(yǎng)基。

1.2.2 GCO細(xì)胞培養(yǎng) GCO細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后，在含有10%FBS的M199完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)(含有1×106IU/mL 青霉素和鏈霉素)，每天進(jìn)行觀察并進(jìn)行換液，在細(xì)胞貼壁達(dá)到90%以后進(jìn)行傳代，培養(yǎng)3～4代后進(jìn)行試驗。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞活性

1.2.3.1 Pb對GCO細(xì)胞活性的影響 細(xì)胞復(fù)蘇后，生長至70%～80%時，用1 g/L胰蛋白酶消化制備細(xì)胞懸液，以2.6×104個/孔，接于96孔板，置于27 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為對照組、0.001 mmol/L Pb組、0.005 mmol/L Pb組、0.01 mmol/L Pb組、0.05 mmol/L Pb組，加入不含血清的M199培養(yǎng)基，分別處理1 h和2 h后檢測細(xì)胞活性。

1.2.3.2 Rs對GCO活性影響 細(xì)胞處理同1.2.3.1。將細(xì)胞分為對照組、2% Rs組、4% Rs組、6% Rs組、8% Rs組，將細(xì)胞用PBS洗3次，之后加入不同濃度Rs的M199培養(yǎng)基，處理后的12 h、24 h測定細(xì)胞活性。

1.2.3.3 Pb和Rs對GCO活性影響 細(xì)胞處理同上1.2.3.1。將細(xì)胞分為對照組(CK)、0.01 mmol/L Pb組(Pb)、0.01 mmol/L Pb加2%Rs組(2%Rs)、0.01 mmol/L Pb加4%Rs組(4%Rs)、0.01 mmol/L Pb加6%Rs組(6%Rs)、0.01 mmol/L Pb加8%Rs組(8%Rs)，所有Pb添加組，Pb處理的時間為1 h， Pb處理結(jié)束后添加不同劑量含Rs的M199培養(yǎng)基進(jìn)行處理，在Rs處理后在12 h、24 h、48 h測定細(xì)胞活性。

1.2.4 細(xì)胞抗氧化功能測定 試驗分組與處理同1.2.3.3。在48 h，對細(xì)胞的氧化能力進(jìn)行測定，測定抗氧化SOD、GSH-Px、CAT指標(biāo)。

1.2.5 細(xì)胞基因表達(dá)水平 (1)將細(xì)胞接于6孔板后，處理同1.2.3.3。48 h后進(jìn)行RNA提取，TRIZol法進(jìn)行提取，總RNA提取之后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA于-80 ℃保存。(2)以β-actin為內(nèi)參基因，引物信息(見表1)。反應(yīng)體系20 μL，包括10 μL 2×FastStart Universal SYBR Green Master，上下游引物0.6 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)條件94 ℃10 min、之后40個循環(huán)，94 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 20 s。計算表達(dá)量用2-△△Ct。

表1 引物序列信息

1.3 實驗儀器 全波長酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)；熒光定量PCR儀(ABI公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo scientific公司)。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測細(xì)胞活性

2.1.1 Pb對GCO細(xì)胞活性的影響 隨著Pb濃度和暴露時間的增加，相對細(xì)胞活性逐漸降低。Pb濃度分別為0.001、0.005、0.01、0.05 mmol/L暴露時間為1 h時，細(xì)胞活性分別降低到86%，80%、74%和63.5%；以相同的濃度暴露2 h時，細(xì)胞活性分別降低到75%，71%、61.2%和51.3%。Pb對GCO細(xì)胞活性的影響(見圖1A)。

2.1.2 Rs對GCO細(xì)胞活性影響 隨著Rs濃度和暴露時間的增加，相對細(xì)胞活性呈先上升后下降的趨勢。Rs添加量分別為2%、4%、6%和8%暴露時間為12 h時，細(xì)胞活性分別提高到107.8%，116.2%、111%和102.8%；以相同的濃度暴露24 h時，細(xì)胞活性分別提高到108.6%，120.5%、111.5%和104.3%。Rs對GCO細(xì)胞活性的影響(見圖1B)。

2.1.3 Pb和Rs對GCO活性的影響 在所有處理時間點，4%Rs添加時細(xì)胞活性顯著(P< 0.05)高于Pb、2%RS組、6%Rs組和8%Rs組。Pb和Rs對GCO細(xì)胞活性的影響(見圖2)。

圖1 Pb或Rs對GCO細(xì)胞活性的影響

A：不同劑量Pb對GCO活性的影響；B：不同劑量Rs對GCO活性的影響

圖2 Pb和Rs對GCO細(xì)胞活性的影響

注：圖中標(biāo)有不同字母者表示差異顯著(P< 0.05)，標(biāo)有相同字母的表示差異不顯著(P> 0.05)，下圖同

2.2 細(xì)胞抗氧化測定

2.2.1 Pb和Rs對GCO細(xì)胞SOD活性的影響 對照組顯著高于(P< 0.05)試驗組；4%Rs組SOD顯著高于(P< 0.05)Pb組、2%Rs組、6%Rs組和8%Rs組；2%Rs組和6%Rs組SOD顯著高于(P< 0.05)Pb組和8%Rs組。Pb和Rs對GCO細(xì)胞SOD活性的影響(見圖3)。

圖3 Pb和Rs對GCO細(xì)胞SOD活性的影響

2.2.2 Pb和Rs對GCO細(xì)胞CAT活性的影響 對照組顯著(P<0.05)低于實驗組；4%Rs組CAT顯著低于(P<0.05)Pb組、6%Rs組和8%Rs組；2%Rs組和6%Rs組顯著高于(P< 0.05)Pb組和8%Rs組；Pb組顯著高于(P<0.05)2%Rs組、4%Rs組、6%Rs組和8%Rs組。Pb和Rs對GCO細(xì)胞CAT活性的影響(見圖4)。

圖4 Pb和Rs對GCO細(xì)胞CAT活性的影響

2.2.3 Pb和Rs對GCO細(xì)胞GSH-Px活性的影響 對照組顯著(P<0.05)高于實驗組；4%Rs組GSH-Px顯著高于(P<0.05)Pb組、2%Rs組、6%Rs組和8%Rs組；2%Rs組顯著高于(P<0.05)Pb組和8%Rs組；Pb組顯著高于(P<0.05)2%Rs組、4%Rs組、 6%Rs組和8%Rs組。Pb和Rs對GCO細(xì)胞GSH-Px活性的影響(見圖5)。

圖5 Pb和Rs對GCO細(xì)胞GSH-Px活性的影響

2.3 MT基因相對表達(dá)量 相對于對照組，各組(Pb組、2%Rs組、4%Rs組、6%Rs組、8%Rs組)MT基因表達(dá)量分別提高4.2、2.55、1.97、2.58和2.57倍。MT基因的表達(dá)量(見圖6)。

圖6 Pb和Rs對GCO細(xì)胞MT基因表達(dá)量的影響

3 討論

研究表明，重金屬等進(jìn)入機(jī)體后會增加體內(nèi)氧化應(yīng)激，造成氧化壓力增加[6]。鉛也在很早就被發(fā)現(xiàn)，會增加機(jī)體的氧化應(yīng)激[7]。氧化作用是機(jī)體必需的生物代謝，其代謝過程中會出現(xiàn)較多的副產(chǎn)物(主要是活性氧；ROS)，這些副產(chǎn)物如不能及時清除，就會使機(jī)體產(chǎn)生氧化損傷[8]。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，三丁基錫暴露斑馬魚后，SOD隨著三丁基錫的暴露濃度增加呈現(xiàn)劑量依賴性降低[9]。Nrf2基因是主要調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的基因，研究表明重金屬能夠抑制Nrf2表達(dá)，使機(jī)體不能夠及移除過多的ROS，從而造成機(jī)體產(chǎn)生氧化損傷[10]。人參中的多糖，皂苷以及多肽等物質(zhì)，都能提高機(jī)體的氧化應(yīng)激能力，記憶力以及非特異性免疫能力，楊迎等通過將人參皂苷Rg1和Rb1飼喂幼鼠后發(fā)現(xiàn)，其能夠促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育并且有一定的促進(jìn)生長的作用，同時這種效果能夠延續(xù)到小鼠成年[11]；另一項研究表明，注射Rg1和Rb1能夠加強(qiáng)小鼠水迷宮實驗的空間學(xué)習(xí)記憶能力[12]。夏菁等研究表明，Rg1能夠誘導(dǎo)人紅白血病TF-1細(xì)胞凋亡，其主要的機(jī)制是Rg1能夠參與JAK通路中蛋白磷酸化，并下調(diào)其下游相關(guān)的基因，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[13]。本研究中4%Rs組對Pb暴露后氧化應(yīng)激指標(biāo)顯著提高，其主要原因可能是因為人參多糖和人參皂苷提高了細(xì)胞Nrf2的表達(dá)，從而使細(xì)胞抗氧化能力升高，而2%Rs、6%Rs、8%Rs添加組細(xì)胞抗氧化能力提高不明顯，2%Rs添加組可能是人參皂苷和人參多糖量不足以調(diào)節(jié)細(xì)胞基因表達(dá)所致，而6%Rs、8%Rs添加組細(xì)胞抗氧化能力提高不明顯可能是由于添加過量，從而影響了細(xì)胞的基礎(chǔ)代謝所致，但具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

金屬硫蛋白(MT)是參與體內(nèi)金屬轉(zhuǎn)運平衡的重要蛋白，同時其在解毒以及氧化應(yīng)激中也發(fā)揮著重要作用。研究都表明，當(dāng)水生動物暴露重金屬后，MT基因在不同組織中的表達(dá)與重金屬的暴露存在顯著的相關(guān)性，也因而被用來作為生物標(biāo)記物來檢測水環(huán)境中重金屬的污染。MT基因在參與離子平衡時會移除機(jī)體非必須的金屬，并且研究表明，重金屬暴露魚類后會使MT基因的表達(dá)上升[14]，Kim等(2016)通過利用維生素C和鉛同時暴露許氏平鲇后發(fā)現(xiàn)，維生素C能夠減弱鉛對MT基因誘導(dǎo)升高作用[7]。李建平(2011)等研究表明，人參多糖能夠調(diào)節(jié)人白細(xì)胞K562基因表達(dá)譜的改變[15]。本研究中，MT基因的表達(dá)量，相對于對照組，各組(Pb組、2%Rs組、4%Rs組、6%Rs組、8%Rs組)MT基因表達(dá)量分別提高4.2、2.55、1.97、2.58倍和2.57倍。4%Rs 添加時MT基因的表達(dá)量顯著降低(P< 0.05)，這可能是由于人參浸出液的添加提高了MT基因活性，使機(jī)體能夠轉(zhuǎn)運足夠的必須金屬，來減弱了Pb誘導(dǎo)的MT的提升作用，2%Rs可能是由于添加量過少不足以誘導(dǎo)MT活性，6%Rs和8%Rs可能由于過量的添加導(dǎo)致影響了細(xì)胞正常代謝，抑制了MT基因的活性。

綜上所述，不同濃度Rs能夠緩解Pb誘導(dǎo)GCO細(xì)胞毒性，4%Rs添加時最佳。