陳 思，黃小青，陳秀娟，楊 春，唐艷萍，李科志，曹 驥

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣西南寧530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣西南寧530021；3.區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530021)

肝癌(Liver cancer)通常是指發(fā)生于肝臟的癌癥，如果由于肝臟內(nèi)細(xì)胞所引發(fā)的癌癥，稱之為原發(fā)性肝癌，而由身體其他器官癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至肝臟而形成的惡性腫瘤，稱為繼發(fā)性肝癌。原發(fā)性肝癌中85%屬于肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)。作為死亡率較高的惡性腫瘤之一，其特點(diǎn)是進(jìn)展迅速，治療后易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，據(jù)相關(guān)資料顯示，近20年病死率呈逐年上升趨勢(shì)。全球每年發(fā)病人數(shù)在60萬(wàn)以上，中國(guó)肝癌的發(fā)病率占全球50%以上[1-3]，據(jù)2017年美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)發(fā)表的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，近25年美國(guó)癌癥總死亡率降低了25%，但肝癌的死亡率仍保持上升趨勢(shì)[4]，研究病因及有效的治療措施迫在眉睫。然而到目前為止，HCC的致病機(jī)理、促癌致癌因素尚未明確，治療及抑制轉(zhuǎn)移效果尚不理想。動(dòng)物模型是研究發(fā)病機(jī)制及臨床藥物試驗(yàn)的重要載體[5]，因此，建立接近與人體肝癌臨床特征的動(dòng)物模型對(duì)于明確病因及發(fā)病機(jī)制，發(fā)掘新的治療方法具有重要意義。當(dāng)前肝癌模型主要采用的動(dòng)物包括小鼠、大鼠、裸鼠、倉(cāng)鼠、兔、豬、魚(yú)等，腫瘤的成因主要包括自發(fā)性、誘發(fā)性和移植性，本文主要探討移植性肝癌模型。

1 肝癌模型的研究進(jìn)展及應(yīng)用

自發(fā)性肝癌是指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未經(jīng)人為因素干預(yù)，在完全自然狀態(tài)下形成腫瘤組織；誘發(fā)性肝癌是通過(guò)化學(xué)、物理、生物等因素有目的作用于動(dòng)物機(jī)體，通過(guò)損傷-纖維化-惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程引發(fā)癌腫[6]。以上兩種肝癌模型均具有誘發(fā)周期長(zhǎng)、起病具隱匿性、荷瘤動(dòng)物個(gè)體差異大等特點(diǎn)，自發(fā)性肝癌模型的制備耗時(shí)長(zhǎng)、成功率低，一般很少采用[7]，誘發(fā)性肝癌因?yàn)椴捎没瘜W(xué)制劑致癌，具有一定的可控性，常用于病因機(jī)制、遺傳學(xué)方面的研究，移植性肝癌是將來(lái)源于人或者動(dòng)物的肝癌組織、細(xì)胞株或其他類型的惡性腫瘤移植入目的動(dòng)物體內(nèi)，彌補(bǔ)了腫瘤位置和大小的差異性不足，且移植存活率高，瘤體生長(zhǎng)速度快，不僅可供于肝癌病因?qū)W的探索還可用于轉(zhuǎn)移性機(jī)制及抑癌性的研究、抗癌藥的篩選。

通過(guò)檢索中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)(表1)，自2016年1月至2017年9月共收錄有關(guān)肝癌動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)264例，其中采用誘發(fā)性動(dòng)物模型50例，移植性214例。當(dāng)前國(guó)內(nèi)應(yīng)用肝癌動(dòng)物模型主要集中在新藥的抗癌篩選、藥效研究方面，占各類研究?jī)?nèi)容的74.0%，其次是動(dòng)物模型構(gòu)建方面的研究占比11.70%，采用小鼠作為肝癌模型的最多，比例為52.65%。

在種屬的選擇上主要依據(jù)試驗(yàn)的研究?jī)?nèi)容：小鼠、裸鼠和家兔主要是采用移植瘤株來(lái)構(gòu)建模型。小鼠和裸鼠主要是異位移植，以腋窩和背部皮下為主，采用的瘤株多為H22小鼠肝癌細(xì)胞和HepG2人肝癌細(xì)胞。一般用來(lái)進(jìn)行藥物試驗(yàn)，特點(diǎn)是建?？旖?、觀察方便；家兔因?yàn)閭€(gè)體較其他模型偏大，容易通過(guò)外科手術(shù)直接將瘤株種植于肝臟，進(jìn)行放射性治療和影像學(xué)研究更有優(yōu)勢(shì)，主要采用VX2瘤株；大鼠和斑馬魚(yú)主要用于肝癌病因?qū)W的研究，以化學(xué)物質(zhì)誘發(fā)肝細(xì)胞癌，大鼠常用Wistar、SD鼠研究致病機(jī)理，誘導(dǎo)劑一般采用二乙基亞硝胺(DEN)、黃曲霉素(AFB1)、四氯化碳(CCl4)二甲基氨基偶氮苯(3＇-Me-DAB)等，斑馬魚(yú)作為生物模型始于19世紀(jì)80年代，構(gòu)建肝癌模型的優(yōu)勢(shì)在于其肝細(xì)胞功能接近于哺乳動(dòng)物，如肝臟發(fā)育信號(hào)通路和相關(guān)因子、糖原和脂肪的儲(chǔ)存、膽汁分泌、血清蛋白分泌等，并且與人類基因有87%的同源性[8]。但與哺乳類動(dòng)物模型不同，斑馬魚(yú)難以開(kāi)展移植性操作，多采用誘導(dǎo)性和轉(zhuǎn)基因技術(shù)處理胚胎得到目的模型[9]。

表1 中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的不同種屬肝癌動(dòng)物模型試驗(yàn)統(tǒng)計(jì) (2016年1月- 2017年9月)

注：部分試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行了多位點(diǎn)移植或者雙重目的性試驗(yàn)，裸鼠、大鼠和兔組別中均有1例試驗(yàn)同時(shí)移植了2個(gè)位點(diǎn)，裸鼠組中有2例試驗(yàn)包含兩項(xiàng)研究?jī)?nèi)容

2 腫瘤移植位點(diǎn)

移植性腫瘤模型自建立30多年來(lái)，位點(diǎn)從最初的皮下移植逐漸發(fā)展至腹腔移植、原位移植、血液移植、淋巴移植等；移植的類型主要包括同種和異種移植兩種[10]，當(dāng)前有關(guān)肝癌動(dòng)物模型移植位點(diǎn)的選擇主要包括以下幾種。

2.1 皮下移植 是各類模型最常用的位點(diǎn)，早期的移植材料來(lái)源為新鮮的人肝癌邊緣組織，成功率較低只有11%左右，后來(lái)逐漸發(fā)展為應(yīng)用細(xì)胞株，在HCC研究中，將人或動(dòng)物的肝癌細(xì)胞株(或組織)種植于頸背部、腋下、后肢等部位的皮下，移植成功率分別為前肢腋下>軀干近頭側(cè)>背部>后肢，其中將人肝癌細(xì)胞種植到免疫功能缺陷的小鼠頸背部皮下，當(dāng)移植的腫瘤細(xì)胞數(shù)為(1～5)×106時(shí)，成功率接近100%[11]。由該癌株增殖的腫瘤基本具有人肝癌細(xì)胞的特性，所得試驗(yàn)結(jié)果更有意義[12]。皮下移植不僅操作簡(jiǎn)單、觀察測(cè)量方便，而且可以作為原位移植瘤的瘤源資源，但其缺點(diǎn)是缺乏肝癌細(xì)胞與肝臟組織之間的相互作用，在試驗(yàn)中有部分呈假陽(yáng)性，而且如研究肝癌的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移選擇該位點(diǎn)也不宜得到理想模型[11]。

2.2 原位移植 原位移植較皮下移植有較高的操作要求，但其優(yōu)點(diǎn)在于保留了原有腫瘤組織的生物學(xué)特點(diǎn)和微環(huán)境，能更好地反應(yīng)肝癌的侵襲能力和免疫逃逸機(jī)制[13]，而且腹腔浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移和腹水等生理現(xiàn)象也多見(jiàn)于此模型。原位移植模型的建立一般有兩種途徑，一種是將剪好的腫瘤組織(1×1×1 mm3)通過(guò)外科手術(shù)方法(開(kāi)腹、穿刺)植入肝區(qū)[14]，當(dāng)前也有很多模型是通過(guò)輔助設(shè)備進(jìn)行肝瘤塊的種植，例如經(jīng)皮穿刺CT、DSA、MR影像引導(dǎo)制作兔VX2肝癌模型[15-16]；另一種是將細(xì)胞懸液直接注入肝左葉，而且在細(xì)胞數(shù)目(1～5)×106時(shí)，較易發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[17]。在先前的試驗(yàn)研究中，原位移植瘤的缺點(diǎn)在于只有將模型處死后才可進(jìn)行瘤體組織的取出測(cè)量[18]，但當(dāng)前有了影像學(xué)設(shè)備的輔助使得在體觀察腫瘤生長(zhǎng)、甚至新生血管變化成為可能，例如閻曉朋等[19]通過(guò)CT能譜成像及灌注成像技術(shù)對(duì)兔肝腫瘤模型中血供變化進(jìn)行研究，余梁等[20]在VX2移植兔模型實(shí)施了肝癌經(jīng)動(dòng)脈栓塞術(shù)(TAE)后,通過(guò)CT與DSA對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和新生血管進(jìn)行影像學(xué)評(píng)估，獲得理想效果。

2.3 腹腔移植 腹腔移植在操作方面最為簡(jiǎn)單，而且可出現(xiàn)一定數(shù)量的轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)、腹水的案例，但缺點(diǎn)在于不便于瘤體的觀察和測(cè)量。移植方法是將人肝癌細(xì)胞株或者組織碎片注入腹腔內(nèi)，動(dòng)物的前側(cè)腹壁比后側(cè)腹壁更有利于癌株的增殖，該模型的應(yīng)用主要包括：(1)研究HCC侵襲周圍組織和肺、肝、腎、腸等遠(yuǎn)端器官轉(zhuǎn)移的過(guò)程；(2)藥物篩選試驗(yàn)；(3)通過(guò)腹腔移植可以傳代和培養(yǎng)，在進(jìn)行原位或異位移植前，將復(fù)蘇的瘤株注入目標(biāo)動(dòng)物腹腔內(nèi)傳代，待傳代完成過(guò)后可得到理想數(shù)量的肝癌細(xì)胞，并且傳代后活性更高，對(duì)于體內(nèi)環(huán)境適應(yīng)性更強(qiáng)，提高移植成功率。

2.4 靜脈移植 中國(guó)肝癌的發(fā)病易伴發(fā)多種途徑轉(zhuǎn)移[21]。肝癌細(xì)胞因自發(fā)或者診療操作進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，稱為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)，在隨血液流動(dòng)種植于某個(gè)器官便發(fā)生了肝癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，返回殘肝或者肝臟組織后種植便是復(fù)發(fā)性肝癌[22]，作為一種新興的腫瘤標(biāo)記物，又稱為“液體活檢”(Liquid biopsy)[23]，研究CTCS的作用機(jī)制，減少其在血液中數(shù)目，有利于改善肝癌患者的預(yù)后。據(jù)報(bào)道，免疫療法對(duì)于HCC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者行之有效[24]，因此研究人員需要通過(guò)多發(fā)轉(zhuǎn)移性肝癌動(dòng)物模型進(jìn)行試驗(yàn)，CTCs模型的建立主要方式便是靜脈移植，一般是將低劑量的腫瘤細(xì)胞注入門靜脈或者脾靜脈[25-26]。羅桂芳等通過(guò)小鼠尾靜脈移植體外培養(yǎng)的Hepa 1～6 細(xì)胞，也成功的制作出了CTCs模型[27]。通過(guò)該類移植模型的建立可更好地研究肝癌的轉(zhuǎn)移機(jī)理及探索更有效的治療策略。

2.5 其他位點(diǎn)移植 除以上的移植位點(diǎn)外還有一些其他的異位轉(zhuǎn)移模型構(gòu)建，如腎包膜下移植，將瘤株植入兩腎包膜下，由于腎臟血供豐富，免疫機(jī)能稍差，一般接種成功率高于皮下移植[28]，且易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其他常見(jiàn)的移植位點(diǎn)還包括脾[29]。

3 瘤株選擇

3.1 人源性肝癌細(xì)胞株 HepG2分離于高加索地區(qū)一個(gè)15歲白人肝癌患者的肝胚細(xì)胞，該細(xì)胞系可分泌白蛋白(ALB)、巨球蛋白(a2-MG)等，由于來(lái)源的肝癌組織類型為肝母細(xì)胞瘤，因此適合用于肝細(xì)胞代謝方面的研究，低轉(zhuǎn)移，生長(zhǎng)較快。美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)建議該細(xì)胞株在免疫抑制小鼠體內(nèi)不易致瘤，因此一般移植于免疫缺陷的裸鼠模型中[30]；SMMC-7721，取自于一例HCC患者肝臟組織，甲胎蛋白(AFP)呈陽(yáng)性，裸鼠體內(nèi)移植，成瘤率高；Bel-7402，同樣為HCC屬，特點(diǎn)是異種移植成瘤率高，瘤塊組織學(xué)病例與HCC類似；MHCC97是由我國(guó)一名39歲HCC患者的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本移植入裸鼠(LCI-D20)而得，分離得到了HCCLM3、MHCC97-L、MHCC97-H 3種細(xì)胞株，HCCLM3和MHCC97-H具有高轉(zhuǎn)移潛能，MHCC97-L具低轉(zhuǎn)移潛能[31-32]；Huh-7細(xì)胞細(xì)胞源自一個(gè)日本男性高分化肝癌細(xì)胞，能產(chǎn)生一些細(xì)胞質(zhì)蛋白，如白蛋白、a抗胰蛋白酶，AFP陽(yáng)性，高度分化，乙型肝炎病毒(HBV)陰性，易感丙型肝炎病毒(HCV)，廣泛用于異種移植，研究HCV與HCC間關(guān)系[33]；PLC/PRF/5稱為人肝癌亞歷山大細(xì)胞，HCC屬，可能包含全部HBV基因組，一般用來(lái)研究HBV體外病毒與HCC間關(guān)系[34]。

3.2 動(dòng)物源性肝癌細(xì)胞株 H22(Hepatoma 22)肝癌細(xì)胞是小鼠的肝細(xì)胞腫瘤，是由亞氨基偶氮甲苯(OAAT)誘發(fā)通過(guò)皮下傳代的實(shí)體瘤，1963年引入我國(guó)并作為腹水瘤(Hca、HAC、Hepa)長(zhǎng)期保存[35]；Hca-F是從腹水型H22細(xì)胞株中篩選出來(lái)的特異性向淋巴道轉(zhuǎn)移的小鼠肝癌細(xì)胞，一般多用來(lái)轉(zhuǎn)移性肝癌模型的構(gòu)建；Hepa 1-6，鼠肝癌細(xì)胞，體外培養(yǎng)形態(tài)特征上皮樣貼壁生長(zhǎng)，來(lái)自C57/L小鼠中引發(fā)的BW7756肝癌，AFP陽(yáng)性、產(chǎn)生α1抗胰蛋白酶、淀粉酶；S-180小鼠肉瘤細(xì)胞，一般先經(jīng)腹腔傳代培養(yǎng)再進(jìn)行細(xì)胞移植。Walker-256肝癌細(xì)胞是將大鼠乳腺癌細(xì)胞接種到肝臟成瘤保種傳代制作，多移植于Wistar或SD大鼠，一般應(yīng)用于腫瘤學(xué)基礎(chǔ)研究和細(xì)胞傳代[36]，因?yàn)槠淠茌^好的模擬腫瘤的浸潤(rùn)發(fā)展和膨脹式生長(zhǎng)，被廣泛認(rèn)可[37]。兔VX2細(xì)胞系于1940年建株保存，來(lái)源于兔鱗狀上皮細(xì)胞癌，該癌株在兔同種腋窩下移植成瘤率接近100%，其顯著特點(diǎn)是在侵襲時(shí)，多種基質(zhì)金屬蛋白高表達(dá)，是一種優(yōu)良的轉(zhuǎn)移模型[38]。

4 不同種屬肝癌移植模型的建立策略

4.1 小鼠移植模型 采用品系主要包括：BALB/c小鼠、昆明種小鼠(KM小鼠)。

4.1.1 皮下移植模型：復(fù)蘇H22肝癌細(xì)胞，離心、稀釋，調(diào)節(jié)細(xì)胞至2×106個(gè)/mL，注射入小鼠腹腔內(nèi)，傳代培養(yǎng)，取第2代后腹水，稀釋細(xì)胞至1×107個(gè)/mL，用注射器抽取0.2 mL細(xì)胞懸液，接種到小鼠的右腋窩皮下成瘤[39]。

4.1.2 原位移植模型 原位移植的前期培養(yǎng)和傳代與皮下移植模型相同，獲得細(xì)胞懸液后備用。移植模型術(shù)前禁食10 h、禁水4 h，可用4%水合氯醛或者2%戊巴比妥進(jìn)行麻醉，仰臥保定，常規(guī)剪毛、消毒，于上腹劍突下逐層剪開(kāi)1 cm切口，輕壓兩側(cè)肋弓，小鼠肝左葉暴露，以與肝平面20 °進(jìn)針0.5 cm左右，注入0.05 mL懸液，輕壓針眼5 min以上，為防止漏液也可用燒紅的鐵絲封閉針眼，確定穩(wěn)定后，還納腹腔，逐層縫合，消毒術(shù)閉[40]。

4.2 裸鼠移植模型 裸小鼠(Nude mice)是一種先天無(wú)毛小鼠，最早由Flanagan于1966年發(fā)現(xiàn)，之后于1969年被Rygaard和Pocvlsen通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其胸腺先天發(fā)育不良[41]，免疫功能缺陷，缺少T細(xì)胞，因此在移植方面成功率更高，自1976年Shimosato首次建立了裸鼠人癌移植模型后[42]，國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后建立了裸鼠皮下、原位、腹腔等移植模型均獲成功[43]。但該類模型具有一定局限性：據(jù)研究表明，針對(duì)HCC患者，采用基因生物免疫療法有可能成為治療的最佳方案之一，但裸小鼠由于自身免疫機(jī)能缺陷，不適用于此類模型的構(gòu)建[11]。當(dāng)前品系主要選擇BALB/c裸小鼠。性別選擇方面有研究報(bào)道：人肝癌細(xì)胞HepG2接種于雄性和雌性裸小鼠右側(cè)肩部皮下后，雄性移植瘤增長(zhǎng)速度快于雌性鼠，考慮可能是雌性鼠體內(nèi)的雌激素發(fā)揮了抑癌作用，所以在移植試驗(yàn)中一般選擇雄性裸鼠[44]。裸鼠移植HepG2模型的建立一般先將細(xì)胞株體外培養(yǎng)傳代，然后進(jìn)行移植，可以采用新鮮的瘤塊組織或者濃縮的瘤細(xì)胞，原位和異位移植的操作方法同小鼠模型。

4.3 大鼠移植模型 由表1可見(jiàn)，大鼠一般采用誘發(fā)性致癌以研究原發(fā)性肝癌的致病機(jī)理。用于移植的大鼠品系一般采用Wistar大鼠、SD大鼠或者Lewis大鼠，瘤株為Walker-256，移植位點(diǎn)一般為原位移植。一種方法是瘤塊嵌插法：先將濃度為1×107個(gè)/mL細(xì)胞的Walker-256瘤株1 mL注入頸部皮下，待皮下移植瘤長(zhǎng)至1 cm時(shí)，麻醉取出，在Hank′s液中切成1 mm3碎塊，取其中1塊，在40 min內(nèi)經(jīng)劍突下腹部開(kāi)腹，植入肝葉實(shí)質(zhì)內(nèi)，壓迫止血關(guān)腹，據(jù)報(bào)道移植成功率可達(dá)100%[45]；另外一種方法為直接注射法，Walker-256瘤株經(jīng)常規(guī)復(fù)蘇后經(jīng)腹腔傳代培養(yǎng)，抽取癌性腹水5 mL，清洗、離心后取下層稀糊狀液體，調(diào)整濃度為3×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液備用，大鼠禁食12 h，以2%戊巴比妥40 mg/kg·bw腹腔注射麻醉，仰臥位保定、剪毛、消毒，無(wú)菌條件下沿劍突下剪開(kāi)腹壁2 cm，輕壓胸腔暴露肝臟，術(shù)者左手食指、中指輕夾肝葉，拇指按壓邊緣以減少肝葉隨呼吸的上下運(yùn)動(dòng)，針頭于肝臟成30 °刺入肝臟約0.5 cm，注入0.05 mL懸液，按壓后還納腹腔，逐層關(guān)閉[46]。

4.4 家兔移植模型 以傳統(tǒng)應(yīng)用最多的通過(guò)外科手術(shù)建立VX2家兔移植模型為例：一般采用耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉(1%，3 mL/kg·bw)，麻醉后以仰臥狀態(tài)保定，于劍突下腹部剪毛，裸露表皮消毒，逐層沿中央縱行切開(kāi)腹壁3 cm，牽拉肝左葉使之暴露，緩慢注入濃度為1×107個(gè)/mL的VX2細(xì)胞懸浮液1 mL，無(wú)菌紗布按壓至無(wú)細(xì)胞懸浮液外流后還納肝臟，逐層關(guān)閉縫合，術(shù)后7 d連續(xù)于耳緣靜脈注射頭孢曲松鈉20 mg/kg·bw·d預(yù)防感染[29]。隨著影像學(xué)的發(fā)展和應(yīng)用，借助經(jīng)皮肝穿刺膽道造影(PTC)、MR、CT等技術(shù)引導(dǎo)，一方面制作肝臟家兔模型更為精確便捷；另一方面還可在手術(shù)難以操作的位點(diǎn)移植[16,19]。