吳慧娜 孫付勝 劉清文 戎中錄 張紀(jì)東 高陽 李永福 常斐

耐藥結(jié)核病尤其是耐一線抗結(jié)核藥物異煙肼(INH)和(或)利福平(RFP)的結(jié)核病對(duì)結(jié)核病控制工作提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。因此，采用更加快速和準(zhǔn)確的檢測方法來檢測結(jié)核分枝桿菌(MTB)的耐藥性，特別是針對(duì)RFP和INH的耐藥性檢測，對(duì)于患者的有效治療至關(guān)重要。比例法藥物敏感性試驗(yàn)(DST)是目前檢測一線抗結(jié)核藥物對(duì)MTB耐藥性的金標(biāo)準(zhǔn)，主要基于適合MTB生長的羅氏固體培養(yǎng)基(L?wenstein-Jenden，L-J)和BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)基(簡稱“MGIT液體培養(yǎng)基”)接種培養(yǎng)。由于MTB生長緩慢[1]，這些方法耗時(shí)較長(MGIT液體培養(yǎng)基耗時(shí)約為14 d，L-J羅氏固體培養(yǎng)基耗時(shí)約為28 d)，導(dǎo)致患者診斷和治療的延誤，錯(cuò)過最佳治療時(shí)間。

熒光PCR探針熔解曲線法(簡稱“探針熔解曲線法”)耐藥突變檢測是利用多色探針熔解曲線分析技術(shù)針對(duì)MTB耐藥基因是否發(fā)生突變所建立的方法。該方法的檢測原理是通過監(jiān)測針對(duì)特定耐藥基因設(shè)計(jì)的熒光標(biāo)記探針，在PCR擴(kuò)增后的熔解分析中是否發(fā)生熔點(diǎn)變化來判斷探針覆蓋區(qū)域是否發(fā)生基因突變。由于可以采用多色熒光標(biāo)記，可以在一個(gè)PCR反應(yīng)中設(shè)計(jì)多條探針，達(dá)到多重檢測的目的；具有簡便快速、覆蓋位點(diǎn)全面等特點(diǎn)。本研究對(duì)臨床分離的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)菌株進(jìn)行RFP和INH的耐藥性檢測，評(píng)價(jià)該方法用于實(shí)驗(yàn)室診斷耐藥結(jié)核病的價(jià)值。

資料和方法

一、研究對(duì)象

2015年1月至2018年7月，由菏澤市各縣(區(qū))結(jié)核病防治所通過中國疾病預(yù)防控制信息系統(tǒng)上報(bào)883例肺結(jié)核和耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)患者，并將患者痰標(biāo)本送至山東省菏澤市傳染病醫(yī)院。所有痰標(biāo)本按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[2]的操作程序進(jìn)行處理。收集其中萋-尼染色結(jié)果為陽性的結(jié)核病患者的痰標(biāo)本共215份(例)進(jìn)行分離培養(yǎng)，污染5株(例)，培養(yǎng)陰性8株(例)，獲得陽性菌株202株(例)。202株(例)分離培養(yǎng)菌株經(jīng)菌種鑒定有2株(例)為非結(jié)核分枝桿菌(NTM)，200株(例)為MTBC。

二、研究方法

1. 分離培養(yǎng)：對(duì)涂陽痰標(biāo)本按照文獻(xiàn)[2]的操作方法進(jìn)行分離培養(yǎng)，培養(yǎng)基為改良羅氏酸性培養(yǎng)基，由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供。

2. 分枝桿菌鑒定及DST：培養(yǎng)陽性產(chǎn)物按照文獻(xiàn)[2]的操作方法進(jìn)行MTBC鑒定和比例法耐RFP和(或)INH的DST，MTBC鑒定使用對(duì)硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基(500 μg/ml)、RFP藥敏培養(yǎng)基(50 μg/ml)和INH藥敏培養(yǎng)基(1 μg/ml)，均由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供。

3. 探針熔解曲線法：經(jīng)鑒定為MTBC的菌株采用探針熔解曲線法(結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測試劑盒和結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥突變檢測試劑盒；均為廈門致善生物科技股份有限公司提供)檢測RFP和INH的耐藥性，實(shí)驗(yàn)操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

4. 質(zhì)量控制：山東省菏澤市傳染病醫(yī)院檢驗(yàn)科每年培養(yǎng)的污染率均低于5%，DST已通過國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室組織的熟練度測試。探針熔解曲線法操作按照說明書的要求，嚴(yán)格進(jìn)行質(zhì)量控制。

5. 不一致的結(jié)果分析：對(duì)于探針熔解曲線法與DST檢測結(jié)果不一致的標(biāo)本進(jìn)行測序，引物序列如下：rpoBF(5′-GCGTCGGTCGCTATAAGGT-3′)/R(5′-ACGGGTGCACGTCGCG-3′);katGF(5′-CACACTTTCGGTAAGACCCA-3′)/R(5′-GAA-ACTGTTGTCCCATTCG-3′);mabA-inhAF(5′-CGCTGCCCAGAAAGGGA-3′)/R(5′-TCCTCCGGTAACCAGGACTC-3′);oxyR-ahpCF(5′-ACTGCTGAACCACTGCTTTGC-3′)/R(5′-TGATCG-CCAATGGTTAGCAG-3′)。在ABI 3730自動(dòng)DNA測序儀上對(duì)擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物進(jìn)行測序，并與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比較。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以DST檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算探針熔解曲線法的敏感度、特異度及其95%置信區(qū)間(CI)和符合率；并進(jìn)行一致性分析(Kappa檢驗(yàn))。本研究統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用MedCalc 11.4.2軟件進(jìn)行計(jì)算。Kappa值≥0.60認(rèn)為兩者有較高的一致性[3]。

結(jié) 果

一、菌種鑒定和DST

200株(例)MTBC分離株DST結(jié)果顯示，110株(例)耐RFP(10株單耐RFP)，144株(例)耐INH(44株單耐INH)。

二、探針熔解曲線法檢測

以DST檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，探針熔解曲線法檢測RFP耐藥的敏感度、特異度和符合率分別為96.4%(95%CI：90.7%～98.9%)、80.0%(95%CI：70.5%～87.1%)和89.0%；一致性分析結(jié)果顯示，Kappa=0.78(表1)。

以DST檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，探針熔解曲線法檢測INH耐藥的敏感度、特異度和符合率分別為85.4%(95%CI：78.6%～90.7%)、96.4%(95%CI：87.7%～99.6%)和88.5%；一致性分析結(jié)果顯示，Kappa=0.74(表2)。

三、不一致結(jié)果分析

在對(duì)RFP的耐藥性檢測中，200株(例)MTBC分離株中有22株(例)DST和探針熔解曲線法檢測結(jié)果不一致：其中有18株(例)分離株DST檢測結(jié)果為對(duì)RFP敏感，但是探針熔解曲線法檢測到耐藥基因突變，測序結(jié)果顯示上述標(biāo)本在檢測的基因區(qū)域均發(fā)生了突變；另有4株(例)DST檢測為對(duì)RFP耐藥，經(jīng)探針熔解曲線法檢測為敏感，測序結(jié)果顯示這4株(例)在檢測的基因區(qū)域均未發(fā)生突變。表型DST和探針熔解曲線法之間的總體符合率為89%(178/200；95%CI：83.5%～92.7%)。

在INH耐藥性檢測中，200株(例)MTBC分離株中的23株DST和探針熔解曲線法檢測結(jié)果不一致。其中2株(例)分離株為DST敏感，但是通過探針熔解曲線法檢測到突變，后續(xù)的基因測序證實(shí)了這2株(例)分離株分別在katG315密碼子和ahpC啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生了突變，而另外21株(例)被DST檢測為INH耐藥的分離株，探針熔解曲線法未檢測到耐藥突變，后續(xù)的基因測序也證實(shí)了在試劑盒上述檢測區(qū)域未發(fā)生基因突變(表4)。

討 論

一、分子藥敏試驗(yàn)檢測方法簡介

近年來，分子藥敏試驗(yàn)檢測方法由于具有簡便、快速及檢測結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到臨床的認(rèn)可。目前有幾種基于核酸擴(kuò)增的商業(yè)診斷試劑盒。其中GeneXpert?MTB/RIF(美國Cepheid公司)是一種實(shí)時(shí)半定量PCR檢測方法，直接使用痰樣本來檢測MTB和RFP耐藥性基因突變；INNO-LiPA Rif.TB(比利時(shí)Fujirebio公司)和GenoType MTBDRplus(德國Hain Lifescience公司)基于反向印跡雜交探針的線性探針測定，用于快速診斷MDR-TB[5-8]。本研究采用探針熔解曲線法檢測了MTBC對(duì)RFP和INH的耐藥性，依據(jù)本研究結(jié)論及臨床操作總結(jié)，筆者認(rèn)為其具有以下特點(diǎn)：(1)檢測快速、通量高，對(duì)臨床分離株培養(yǎng)物樣品檢測可在3 h內(nèi)完成；(2)操作簡便，PCR與熒光探針雜交可在同一反應(yīng)體系內(nèi)實(shí)時(shí)進(jìn)行，不需要PCR擴(kuò)增后的雜交過程；(3)PCR與熒光探針雜交在同一反應(yīng)體系內(nèi)閉管進(jìn)行，不易造成實(shí)驗(yàn)室樣品間PCR擴(kuò)增子的交叉污染；(4)檢測結(jié)果陰性、陽性可通過熔解曲線熔點(diǎn)進(jìn)行判定，結(jié)果分析客觀，易判定。

表1 以DST為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)探針熔解曲線法檢測MTBC(200株)對(duì)RFP耐藥性的效能

注DST：藥物敏感性試驗(yàn)；敏感度(%)=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度(%)=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；符合率(%)=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù)+真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；Kappa=(p0-pe)/(1-pe)，p0為實(shí)際一致性，pe為理論一致性； 95%CI值的計(jì)算方法見參考文獻(xiàn)[4]

表2 以DST為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)探針熔解曲線法檢測MTBC(200株)對(duì)INH耐藥性的效能

注DST：藥物敏感性試驗(yàn)；敏感度(%)=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度(%)=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；符合率(%)=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù)+真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；Kappa=(p0-pe)/(1-pe)，p0為實(shí)際一致性，pe為理論一致性； 95%CI值的計(jì)算方法見參考文獻(xiàn)[4]

表3 基因測序與兩種技術(shù)檢測RFP耐藥性結(jié)果不一致菌株的比較

注S：敏感；R：耐藥

表4 基因測序與兩種技術(shù)檢測INH耐藥性結(jié)果不一致菌株的比較

注S：敏感；R：耐藥

二、探針熔解曲線法檢測RFP耐藥突變基因的評(píng)價(jià)

MTB 對(duì)RFP的耐藥性是由RNA聚合酶的β-亞基突變引起的，RNA聚合酶是rpoB基因編碼的RFP靶標(biāo)[1]。現(xiàn)有的研究表明，rpoB基因中一段 長81個(gè)堿基的核心區(qū)域[編碼507～533位，共27個(gè)氨基酸的密碼子；又稱為RFP耐藥決定區(qū)(RRDR)]，當(dāng)RRDR發(fā)生突變時(shí)，使RNA聚合酶β亞單位的結(jié)構(gòu)改變，RFP不能與細(xì)菌RNA聚合酶β亞單位結(jié)合，而出現(xiàn)耐藥[9]。超過95%的RFP抗性分離株在rpoB基因的81 bp熱點(diǎn)區(qū)域內(nèi)具有突變[3]，密碼子516、526和531[9]是最常見的突變。本研究采用探針熔解曲線法的RFP耐藥突變檢測試劑，采用4條探針覆蓋了rpoB基因507～533位核苷酸密碼子，能檢測該區(qū)域所有位點(diǎn)的突變。在研究中，大部分RFP抗性分離株在RRDR區(qū)域中具有突變。關(guān)于RFP抗性檢測，探針熔解曲線法顯示出與先前研究相似的敏感度和特異度；對(duì)于AnyplexTMⅡ MTB/MDR/XDR測定法(韓國Seegene 公司)敏感度和特異度分別為97%和100%[10]；GenoType MTBDRplus測定法敏感度和特異度分別為93.5%～98%和99%[11-13]；國內(nèi)報(bào)道GeneXpert?MTB/RIF分子診斷系統(tǒng)檢測以痰涂片、痰培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)的敏感度和特異度分別為93.27%、91.93%和91.60%、95.55%[14]，與DST相比，探針熔解曲線法對(duì)RFP耐藥性檢測的特異度僅為80.0%，低于此前的文獻(xiàn)報(bào)道[15]。分析可能的影響因素為：首先，推測樣本選擇偏差可能是主要原因。本研究大部分樣本來自已經(jīng)確診為結(jié)核病的患者，甚至一部分已經(jīng)確認(rèn)為MDR-TB患者，相對(duì)較少的真陰性標(biāo)本可能會(huì)導(dǎo)致特異度的波動(dòng)；其次，由于本研究采用的是羅氏固體培養(yǎng)基，敏感度和特異度均低于相同條件下的MGIT液體培養(yǎng)方法，可能是由于液體培養(yǎng)的前處理液采用的是較低濃度NaOH溶液處理痰標(biāo)本，以及離心集菌的前處理方法，因而增加了對(duì)菌量較少標(biāo)本的陽性檢出率。故推薦有條件的實(shí)驗(yàn)室行分枝桿菌分離培養(yǎng)時(shí)盡可能采用液體培養(yǎng)的方法[16]，以提高陽性率。DST和探針熔解曲線法系統(tǒng)對(duì)RFP檢測結(jié)果不一致的18株(例)分離株經(jīng)序列分析證實(shí)確實(shí)存在突變，特別是部分位點(diǎn)，如rpoB531和526位點(diǎn)，是公認(rèn)的耐藥突變位點(diǎn)。因此，筆者推測DST結(jié)果可能存在問題，可能是由于技術(shù)錯(cuò)誤或分析準(zhǔn)確性造成的。另外，這18株(例)存在突變的不一致樣本中出現(xiàn)了2株(例)rpoB511位點(diǎn)突變。該位點(diǎn)突變可能與RFP低度耐藥相關(guān)，有研究表明對(duì)比例法或絕對(duì)濃度法敏感的某些菌株可能已出現(xiàn)RFP低度耐藥，應(yīng)用探針熔解曲線法檢測rpoB基因511位點(diǎn)突變則可以發(fā)現(xiàn)此類菌株，給臨床治療以提示[17]。

三、探針熔解曲線法檢測INH耐藥突變基因的評(píng)價(jià)

katG315密碼子，inhA啟動(dòng)子的-15和-8位點(diǎn)及ahpC啟動(dòng)子區(qū)域的-6～-47位點(diǎn)的突變可覆蓋80%～90%的INH耐藥性菌株。本研究中DST和探針熔解曲線法系統(tǒng)對(duì)INH檢測結(jié)果不一致的23株(例)分離株經(jīng)序列分析，有1例突變位點(diǎn)是katG315 AGC-ACC，1例在ahpC啟動(dòng)子區(qū)域-46位點(diǎn)發(fā)生突變。其余21例分離株經(jīng)探針熔解曲線法系統(tǒng)檢測未發(fā)生突變，經(jīng)測序證實(shí)在試劑盒檢測范圍內(nèi)也不存在突變。因此，推測是發(fā)生了檢測范圍外的突變，或者是其他機(jī)制所導(dǎo)致的耐藥，尚需要進(jìn)一步的研究來解決這些患者中未定義的基因和許多潛在的機(jī)制。

四、探針熔解曲線法優(yōu)缺點(diǎn)及局限性

筆者推測，由于比例法對(duì)DST中接種量進(jìn)行了校準(zhǔn)，它采用了兩種菌液濃度(10-2mg/ml和10-4mg/ml)，通過計(jì)算活性單位的比值進(jìn)行判斷，使結(jié)果更加精準(zhǔn)。比例法DST將1%耐藥百分比(耐藥百分比=耐藥培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)/空白培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù))定義為“敏感”和“耐藥”的臨界點(diǎn)[18]，而現(xiàn)在的分子檢測方法，包括Sanger測序法，通常需要20%以上的耐藥型比例才能檢測出。尤其是對(duì)于異質(zhì)性耐藥的患者標(biāo)本(體現(xiàn)細(xì)菌群體從部分耐藥向完全耐藥的微小轉(zhuǎn)變過程中的標(biāo)本)，同時(shí)存在敏感菌和耐藥菌；目前有學(xué)者報(bào)道，采用高通量測序技術(shù)研究了結(jié)核病患者體內(nèi)MTB異質(zhì)性耐藥的發(fā)展過程，發(fā)現(xiàn)在INH耐藥性產(chǎn)生的早期，同一細(xì)菌群體中同時(shí)存在4～5 種與INH耐藥相關(guān)的突變，證實(shí)了異質(zhì)性耐藥的真實(shí)存在[19-20]。這些可能存在的低比例異質(zhì)性耐藥標(biāo)本有可能導(dǎo)致分子檢測方法的漏檢。另外，在某些情況下，筆者認(rèn)為應(yīng)對(duì)多個(gè)平行痰液標(biāo)本進(jìn)行DST。Trauner等[21]研究證實(shí)，即使在24 h內(nèi)不同時(shí)間獲得的3份標(biāo)本也不均勻，并且可能導(dǎo)致不同的抗性譜，作者進(jìn)一步認(rèn)為找到了不恰當(dāng)?shù)闹委熜纬蒑TBC異質(zhì)性的證據(jù)：通過非最佳治療方案的實(shí)施，導(dǎo)致耐藥性克隆的出現(xiàn)。這些克隆可能已經(jīng)存在于宿主MTBC群體內(nèi)不斷產(chǎn)生的遺傳多樣性中。 這種可能性解釋了為什么經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)對(duì)同一藥物具有耐藥性的多克隆在患者體內(nèi)同時(shí)產(chǎn)生的情況。筆者的研究也存在一些局限性，由于僅使用MDR-TB的疑似或確診患者的臨床分離株評(píng)估探針熔解曲線法，無法將較新或既往治療患者的耐藥率與其他可能的MDR-TB易感原因相關(guān)聯(lián)。因此，有必要進(jìn)一步研究，從呼吸道樣本直接檢測MTBC耐藥性的影響，并加大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證研究，同時(shí)結(jié)合患者的臨床信息進(jìn)行分析。

探針熔解曲線法系統(tǒng)允許同時(shí)檢測RFP及INH耐藥性相關(guān)突變。該系統(tǒng)是基于熒光PCR和熔解曲線分析方法的組合，在設(shè)備操作和軟件使用方面具有簡單快速的特點(diǎn)。同時(shí)，該系統(tǒng)的檢測結(jié)果與常規(guī)表型DST試驗(yàn)具有高度的一致性。因此，探針熔解曲線法有望成為臨床檢測MDR-TB的有力工具。

志謝濰坊醫(yī)學(xué)院陳景武教授對(duì)本文統(tǒng)計(jì)學(xué)分析進(jìn)行了悉心指導(dǎo)！