秦 哲 ， 楊亞軍 ， 劉希望 ， 李世宏 ， 孔曉軍 ， 焦增華 ， 郭玉凡 ， 李劍勇

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所 農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室 甘肅省新獸藥工程重點實驗室 ， 甘肅 蘭州 730050 ； 2. 鄭州百瑞動物藥業(yè)有限公司 ， 河南 鄭州 450000)

雙氯芬酸鈉為芳基乙酸類第三代強(qiáng)效非甾體抗炎藥(NSAIDs)，具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱和抗風(fēng)濕作用，與同類藥物相比具有療效好、副作用小、長期應(yīng)用無蓄積性、給藥后吸收迅速、有效血藥濃度維持時間較長等優(yōu)點。在國內(nèi)外獸醫(yī)臨床實踐中，該藥被用于緩解家畜手術(shù)、外傷、關(guān)節(jié)炎等引起的疼痛，以及細(xì)菌感染和其他疾病繼發(fā)感染引起的高熱[1]，受到獸醫(yī)臨床和動保企業(yè)的青睞。國內(nèi)目前已有相關(guān)的注射劑被批準(zhǔn)用于豬[2]，但是暫未批準(zhǔn)用于奶牛。溶血性試驗和主動全身過敏反應(yīng)試驗是評價注射劑安全性的重要檢驗項目[3]。本研究采用體外試管法，觀察試驗24 h內(nèi)5%雙氯芬酸鈉注射液致溶血與紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，評價其溶血性。豚鼠主動全身過敏試驗中通過整體反應(yīng)癥狀判斷過敏反應(yīng)發(fā)生情況及其反應(yīng)程度。為雙氯芬酸鈉注射液的臨床前安全性評價提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 雙氯芬酸鈉注射液(中試產(chǎn)品)，規(guī)格10 mL∶0.5 g，批號：20150826；注射液空白溶劑，鄭州百瑞動物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；牛血清白蛋白，生工生物工程(上海)股份有限公司，LJ0525B10011。

1.2 儀器與設(shè)備 ME235S分析天平，德國賽多利斯公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；MULTIFUGE X3R離心機(jī)，美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 實驗動物 普通級雌性日本大耳白兔1只，體重2.5 kg；SPF級雄性Dunkin-Hartley豚鼠60只，體重300～400 g，實驗動物購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(甘)2010-0001。

1.4 溶血性試驗

1.4.1 紅細(xì)胞混懸液的制備 采用常規(guī)方法制備2%兔血紅細(xì)胞混懸液。

1.4.2 受試藥物的制備 用0.9%氯化鈉溶液1∶3稀釋雙氯芬酸鈉注射液作為供試品溶液。

1.4.3 溶血性試驗 潔凈試管21支，分7組，各組均加入2%兔紅細(xì)胞混懸液2.5 mL。1～5組分別加入供試品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，6組為陰性對照組，1～6組用生理鹽水補(bǔ)足5 mL。7組為陽性對照組，加入蒸餾水2.5 mL。輕輕混勻反應(yīng)液，置37 ℃水浴中孵育。觀察并記錄0、0.5、1、2、3、24 h溶血與凝集現(xiàn)象。試驗結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：紅細(xì)胞全部下沉，上層液無色澄明，判定為無溶血；溶液澄明呈紅色或棕紅色，管底有少量紅細(xì)胞殘留，判定為部分溶血；紅色溶液澄明，管底無紅細(xì)胞殘留，判定為全溶血；溶液中有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，搖勻后不分散，判定為紅細(xì)胞凝聚。若藥液0.3 mL在0.5 h 內(nèi)引起溶血即不宜作靜脈注射用[3-6]。

1.5 主動全身過敏反應(yīng)試驗

1.5.1 致敏試驗 雙氯芬酸鈉注射液對奶牛的臨床用藥量為2.2 mg/kg·bw，經(jīng)體表面積折算，豚鼠的臨床等效用藥量為28.15 mg/kg·bw[7]。本試驗中雙氯芬酸鈉注射液給藥劑量分別為50、25、12.5、6.25、3.125 mg/kg·bw。陽性對照組給予10%牛血清白蛋白-生理鹽水溶液0.5 mL/只。陰性對照組給予注射液空白溶劑。腹腔注射給藥，隔日1次，共3次[6]。

1.5.2 激發(fā)試驗 豚鼠于末次致敏后第14、21天，以2倍致敏劑量于股四頭肌快速注射進(jìn)行兩次激發(fā)。觀察動物反應(yīng)3 h，致敏期間每日觀察動物癥狀。

1.5.3 結(jié)果判定 豚鼠全身致敏性評價標(biāo)準(zhǔn)[3,6]：“-”，過敏反應(yīng)陰性(癥狀：正常)；“+”，過敏反應(yīng)弱陽性(癥狀：躁動、豎毛、顫抖、搔鼻)；“+ +”，過敏反應(yīng)陽性(癥狀：噴嚏、咳嗽、呼吸急促、排尿、排糞、流淚)；“+ + +”，過敏反應(yīng)強(qiáng)陽性(癥狀：呼吸困難、哮鳴音、紫癜、步態(tài)不穩(wěn)、跳躍、喘息、痙攣、旋轉(zhuǎn)、潮式呼吸)；“+ + + +”，過敏反應(yīng)極強(qiáng)陽性(癥狀：死亡)。計算過敏反應(yīng)發(fā)生率，結(jié)合癥狀發(fā)生程度進(jìn)行綜合判斷。

2 結(jié)果

2.1 溶血性試驗 試驗結(jié)果顯示，反應(yīng)加液完畢后，7組即出現(xiàn)完全溶血現(xiàn)象，其他各組均為紅色不透亮液體；37 ℃水浴孵育0.5 h，5組呈現(xiàn)完全溶血現(xiàn)象；水浴孵育1 h， 4組呈現(xiàn)完全溶血現(xiàn)象；水浴孵育2 h，3組呈現(xiàn)完全溶血現(xiàn)象；水浴孵育3 h，2組呈現(xiàn)部分溶血現(xiàn)象，為紅色不透亮液體，管底有紅細(xì)胞沉淀，與生理鹽水對照組一致。4 ℃靜置過夜，1、6組上層溶液無色透明，紅細(xì)胞全部沉積到管底，振搖可分散，顯微鏡下觀察紅細(xì)胞均為單個分離，發(fā)亮，形態(tài)飽滿。其他各組均呈完全溶血現(xiàn)象，為紅色透亮液體，管底無紅細(xì)胞沉淀。各組均無紅細(xì)胞凝聚現(xiàn)象。試驗結(jié)果表明，該藥物可導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解，不宜用作靜脈注射。

2.2 主動全身過敏反應(yīng)試驗

2.2.1 致敏藥物劑量篩選試驗 試驗結(jié)果顯示，將10% BSA溶液以1 mL/kg·bw腹腔注射豚鼠進(jìn)行3次致敏，沒有出現(xiàn)死亡情況。藥物劑量6.25、12.5 mg/kg·bw動物死亡率均為50%，藥物劑量25 mg/kg·bw動物死亡率為83.3%，藥物劑量50 mg/kg·bw動物死亡率為100%，藥物劑量3.125 mg/kg·bw，在觀察期內(nèi)豚鼠采食飲水、行為活動、呼吸、排便等一般狀況良好，未見全身不良反應(yīng)，無死亡現(xiàn)象。故確定該劑量為豚鼠主動全身過敏反應(yīng)試驗致敏劑量，并以該劑量作為陰性對照組的致敏劑量(0.0625 mL/kg·bw)。

2.2.2 豚鼠主動全身過敏反應(yīng)試驗 按照預(yù)試驗篩選出的藥物致敏劑量進(jìn)行豚鼠致敏，分別于末次致敏后第14、21天，股四頭肌注射相應(yīng)劑量藥物激發(fā)，觀察3 h。豚鼠行為學(xué)觀察結(jié)果顯示，陰性對照組和藥物組的豚鼠均表現(xiàn)為安靜正常，未出現(xiàn)躁動、豎毛、搔鼻、顫抖、噴嚏、咳嗽、呼吸急促等癥狀，過敏反應(yīng)發(fā)生率均為0。而BSA組中有2只豚鼠可見明顯的抓鼻、顫抖、噴嚏、潮式呼吸、哮鳴音等一過性過敏反應(yīng)，過敏反應(yīng)發(fā)生率為33.3%。依據(jù)全身性致敏評價標(biāo)準(zhǔn)，BSA組的豚鼠呈過敏反應(yīng)陽性，過敏反應(yīng)程度為++。兩次激發(fā)結(jié)果顯示，出現(xiàn)過敏反應(yīng)的豚鼠數(shù)量和反應(yīng)程度均基本一致。

3 討論

注射劑和可能引起免疫性溶血或非免疫性溶血反應(yīng)的其他藥物制劑均應(yīng)進(jìn)行溶血性試驗[6]。已有研究表明，雙氯芬酸鈉對低滲[8]、2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽介導(dǎo)的過氧化應(yīng)激[9]導(dǎo)致的紅細(xì)胞溶解有較好的抑制作用，說明雙氯芬酸鈉沒有溶血性。但是由于雙氯芬酸鈉在水中的溶解度較小，達(dá)不到劑量設(shè)計濃度要求。同時，雙氯芬酸鈉分子結(jié)構(gòu)中含有易被氧化的羧酸基團(tuán)，在注射液中穩(wěn)定性較差，因此在制劑中需添加增溶或提高穩(wěn)定性的成分[10]。研究報道，雙氯芬酸鈉滴眼液溶血性較強(qiáng)是由于藥物中含有的聚氧乙烯(35)蓖麻油所致[11]。本試驗采用常規(guī)體外試管法檢測評價雙氯芬酸鈉注射液的溶血性[12]。試驗結(jié)果表明，雙氯芬酸鈉注射劑稀釋液在低濃度(0.1 mL)下不會導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解，但是在較高濃度下可導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解，且隨著藥物濃度增加，溶解紅細(xì)胞作用速度加快，溶血程度增強(qiáng)，因此該注射液不宜用作靜脈注射。

雙氯芬酸鈉通過與環(huán)氧化酶(COX)結(jié)合，阻斷花生四烯酸向前列腺素E2的轉(zhuǎn)化。同時可促進(jìn)花生四烯酸與甘油三酯結(jié)合，降低細(xì)胞內(nèi)游離的花生四烯酸濃度[12]，間接抑制白三烯的合成[13]。進(jìn)而對各種發(fā)熱性、炎性疼痛性疾病發(fā)揮治療作用。然而，雙氯芬酸鈉對COX的作用為非選擇性抑制，其對COX-1的抑制作用能夠激發(fā)機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答，這也是其引起過敏反應(yīng)的重要原因之一[14]。調(diào)查研究表明，在眾多NSAIDs口服藥物中雙氯芬酸類藥物引起過敏反應(yīng)的比率最高[15]。本試驗結(jié)果顯示，雙氯芬酸鈉注射液不會引起豚鼠的主動全身過敏反應(yīng)。陽性對照組豚鼠的過敏反應(yīng)發(fā)生率為33.3%，過敏反應(yīng)程度為++。對比第14天和第21天激發(fā)結(jié)果出現(xiàn)過敏反應(yīng)的豚鼠數(shù)量一致，程度未見增強(qiáng)。本試驗中由于雙氯芬酸鈉注射液具有較強(qiáng)的溶血性，故沒有通過靜脈注射激發(fā)過敏反應(yīng)，而是參考藥物的臨床給藥方式，采用肌肉注射進(jìn)行激發(fā)。試驗結(jié)果的差異性是否與激發(fā)途徑有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

雙氯芬酸鈉注射液不會引起豚鼠主動全身過敏反應(yīng)，但在一定程度上可導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解，不宜用作靜脈注射。