劉玉東 甄娟 韓曉麗

喉癌是僅次于肺癌的第二位常見呼吸道惡性腫瘤，喉鱗狀細(xì)胞癌是其最常見的組織學(xué)類型，發(fā)病率逐年遞增。目前喉鱗狀細(xì)胞癌的治療以手術(shù)為主，放化療為輔，盡管取得了較大進(jìn)展，但是晚期喉鱗狀細(xì)胞癌患者由于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的原因病死率仍較高，患者生存率在過去的幾十年并未顯著改善。臨床大量數(shù)據(jù)表明，治療早晚對(duì)患者的預(yù)后有重要影響［1-2］。因此，針對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)估的研究日益重要，喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生及進(jìn)展的促癌因子和與預(yù)后相關(guān)的新的生物學(xué)指標(biāo)，在診治和評(píng)估患者預(yù)后的同時(shí)有助于制定更科學(xué)合理的綜合治療方案。有研究［3-6］報(bào)道E3泛素連接酶SIAH2可作為癌基因參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移。有研究［3］提示SIAH2在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)明顯高于正常卵巢組織，與卵巢上皮性癌的組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，高表達(dá)SIAH2的患者5年生存率顯著降低、無瘤生存期明顯縮短，SIAH2是卵巢上皮性癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。然而SIAH2在喉鱗狀細(xì)胞癌中的研究和作用仍然不明，鮮見此標(biāo)志物與喉鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后關(guān)系的報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)和Western blot檢測(cè)SIAH2在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)，分析SIAH2與患者預(yù)后的相關(guān)性，探討SIAH2在喉鱗狀細(xì)胞癌診治和預(yù)后判斷中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2009年1月至2016年12月河北省人民醫(yī)院手術(shù)切除喉標(biāo)本存檔蠟塊119例，其中喉鱗狀細(xì)胞癌57例，不典型增生32例，正常喉組織30例。所有患者術(shù)前均未接受放、化療。57例喉鱗狀細(xì)胞癌患者中男性43例，女性14例；年齡≥60歲31例，＜60歲26例；腫瘤部位：聲門型27例，聲門上型19例，聲門下型6例，跨聲門型5例；組織學(xué)分級(jí)：中高分化33例，低分化24例；臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期35例，Ⅲ+Ⅳ期22例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例。標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，H&E常規(guī)染色后明確診斷。部分標(biāo)本離體后取少量立即放入液氮后-70℃冰箱保存，以備Western blot檢測(cè)，其中癌旁組織為遠(yuǎn)離腫瘤至少1 cm并經(jīng)病理證實(shí)為正常喉組織。所有標(biāo)本的使用均通過本院倫理委員會(huì)審核且患者本人知情同意。

主要試劑：鼠抗人SIAH2抗體購自美國(guó)Santa Cruz公司，β-actin抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。免疫組織化學(xué)S-P檢測(cè)試劑盒、PBS緩沖液、DAB酶底物顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定 組織標(biāo)本經(jīng)中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成4 μm厚度的連續(xù)切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化后，按照免疫組織化學(xué)S-P檢測(cè)試劑盒說明書步驟進(jìn)行SIAH2（1:200）免疫組織化學(xué)染色。PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽性片作陽性對(duì)照。SIAH2判定標(biāo)準(zhǔn)：SIAH2以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性顯色，將陽性細(xì)胞百分比分為5級(jí)：無陽性細(xì)胞0分，≤10%1分，11%～50%2分，51%～80%3分，＞80%4分；細(xì)胞著色強(qiáng)度：無著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分。上述兩分值相乘分?jǐn)?shù)＜3分為陰性，≥3分為陽性。

1.2.2Western blot檢測(cè) 收集新鮮喉組織，加入裂解液充分裂解，粉碎勻漿后，低溫高速離心（4℃，12 000 r/min，40 min），提取蛋白。聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳（4%濃縮膠電壓80伏，12%分離膠電壓120伏），轉(zhuǎn)印，封閉，抗SIAH2（1:200）、抗β-actin（1:200）4℃孵育過夜，二抗（1:6 000）室溫孵育2 h，ECL發(fā)光；拍照，Image J軟件用于半定量分析特異性條帶的光密度值，將目的蛋白與β-actin光密度值作為相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 隨訪 所有喉鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)后進(jìn)行5年定期隨訪，開始時(shí)間為接受手術(shù)的時(shí)間，截止日期為2018年6月31日。采用門診隨訪及電話隨訪，平均每6個(gè)月1次，規(guī)定患者死亡時(shí)間為終止時(shí)間，中途失訪者（刪失者）的終止時(shí)間為最后1次隨訪時(shí)間，亦納入生存分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，SIAH2與喉鱗狀細(xì)胞癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)及Fisher's確切概率法分析，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線及Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析，Cox回歸分析喉鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，定量資料采用One-Way ANOVA分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SIAH2蛋白在喉組織中表達(dá)的定性檢測(cè)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，SIAH2呈核表達(dá)陽性（圖1），在正常喉組織、不典型增生及喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率逐漸升高，分別為26.67%（8/30）、53.13%（17/32）、77.19%（44/57），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.02，P＜0.001）。SIAH2與喉鱗狀細(xì)胞癌的組織學(xué)分級(jí)、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（均P＜0.05，表1）。

圖1 SIAH2在喉組織中的表達(dá)（SP×200）

2.2 SIAH2在喉組織中表達(dá)的定量檢測(cè)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，正常喉組織、不典型增生組織及喉鱗狀細(xì)胞癌組織中SIAH2的相對(duì)表達(dá)量分別為1.25±0.04、1.38±0.05、1.44±0.07；正常喉組織至不典型增生再至喉鱗狀細(xì)胞癌組織中SIAH2表達(dá)量逐漸升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=61.811，P＜0.001，圖2）。

表1 57例喉鱗狀細(xì)胞癌組織中SIAH2表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

圖2 SIAH2在喉組織中的表達(dá)

2.3 生存分析

符合要求（隨訪時(shí)間5年）的34例患者，包括刪失（中途失訪者）4例，納入生存分析。SIAH2陽性表達(dá)患者和陰性表達(dá)患者5年生存率分別為18.18%（4/22）和58.33%（7/12），SIAH2陽性表達(dá)患者總生存率顯著低于陰性表達(dá)患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.720，P=0.017）。SIAH2陽性表達(dá)患者和SIAH2陰性表達(dá)患者5年平均生存時(shí)間分別為29個(gè)月和49個(gè)月，中位生存時(shí)間分別為25個(gè)月和60個(gè)月，SIAH2陽性表達(dá)患者中位生存時(shí)間低于陰性表達(dá)者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.831，P=0.016，圖3）。對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌患者生存時(shí)間的單因素和多因素分析結(jié)果表明，SIAH2表達(dá)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與喉鱗狀細(xì)胞癌的生存時(shí)間相關(guān)（均P＜0.05，表2），SIAH2是喉鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素之一（表3）。

圖3 SIAH2表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌患者累積生存率關(guān)系

表2 喉鱗狀細(xì)胞癌患者總生存率的單因素分析

表3 喉鱗狀細(xì)胞癌患者總生存率的多因素分析

3 討論

喉癌是嚴(yán)重危害人類生命和健康的常見頭頸部惡性腫瘤，其中喉鱗狀細(xì)胞癌占所有喉癌患者的90%以上。目前喉鱗狀細(xì)胞癌的檢測(cè)和預(yù)測(cè)大多基于組織學(xué)分級(jí)和TNM分期系統(tǒng)的研究，臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)腫瘤部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)以及臨床分期等不足以準(zhǔn)確而全面地評(píng)估患者的預(yù)后［7-9］。因此，尋求有效的腫瘤標(biāo)志物對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌的檢測(cè)和預(yù)后評(píng)估具有非常重要的意義。

SIAH家族蛋白是果蠅屬SINA蛋白的同系物。人類有兩個(gè)高度保守同源的SINA，為SIAH1和SIAH2，是由鼠的SIAH cDNA作為探針從人胎兒腦組織克隆而出。SIAH2是一種高度保守的泛素連接酶，與SIAH1有85%的同源性，定位于3q25號(hào)染色體，編碼324個(gè)氨基酸［10］。經(jīng)由RING FINGER區(qū)域參與一些蛋白的泛素化和水解作用，其中SIAH2作用的底物蛋白包括EAF2［11］、Nrf2［12］、CHK2［13］、ATS2［14］等，從而影響細(xì)胞的功能如低氧反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞凋亡及腫瘤發(fā)生等［15］。有研究［10］發(fā)現(xiàn)SIAH1作為腫瘤抑制因子發(fā)揮生物學(xué)作用，盡管SIAH2與SIAH1有85%的同源性，但與SIAH1發(fā)揮的作用完全不同，SIAH2在有增殖能力的細(xì)胞中表達(dá)，而在不增殖的細(xì)胞中表達(dá)缺失。有研究報(bào)道SIAH2在卵巢癌［3］、肺癌［4］、乳腺癌［5-6］等組織中均高表達(dá)，并且隨著腫瘤組織學(xué)分級(jí)和臨床分期的升高其蛋白表達(dá)水平也逐漸升高。推測(cè)SIAH2是作為癌基因在多種惡性腫瘤中發(fā)揮作用。本研究定性和定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中SIAH2蛋白的表達(dá)高于其在不典型增生組織和正常喉組織中的表達(dá)，并且與癌組織學(xué)分級(jí)、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示SIAH2蛋白在喉鱗狀細(xì)胞癌中可能起促進(jìn)作用。

有報(bào)道［3］SIAH2表達(dá)陽性的卵巢上皮性癌患者總生存期和無瘤生存期均低于SIAH2表達(dá)陰性的患者，并且SIAH2是卵巢癌總生存期和無瘤生存期的獨(dú)立影響因素。本研究發(fā)現(xiàn)，SIAH2陽性表達(dá)患者5年生存率明顯低于陰性表達(dá)者，5年中位生存時(shí)間也明顯縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Cox多因素回歸分析結(jié)果也表明，過表達(dá)SIAH2、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響喉鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示SIAH2對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌具有一定的預(yù)后評(píng)價(jià)作用。

綜上所述，SIAH2在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中過表達(dá)，并且與喉鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展和患者不良預(yù)后有關(guān)，推測(cè)SIAH2可能成為喉鱗狀細(xì)胞癌診斷的生物學(xué)標(biāo)志物和治療的藥物靶點(diǎn)，同時(shí)可以作為患者預(yù)后的預(yù)測(cè)因素，研究結(jié)果有待進(jìn)一步證實(shí)。