周昱君，張 泳，黃龍艦，李萍萍，彭 英

(1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京 100050；2. 中國生物技術(shù)發(fā)展中心, 北京 100039)

阿爾茨海默病 (Alzheimer’s disease，AD)屬于神經(jīng)退行性疾病，其主要臨床特征為進(jìn)行性記憶減退和認(rèn)知功能障礙，影響患者生存生活能力，并導(dǎo)致其精神和行為異常。腦部主要病理學(xué)特征為淀粉樣斑的堆積、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡和突觸數(shù)量減少等，在疾病發(fā)展過程中通常不會(huì)出現(xiàn)明顯的臨床癥狀。醫(yī)院確診的AD病人中，約95%為散發(fā)性AD，多為晚發(fā)型AD(late-onset Alzheimer’s disease，LOAD)，疾病發(fā)展情況受遺傳因素與環(huán)境因素等多方面影響，其中載脂蛋白E4 (apolipoprotein E4，ApoE4)是高風(fēng)險(xiǎn)因素。而常染色體顯性遺傳型AD (autosomal dominant inherited Alzheimer’s disease，DIAD)多發(fā)病較早，通常與早老素1基因(PS1)、早老素2基因(PS2)以及淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)有關(guān)[1]。

AD的病因尚不明確，相關(guān)學(xué)說眾多。β-淀粉樣蛋白(amyloid beta-peptides，Aβ)學(xué)說認(rèn)為，AD患者腦部聚集的Aβ神經(jīng)毒性強(qiáng)，可引起腦部炎癥、細(xì)胞凋亡、線粒體功能障礙等一系列效應(yīng)。以Aβ為靶點(diǎn)的藥物主要分為減少Aβ生成、減少Aβ聚合和加速Aβ清除三方面，涉及到β分泌酶抑制劑、γ分泌酶抑制劑、γ分泌酶調(diào)節(jié)劑、α分泌酶激動(dòng)劑以及Aβ抗體和Aβ疫苗等[2]。盡管很多圍繞Aβ學(xué)說展開的臨床試驗(yàn)相繼以失敗告終，但Aβ學(xué)說在發(fā)病機(jī)制的研究中仍占有重要地位。Tau蛋白異常過度磷酸化也是一個(gè)重要的學(xué)說，其異常磷酸化可影響微管的裝配以及穩(wěn)定性，以Tau蛋白為靶點(diǎn)的藥物主要涉及激酶抑制劑，Tau蛋白聚合抑制劑以及微管穩(wěn)定劑等[2]。以信號(hào)通路功能異常為核心的學(xué)說認(rèn)為，AD患者神經(jīng)系統(tǒng)多種信號(hào)通路功能異常，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂。也有研究表明，高脂血癥可加重Aβ對(duì)老年AD大鼠神經(jīng)元的損傷以及Tau蛋白異常過度磷酸化[3]。Reelin屬于分泌型糖蛋白，通過與其受體的相互作用，使細(xì)胞質(zhì)銜接蛋白(Disabled-1, Dab1)磷酸化，進(jìn)而開啟下游信號(hào)通路，早期主要與皮層形成、神經(jīng)細(xì)胞遷移過程相關(guān)，后期起到調(diào)節(jié)突觸功能的作用。近年研究表明，Reelin信號(hào)通路可能與AD的發(fā)病有密切關(guān)系，本文將對(duì)Reelin蛋白的結(jié)構(gòu)功能及其所屬通路在AD發(fā)病機(jī)制中的作用進(jìn)行綜述。

1 Reelin的結(jié)構(gòu)和功能

Reelin是一種大型的分泌型細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，由3 641個(gè)氨基酸殘基組成，人的RELN基因位于7號(hào)染色體。SDS-PAGE凝膠電泳顯示，Reelin有410 ku、330 ku、180 ku以及數(shù)個(gè)低分子量條帶。Reelin含有信號(hào)肽序列，其后是N端序列、鉸鏈區(qū)以及八段氨基酸重復(fù)序列，以高度堿性的C端序列結(jié)束。Reelin在胞外擴(kuò)散過程中可被切割，位點(diǎn)分別在重復(fù)序列2和3(位點(diǎn)N-端)之間，以及在重復(fù)序列6和7(位點(diǎn)C-端)之間，完全切割的Reelin可以產(chǎn)生3個(gè)片段，N端片段(N端到第2個(gè)重復(fù)序列)、中央片段(第3～6段重復(fù)序列)，以及C端片段(第7段重復(fù)序列到C端)。中央?yún)^(qū)域包含載脂蛋白E受體2 (apolipoprotein E receptor 2，ApoER2)和極低密度脂蛋白受體(very low density lipoprotein receptor，VLDLR)的結(jié)合位點(diǎn)，N端區(qū)域主要和Reelin同源二聚體的形成有關(guān)，影響Dab1磷酸化水平[4]。N端區(qū)域還和α3β1整合素等一些受體結(jié)合相關(guān)。另外，C端區(qū)域也會(huì)影響Reelin磷酸化Dab1的能力。

胚胎時(shí)期，Reelin主要由海馬和皮質(zhì)分子層中的Cajal-Retzius(C-R)細(xì)胞合成并分泌。大腦發(fā)育階段，Reelin主要通過控制細(xì)胞間相互作用，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞遷移和定位。在成人大腦中，Reelin分泌水平下降，但依然發(fā)揮重要作用，此時(shí)的Reelin主要由γ-氨基丁酸能中間神經(jīng)元分泌，通過提高對(duì)長時(shí)程增強(qiáng)(long time potentiation，LTP)的誘導(dǎo)效應(yīng)，來調(diào)節(jié)突觸可塑性。Reelin還可調(diào)節(jié)樹突的生長及成熟、神經(jīng)遞質(zhì)釋放等[5]。Reelin缺陷小鼠(Reelin-deficient mice，reeler)樹突分支以及樹突棘減少，雜合reeler小鼠(heterozygousreelermice，HRM)缺失1個(gè)RELN等位基因，Reelin表達(dá)下調(diào)50%，同樣出現(xiàn)樹突分支以及樹突棘輕微減少的情況。但HRM中神經(jīng)元定位不受影響，表明由Reelin缺陷導(dǎo)致的樹突異常與神經(jīng)元定位異常無關(guān)[6]。Reelin對(duì)大腦發(fā)育至關(guān)重要，但ApoER2的另一種配體ApoE缺陷的患者卻具有正常的認(rèn)知功能，這可能與ApoE在小鼠和人類中都在相對(duì)較晚時(shí)期開始表達(dá)有關(guān)。另外有研究表明，reeler小鼠大腦中脂肪酸(fatty acid，F(xiàn)A)組分發(fā)生變化，為發(fā)現(xiàn)Reelin新功能提供了基礎(chǔ)[7]。

2 Reelin的受體及下游信號(hào)通路

Reelin受體包括ApoER2、VLDLR、α3β1整合素等。敲除ApoER2和VLDLR或者Dab1缺失后出現(xiàn)的reeler表型，表明這些分子對(duì)于Reelin正常發(fā)揮功能的必要性。遷移過程中，ApoER2可能與起始信號(hào)相關(guān)，VLDLR則和中止信號(hào)相關(guān)[8]。

ApoER2的選擇性剪接對(duì)Reelin實(shí)現(xiàn)其功能有重要作用。Reelin與ApoER2結(jié)合后，ApoER2可被一系列蛋白酶切割，釋放可溶性胞外結(jié)構(gòu)域(soluble extracellular domain，ECD)。α分泌酶切割產(chǎn)生的C端片段(C-terminal fragments，CTFs)可被γ分泌酶切割，釋放胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(intracellular domain，ICD)，Reelin可誘導(dǎo)這種切割，ApoER2切割片段可負(fù)反饋調(diào)節(jié)Reelin信號(hào)。ApoER2-ECD可以作為ApoER2配體的顯性負(fù)性受體，ApoER2-ICD可以易位至細(xì)胞核并改變基因的轉(zhuǎn)錄，降低Reelin mRNA水平。ApoER2的選擇性剪接可以影響這一系列的切割[6]。

ApoE4是晚發(fā)型AD的主要遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素。ApoE4與ApoER2結(jié)合后，誘導(dǎo)受體降解，并伴隨胞內(nèi)區(qū)室中N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體的螯合[9]。因此，Reelin可競爭性抑制ApoE對(duì)NMDAR和ApoER2的占據(jù)，維持突觸可塑性。ApoER2前mRNA經(jīng)過選擇性剪接可產(chǎn)生兩種形式，含有倒數(shù)第2節(jié)外顯子的ApoER2亞型在突觸相關(guān)信號(hào)通路中為有效亞型，而AD病人與轉(zhuǎn)基因AD小鼠中，有效ApoER2亞型比例均降低，利用反義寡核苷酸改變其選擇性剪接，增加功能性ApoER2/Reelin復(fù)合物的形成，可改善突觸功能[10]。

Reelin與受體結(jié)合，并啟動(dòng)下游轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)系統(tǒng)。Dab1聚集并激活酪氨酸激酶Src和Fyn，導(dǎo)致Dab1磷酸化。Dab1磷酸化可激活下游激酶，包括PI3K及Akt，最終導(dǎo)致糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)在其抑制性Ser-9位點(diǎn)磷酸化，從而抑制GSK-3β活化。Reelin信號(hào)系統(tǒng)有助于突觸形成，通過NMDA受體控制Ca2+進(jìn)入，從而調(diào)節(jié)LTP、突觸傳遞和突觸可塑性，與記憶、認(rèn)知功能密切相關(guān)。磷酸化的Dab1可以引起無腦回綜合癥致病基因產(chǎn)物(lissencephaly protein 1，LIS1)聚集，影響微管動(dòng)力學(xué)等。Reelin還可使絲切蛋白(Cofilin，CFL)磷酸化，穩(wěn)定細(xì)胞骨架。

3 Reelin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與AD的相關(guān)性

Reelin信號(hào)通路在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和維持正常功能中有重要作用，許多神經(jīng)精神障礙，包括阿爾茨海默病、自閉癥、精神分裂癥、雙相情感障礙、抑郁癥等，均有異常的Reelin表達(dá)。有研究報(bào)道，在reeler大鼠和敲除ApoER2/VLDLR的大鼠腦內(nèi)，存在高度磷酸化Tau蛋白。AD小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)淀粉樣蛋白與Reelin表達(dá)水平及ApoER2免疫活性具有關(guān)聯(lián)性[11]。Reelin信號(hào)通路在AD中可起到抑制Aβ的產(chǎn)生、促進(jìn)Aβ的清除、抑制Tau蛋白的高度磷酸化等作用。改變的Reelin表達(dá)被認(rèn)為可以損害神經(jīng)元連接性和突觸可塑性，最終導(dǎo)致認(rèn)知缺陷。研究發(fā)現(xiàn)，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠于6月齡出現(xiàn)淀粉樣斑塊，AD小鼠中Reelin在淀粉樣斑周圍聚積形成斑塊，而非正常的二聚體形式，并且聚積的斑塊隨病情的加重而逐漸增加，進(jìn)而影響Reelin功能的發(fā)揮，Reelin的聚集與老年斑的形成可能密切相關(guān)，而野生型小鼠極少形成Reelin斑塊[12]。

3.1 Reelin與Aβ的相互影響老年斑(senile plaque，SP)是AD發(fā)病的一個(gè)重要病理特征，主要為葡萄糖多聚物以及Aβ、Tau、APP、α-突觸核蛋白等在內(nèi)的多肽類和蛋白質(zhì)。Aβ由39～43個(gè)氨基酸組成，是AD病人腦中發(fā)現(xiàn)的淀粉樣斑塊的主要成分，APP被β和γ分泌酶切割可產(chǎn)生Aβ，Aβ異常聚集時(shí)形成β淀粉樣斑塊。

Aβ可對(duì)Reelin及其所在傳導(dǎo)通路造成損傷。Aβ42存在時(shí)，Reelin不能形成同源二聚體的活性形式，AD患者大腦中的Reelin提取物中含有很多高分子團(tuán)塊，激活A(yù)poER2的能力下降[13]，年齡相仿的對(duì)照組中則具有活性的同源二聚體。Aβ影響Reelin活性，并改變其表達(dá)的具體機(jī)制仍需研究。另外，Reelin的表達(dá)變化情況在AD患者中有較大的差異，有報(bào)道稱，這種差異與ApoE4基因相關(guān)[14]，處于Braak stage晚期且不攜帶ApoE4基因的AD患者，Reelin mRNA水平明顯增加，ApoER2-CTF的水平明顯降低，而攜帶ApoE4基因患者中并未發(fā)現(xiàn)這一改變。推測Aβ通過抑制ApoER2，增加Reelin表達(dá)，為機(jī)體的一種自調(diào)節(jié)機(jī)制。在Aβ存在時(shí)，Reelin以一種高水平卻無效的形式存在，即病理狀態(tài)下，Reelin信號(hào)通路和自我調(diào)節(jié)機(jī)制的失效，而ApoE4攜帶者可能有著不同的Reelin-CTFs平衡。

內(nèi)嗅皮質(zhì)是AD最先發(fā)生病變的地方。有研究證實(shí)，在內(nèi)嗅皮質(zhì)2層中，細(xì)胞內(nèi)Aβ選擇性在Reelin免疫反應(yīng)性細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，與Reelin明顯共同定位于細(xì)胞內(nèi)，提示Reelin和Aβ的結(jié)構(gòu)相關(guān)性。Reelin可與可溶性Aβ42相互作用，從而延緩Aβ纖維形成和募集[15]。Reelin蛋白表達(dá)減少的AD小鼠，則表現(xiàn)出增多的淀粉樣斑塊。

與Reelin相反，Aβ寡聚體在突觸后具有拮抗作用，Aβ結(jié)合受體后，激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，PP2B)，PP2B調(diào)節(jié)紋狀體富集的蛋白酪氨酸磷酸酶(striatal-enriched protein tyrosine phosphatase，STEP)的表達(dá)水平和活性。STEP的某些靶標(biāo)同樣是Reelin-ApoER2信號(hào)通路中被磷酸化的NMDAR酪氨酸殘基。因此，Aβ介導(dǎo)的STEP激活可導(dǎo)致NMDAR過度內(nèi)化，Aβ還可通過信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活GSK-3β[16]。

有研究發(fā)現(xiàn)，在沒有產(chǎn)生淀粉樣蛋白病理學(xué)的情況下，缺乏Reelin和ApoE受體信號(hào)傳導(dǎo)通路的成年小鼠表現(xiàn)出較好的耐受性，這可能是由于穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和其他神經(jīng)調(diào)節(jié)機(jī)制的補(bǔ)償。Reelin通過復(fù)雜的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)來保護(hù)突觸免受Aβ的損害作用，以維持激酶和磷酸酶活性的平衡。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在成人階段丟失Reelin并沒有引起明顯的認(rèn)知障礙，這表明健康的中樞神經(jīng)系統(tǒng)能夠平衡補(bǔ)償Reelin的損失。然而，在Reelin缺陷型小鼠中，Aβ的過度表達(dá)使其在Morris水迷宮學(xué)習(xí)任務(wù)中表現(xiàn)出嚴(yán)重的學(xué)習(xí)、記憶損害[17]。

3.2 Reelin對(duì)Tau蛋白的影響微管系統(tǒng)是微管蛋白及微管相關(guān)蛋白組成的神經(jīng)細(xì)胞骨架成分，Tau蛋白是含量最高的微管相關(guān)蛋白。正常Tau蛋白含2～3個(gè)磷酸基，與微管蛋白結(jié)合，促進(jìn)其聚合形成微管，維持微管穩(wěn)定性。而AD患者腦內(nèi)，每分子Tau蛋白磷酸基可達(dá)到5～9個(gè)，異常過度磷酸化使其無法發(fā)揮正常功能。

在Reelin的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，Reelin與受體結(jié)合，使Dab1磷酸化，通過一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)抑制GSK-3β活性, 而GSK-3β通常使Tau蛋白磷酸化，故Reelin在一定程度上抑制Tau蛋白磷酸化，Reelin表達(dá)的減少會(huì)導(dǎo)致Tau蛋白磷酸化增加、神經(jīng)纖維纏結(jié)增加[18]。Reelin雜合敲除和ApoE4敲入小鼠均顯示Tau磷酸化水平升高。

細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5，CDK5)可使Tau磷酸化，且不依賴于Reelin信號(hào)通路，CDK5也參與鼠腦發(fā)育過程中皮層神經(jīng)元的定位過程，表明Reelin信號(hào)通路和CDK5級(jí)聯(lián)反應(yīng)之間重疊性。

3.3 Reelin信號(hào)通路對(duì)突觸的影響AD患者的海馬和皮層突觸功能紊亂，導(dǎo)致早期的記憶、認(rèn)知損傷。Reelin信號(hào)通路對(duì)于突觸數(shù)量以及功能有重要作用，影響突觸可塑性。LTP是突觸可塑性的一種形式，可被高頻刺激所誘導(dǎo)，使突觸有效性增加。Reelin處理海馬切片時(shí)，LTP增加[19]，VLDLR和ApoER2敲除小鼠沒有出現(xiàn)這一現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，VLDLR敲除小鼠中高頻刺激誘導(dǎo)的LTP減少，ApoER2受損的小鼠中遲發(fā)性LTP明顯延遲。Reelin可參與空間和恐懼方面的記憶形成，通過向小鼠腦室內(nèi)注射Reelin可以改善學(xué)習(xí)和記憶[20]。相比于野生型，HRM和reeler小鼠海馬神經(jīng)元樹突棘減少，并且其減少程度與Reelin蛋白丟失的量有比例關(guān)系，而外源性Reelin可以改善這一現(xiàn)象[21]。

Reelin通路可對(duì)突觸組分起到調(diào)節(jié)作用。突觸從發(fā)育到成熟的過程中，海馬突觸中NMDA受體的主要組分會(huì)發(fā)生從NR2B亞單位到NR2A亞單位的改變，使用外源性Reelin處理培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元可加速這一過程，敲減Reelin可抑制這個(gè)過程[22]。

大量研究表明，Reelin信號(hào)通路可通過NMDA受體調(diào)節(jié)Ca2+內(nèi)流，增加LTP，影響突觸傳遞、突觸可塑性以及突觸的形成[23]。Reelin還可增加活性調(diào)節(jié)型細(xì)胞骨架蛋白(activity-regulated cytoskeletal，Arc)mRNA的翻譯，鞏固LTP。NMDA受體在AD早期已出現(xiàn)變化，Aβ的異常聚集影響突觸功能，將海馬神經(jīng)元與Aβ寡聚體共培育，會(huì)導(dǎo)致AMPA、NMDA型谷氨酸受體功能以及LTP受損[24]。應(yīng)用Reelin可一定程度上逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，Reelin可拮抗Aβ對(duì)突觸功能的影響。

4 靶向Reelin的臨床研究

目前，關(guān)于Reelin的研究多處于臨床前階段，進(jìn)入臨床階段的實(shí)驗(yàn)較少。RELN (rs7341475G) 是一個(gè)與女性精神分裂癥風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的單核酸多態(tài)位點(diǎn)，圍繞此位點(diǎn)展開的臨床試驗(yàn)表明，此位點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)中檢測的精神分裂癥相關(guān)指標(biāo)未發(fā)現(xiàn)明顯影響[25]。

5 小結(jié)

Reelin在發(fā)育階段以及完成神經(jīng)遷移后的成熟腦內(nèi)，均發(fā)揮著舉足輕重的作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Reelin與多種神經(jīng)精神疾病相關(guān)，其中，Reelin蛋白及所在通路與AD的發(fā)病密切相關(guān)，在AD疾病進(jìn)展過程中，Reelin信號(hào)通路受到不同程度的損傷。此外，Reelin具有神經(jīng)保護(hù)作用，可抵抗Aβ造成的神經(jīng)毒性，抑制Tau蛋白過度磷酸化，調(diào)節(jié)突觸可塑性與LTP。因此，提示Reelin可能成為AD預(yù)防和治療的潛在靶點(diǎn)。但Reelin蛋白在AD發(fā)病機(jī)制中的作用，以及干預(yù)Reelin蛋白后AD病理改變的轉(zhuǎn)歸，仍需要進(jìn)一步深入研究。