張鵬鈺，劉毓俠，曹麗茹,，袁 珍，王國瑞，王同朝1，，尹 鈞,4，衛(wèi) 麗,4

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南 鄭州 450002； 3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 鄭州 450002；4.國家小麥工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002)

植物在生長發(fā)育進程中受到各種外界因素的影響，包括低溫、干旱、高鹽、高溫等，這些非生物脅迫通過刺激特殊信號傳導(dǎo)途徑來激活脅迫應(yīng)答基因的表達，進而通過調(diào)控相應(yīng)生理進程應(yīng)對外界刺激[1]。自1987年玉米轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor, TF)首次被報道以來，人們對轉(zhuǎn)錄因子的研究日趨增多，數(shù)百種轉(zhuǎn)錄因子陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。植物中常見的有NAC、MYB、WRKY、bZIP、AP/ERBP等轉(zhuǎn)錄因子家族[2-3]，其中MYB是較大的轉(zhuǎn)錄因子家族，廣泛存在于高等植物中[4-5]。玉米的C1基因是最早發(fā)現(xiàn)的植物MYB轉(zhuǎn)錄因子[6]。隨著人們對轉(zhuǎn)錄調(diào)控的深入研究，已經(jīng)從擬南芥、玉米、水稻等植物中鑒定出多個MYB轉(zhuǎn)錄因子[7-9]。大多數(shù)植物的MYB在其N端有一段51～52個氨基組成的MYB結(jié)構(gòu)域[10-11]。諸多研究表明，MYB 轉(zhuǎn)錄因子參與植物的生長發(fā)育、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝產(chǎn)物的合成及逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)[12-15]。AtMYB21和AtMYB24通過參與植物激素茉莉酸的調(diào)控影響花青素的積累[16]，AtMYB58和AtMYB63可以同時調(diào)控木質(zhì)素、木聚糖和纖維素生物合成[17]，AtMYB88和AtMYB124/FLP通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)的基因，誘導(dǎo)氣孔的正常分化[18-19]。在干旱和鹽脅迫下TaMYBsdul在耐鹽小麥品種中的表達高于鹽敏感品種[11]，PEG、ABA和GA脅迫下棉花GbMYB5基因在莖尖、葉片和蕾鈴中表達量增加，葉片中的表達水平顯著高于莖尖和蕾鈴[20]，高鹽和ABA脅迫處理下，擬南芥中的AtMybl02表達量明顯高于對照。Seo等[21]研究表明，AtMYB96增強了擬南芥的抗旱和抗病性，干旱脅迫下促進表皮蠟質(zhì)合成、水楊酸和脫落酸介導(dǎo)的抗病信號傳遞。

普通小麥(TriticumaestivumL.)MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究起步較晚，目前發(fā)現(xiàn)的MYB轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目遠(yuǎn)少于擬南芥、玉米和水稻等[22-24]。賈東升等[19]報道克隆的3種類型小麥轉(zhuǎn)錄因子TaMyb2均參與滲透脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。Zhang等[25]克隆了60個小麥MYB基因并進行表達分析，發(fā)現(xiàn)過表達TaMYB32基因可提高擬南芥的耐鹽性。過表達TaMYB73的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株同樣可增加對鹽脅迫的抵御[26]。李孟軍等[27]報道，滲透脅迫下葉和根中TaMYBSM151的表達均受到誘導(dǎo)，葉中表現(xiàn)為上調(diào)，而根中表現(xiàn)為下調(diào)，呈現(xiàn)完全相反的表達模式，認(rèn)為TaMYBSM151在葉和根中可能具有不同的調(diào)控機制。本研究從前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中篩選到1個候選基因Unigene7811，經(jīng)初步序列比對分析，該候選基因含有MYB 結(jié)構(gòu)域，暫命名為Tamyb59。擬采用同源克隆方法克隆該基因，并對其在逆境脅迫中的表達和定位特性進行分析，旨在為深入研究Tamyb59基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及處理方法

本試驗選用的小麥材料為冬性品種京841(J841)。選取飽滿且大小均一的種子，先用75%酒精浸泡1 min，再經(jīng)0.1%氯化汞消毒處理5 min，用無菌水沖洗5次，22 ℃黑暗條件下浸泡12 h，待種子萌動后將種子腹溝朝下，放置于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿，放入光照培養(yǎng)箱(25 ℃/18 ℃、16 h光照/8 h黑暗、光照強度350 μmol/(m2·s)中培養(yǎng)。待小麥長到兩葉一心時進行PEG6000(20%)和NaCl(100 μmol/L)脅迫處理，剪取脅迫處理0,3,6,9,12,24,48,72 h的葉片和根尖組織，每次取3株樣品，并設(shè)置3次重復(fù)，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用，未脅迫處理植株為對照(CK)。每天取樣前保證光照1～2 h左右，避免基因節(jié)律表達對表達分析的影響。

1.2 總RNA提取及cDNA第1鏈的合成

取上述保存葉片和根組織在液氮中細(xì)研，采用TRIzol試劑(Invitrogen)提取總RNA，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimerScriptRTreagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)的操作說明進行cDNA的合成。

1.3 Tamyb59基因克隆

根據(jù)基因序列設(shè)計引物(Tamyb59-F1：5′-TC CAAGGTAGAAGCGAACAAC-3′；Tamyb59-R1：5′-GA TCACCCTCCATACTAATGC-3′)，以J841的cDNA為模板進行PCR擴增。反應(yīng)體系25 μL，包含LATaq(5 U/μL)0.2 μL、2×GC BufferⅡ 2 μL、dNTP mixture(10 mmol/L) 2 μL、上、下游引物(10 μmmol/L)各1 μL、cDNA模板1 μL，用ddH2O補齊至25 μL。PCR反應(yīng)程序為95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。將PCR擴增產(chǎn)物回收純化后，連接至pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)菌液PCR檢測挑取陽性單克隆，送往北京華大基因有限公司測序，利用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進行比對分析。

1.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

根據(jù)引物設(shè)計原則設(shè)計Real-time PCR引物，前引物Tamyb59-F2:5′-GGCAGCACTCATAATGGCAC-3′，后引物Tamyb59-R2: 5′-CTCAGGAGGGCAGT AGCG-3′。反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進行實時熒光定量 PCR 分析，參照TaKaRa熒光定量PCR SYBR? Green Ⅰ試劑盒說明書進行操作。反應(yīng)在 Bio-red CFX96 熒光定量 PCR 儀上運行，PCR反應(yīng)體系為 20 μL，反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；以小麥的β-Actin基因為內(nèi)參基因(β-actin-F:5′-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3′,β-actin-R:5′-GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC-3′)，每個樣品設(shè)3次技術(shù)重復(fù)，采用2-ΔΔCt法進行定量分析。

1.5 亞細(xì)胞定位

根據(jù)Tamyb59的全長cDNA序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計特異擴增引物Tamyb59-F3：5′-CGAC TAGTATGTCGCCACAAGAGGAA-3′和Tamyb59-R3：5′-TTGGCGCGCCAATAGCAGGAACGTTCTC-3′(下劃

線為酶切位點SpeⅠ和AscⅠ)，以測序正確的質(zhì)粒DNA為模板，用帶有SpeⅠ和AscⅠ酶切位點的引物Tamyb59-F3/R3擴增出含有目標(biāo)基因的cDNA 片段，連接至pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑選陽性單菌落測序，測序正確后菌液進行擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶SpeⅠ和AscⅠ進行雙酶切，得到目的片段，同樣雙酶切表達載體pMDC83，將2個酶切后的片段用T4-DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，涂布于卡那霉素抗性的LB固體平板，挑取單菌落，經(jīng)PCR檢測為陽性的菌液擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，雙酶切檢測、測序鑒定。

將構(gòu)建完成的pMDC83-Tamyb59重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，并對幼嫩的本氏煙草進行侵染，2～5 d內(nèi)在激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光融合蛋白定位表達情況。

M.DL2000;1.cDNA;2.DNA。

圖2 Tamyb59的CDS序列及其氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and amino acid sequence of Tamyb59

2 結(jié)果與分析

2.1 Tamyb59基因的克隆及序列分析

分別以J841葉片提取的RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA和基因組DNA為模板，以Tamyb59-F1/R1為引物，PCR擴增得到產(chǎn)物大小分別為925 bp和1 114 bp，與預(yù)期產(chǎn)物大小一致(圖1)。將擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化，連接至pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，將鑒定正確的陽性單克隆測序。生物信息學(xué)分析顯示，該基因的開放閱讀框為522 bp，共編碼173個氨基酸(圖1，2)，初步定位在4B染色體短臂上。

利用NCBI對Tamyb59基因的氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，其蛋白屬于SANT superfamily超基因家族之一(圖3)。對Tamyb59的DNA和cDNA序列比較分析表明，該基因有3個外顯子和2個內(nèi)含子(圖4)。經(jīng)過在線軟件Expasy-ProtParam (http://www.expasy.org/)分析該基因所編碼蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果表明，預(yù)測的Tamyb59蛋白的分子質(zhì)量為19.7 ku，理論等電點為7.61。在整個肽鏈中，親水氨基酸分布均勻，且多于疏水氨基酸，因此整個肽鏈表現(xiàn)為親水性，Tamyb59基因編碼的MYB蛋白為親水蛋白。

圖3 Tamyb59蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Conserved domain analysis of Tamyb59 protein

圖4 Tamyb59的DNA結(jié)構(gòu)分析Fig.4 DNA structure analysis of Tamyb59

2.2 Tamyb59蛋白與其他物種MYB蛋白的系統(tǒng)進化分析

利用DNAMAN 8.0軟件翻譯獲得Tamyb59的氨基酸序列，在NCBI (Chttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/)蛋白數(shù)據(jù)庫中比對發(fā)現(xiàn)，該蛋白與山羊草、粳稻、玉米等9種植物MYB轉(zhuǎn)錄因子有52.0%～85.6%的相似性，其中與谷子的MYB蛋白相似性最高，為85.6%。將Tamyb59與這9條轉(zhuǎn)錄因子序列進行多重比較并利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，10條蛋白序列明顯聚類為2組，Tamyb59與玉米、谷子、二穗短柄草、高粱為第1類，其中，與谷子的親緣關(guān)系最近；而山羊草、秈稻、甘蔗等則為第2類(圖5)。

圖5 基于NJ法構(gòu)建Tamyb59蛋白與其他物種MYB蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree analyses between Tamyb59 and other MYB proteins based on NJ method

2.3 Tamyb59基因在小麥不同組織器官中的表達

采用Real-time PCR 對Tamyb59基因在小麥不同組織器官中的表達進行分析，結(jié)果顯示，Tamyb59在根、莖、葉、幼穗中均有表達，其中根中的表達量相對較高，其次是葉片，在莖和小麥幼穗中的表達量較低，差異達到顯著水平(圖6)。根中的表達量分別是莖的20.4倍、葉的6.7倍、幼穗的25.3倍。

2.4 Tamyb59在煙草表皮中的亞細(xì)胞定位

將構(gòu)建好的pMDC83-Tamyb59-GFP瞬時表達載體轉(zhuǎn)化到煙草表皮細(xì)胞，注射煙草葉片，2～3 d后通過激光共聚焦熒光顯微鏡檢測熒光信號。結(jié)果顯示，不含外源基因的載體pMDC83-GFP分布在整個細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)膜；而轉(zhuǎn)pMDC83-Tamyb59-GFP載體的煙草表皮細(xì)胞內(nèi)綠色熒光僅分布在細(xì)胞核上(圖7)，說明該基因編碼的蛋白定位于細(xì)胞核。

不同字母表示差異顯著性(P<0.05)。圖8-9同。Different letters indicate significant differences (P<0.05). The same as Fig.8-9.

圖7 Tamyb59在煙草表皮中的亞細(xì)胞定位Fig.7 Subcellular localization of Tamyb59 in tobacco epidermis

2.5 干旱脅迫下Tamyb59基因的表達特性分析

當(dāng)小麥植株長到兩葉一心時，進行20%PEG6000脅迫。在根和葉片中的表達模式相同，整個脅迫處理過程中，Tamyb59基因的表達均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，但Tamyb59基因在根中的表達量高于葉片。脅迫處理9 h時，Tamyb59基因在根尖中的表達量達到最高，隨著脅迫處理時間的延長表達量逐漸降低(圖8-A)。在葉片中，脅迫處理6 h時，Tamyb59基因在葉片的表達最高，與0 h相比，差異達到顯著水平,脅迫處理9 h時表達量急劇下降，隨著脅迫處理時間的延長，基因的表達量變化不明顯，脅迫處理9，24，72 h，差異不顯著(圖8-B)。

圖8 PEG脅迫下小麥幼苗根和葉片中Tamyb59基因的表達變化Fig.8 Expression patterns of Tamyb59 gene under PEG stress in root and leaf

2.6 鹽脅迫下Tamyb59基因的表達特性分析

鹽脅迫處理下，Tamyb59基因的表達量呈先上升后下降的趨勢。在根中，鹽脅迫處理6 h時基因的表達量變化不明顯，脅迫處理12 h時，Tamyb59基因表達量達到最大值，與0 h對照相比，差異達到顯著水平。隨著鹽脅迫時間的延長，表達量逐漸降低，脅迫處理72 h時表達量最低，與0 h對照相比，差異水平不顯著(圖9-A)。在葉片中，Tamyb59基因在脅迫處理24 h時表達量最高，隨著鹽脅迫處理時間延長，基因的表達量逐漸降低，脅迫處理72 h，其基因表達量最低，差異達到顯著水平(圖9-B)。

圖9 鹽脅迫下小麥Tamyb59基因在根和葉片的表達Fig.9 Expression patterns of Tamyb59 gene under salt stress in root and leaf of wheat seedlings

3 結(jié)論與討論

干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫都是影響植物生長發(fā)育和產(chǎn)量的重要因素。因此，挖掘響應(yīng)非生物脅迫的基因、培育抗逆性新品種，對于提高作物產(chǎn)量具有重要的意義。轉(zhuǎn)錄因子在植物對非生物脅迫的應(yīng)答中起著重要的作用。MYB轉(zhuǎn)錄因子為植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物的生長發(fā)育、代謝、生物和非生物脅迫應(yīng)答中起著重要的調(diào)控作用[28-29]。MYB家族基因在許多植物中都有深入的研究，在普通小麥中報道較少。本研究中Tamyb59基因具有1個522 bp的ORF，編碼173個氨基酸，含有3個外顯子，2個內(nèi)含子；Tamyb59與谷子的MYB蛋白親緣關(guān)系最近，其次是高粱，和粳稻等的MYB蛋白親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。陳榮敏[30]在小麥根、莖、葉及授粉后3,6,12 d種子的cDNA中均克隆出MYB基因同源片段，說明小麥MYB基因廣泛表達于不同組織器官，本研究發(fā)現(xiàn)Tamyb59基因在根、莖、葉及幼穗中均有表達，且在根中的表達量很高。

基因表達受多因素的影響，包括染色質(zhì)修飾、基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯修飾等，其中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是真核生物基因表達水平的主要調(diào)控方式，因此已成為分子生物學(xué)研究的熱點。研究表明，不同MYB基因在同一脅迫處理下表達不同，同一個MYB基因在不同的非生物脅迫下的響應(yīng)模式也不一致；并不是所有的MYB相關(guān)蛋白都是轉(zhuǎn)錄激活子，有的也起負(fù)調(diào)控作用，抑制目標(biāo)基因的表達[31]。本研究中，PEG滲透脅迫下Tamyb59基因在小麥根和葉片的表達模式不同，根中呈上調(diào)表達趨勢，脅迫處理下表達量均高于對照，而在葉片中大部分時間點表達量低于對照；鹽脅迫下，Tamyb59基因在根和葉片中的表達均低于對照，其低水平的表達，可能促進該基因下游相關(guān)逆境基因的表達從而提高小麥植株對鹽脅迫的耐受能力，研究結(jié)果與AtMYB44的表達模式類似[32]。