張春蘭，滿麗莉，向殿軍，李旭新，包烏日娜，劉 鵬

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028042；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 內(nèi)蒙古 通遼 028042)

高等植物在生存方式上有別于動(dòng)物，其屬于固著生物，在生長(zhǎng)發(fā)育過程中容易遭受干旱、極端溫度、高鹽和重金屬等多種非生物脅迫的影響，造成作物品質(zhì)和產(chǎn)量的損失，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成絕收[1-4]。干旱脅迫是眾多非生物脅迫中最為突出的一種，全世界每年大約有70%的糧食產(chǎn)量損失可以歸因于干旱脅迫[5]。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成了一系列應(yīng)答保護(hù)機(jī)制去忍受或適應(yīng)各種極端環(huán)境條件[6-7]。通過特異的信號(hào)傳導(dǎo)通路感知非生物脅迫，植物啟動(dòng)相關(guān)脅迫基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的各種新陳代謝反應(yīng)去適應(yīng)逆境脅迫。其中，蔗糖非發(fā)酵相關(guān)的蛋白激酶(Sucrose non-fermenting-1-related protein kinase, SnRK)調(diào)控靶蛋白的可逆磷酸化修飾在這一系列防御機(jī)制過程中發(fā)揮著重要的作用。

基于蛋白序列相似性和結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)，高等植物的SnRK家族成員可被分為SnRK1、SnRK2、SnRK3共3個(gè)亞家族。其中，SnRK2是植物所特有的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、養(yǎng)分利用、ABA信號(hào)傳導(dǎo)和響應(yīng)滲透脅迫等過程中發(fā)揮著重要的作用。SnRK2蛋白激酶成員通過ABA非依賴和ABA依賴的2種調(diào)節(jié)途徑參與滲透脅迫信號(hào)通路。目前，對(duì)于SnRK2非依賴ABA調(diào)控通路的研究還不太深入，而對(duì)ABA依賴信號(hào)通路的研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展。SnRK2是ABA通路中至關(guān)重要的蛋白激酶，其作用的底物至少有58個(gè)，涉及表型遺傳調(diào)控、RNA拼接、ROS穩(wěn)定、葉綠體過程和離子通道等多種生物過程[8]。ABRE/AREB/bZIP轉(zhuǎn)錄因子是SnRK2蛋白激酶的重要底物，其活性嚴(yán)格受SnRK2蛋白激酶磷酸化的調(diào)節(jié)。ABA應(yīng)答基因的啟動(dòng)子上含有多個(gè)保守的響應(yīng)ABA的順式作用元件ABRE，SnRK2蛋白激酶可以磷酸化轉(zhuǎn)錄因子如ABRE/AREB/bZIP，活性被磷酸化調(diào)節(jié)的反式因子隨后與ABRE順式作用元件結(jié)合，從而導(dǎo)致ABA響應(yīng)基因mRNA過量累積[9-10]。與SnRK1和SnRK3成員相比，人們對(duì)SnRK2成員的研究較為深入，目前已經(jīng)在擬南芥[11-12]、水稻[13]和小麥[14]等植物中分離了多個(gè)SnRK2家族成員，部分成員的抗逆作用已經(jīng)得到了驗(yàn)證。Diédhiou等[15]將基因轉(zhuǎn)入水稻，轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)出對(duì)高鹽脅迫的抗性。與對(duì)照相比，過量表達(dá)AtSnRK2.8基因的擬南芥植株的抗旱能力有顯著的提高[16]。過表達(dá)小麥TaSnRK2.4基因的擬南芥植株也表現(xiàn)出對(duì)凍害、干旱和高鹽脅迫的抗性[14]。

雪菜(Brassicajuncea)為十字花科(Brassicaceae)蕓薹屬(Brassica)雙子葉1年生草本植物，是我國長(zhǎng)江流域普遍栽培的冬春2季重要蔬菜。雪菜含有大量活性很強(qiáng)的還原物質(zhì)，參與機(jī)體中諸多氧化還原過程。此外，雪菜具有很強(qiáng)的抵御環(huán)境脅迫的能力，包含眾多的優(yōu)良性狀及抗逆基因源。但是，相對(duì)于其他十字花科蔬菜，對(duì)雪菜抵抗逆境脅迫的研究較少，到目前為止，還未見有對(duì)SnRK2蛋白激酶成員的研究與報(bào)道。

本研究基于NCBI中的Nucleotide collection數(shù)據(jù)庫信息，同源克隆了一個(gè)雪菜SnRK2基因，對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、系統(tǒng)發(fā)生等進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。以期對(duì)雪菜SnRK2基因的抗逆功能研究提供理論依據(jù)，為揭示雪菜抗逆機(jī)制以及雪菜SnRK2基因在其他作物抗逆分子育種中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用的雪菜(BrassicajunceaCoss. Var.MulticepsTsen et Lee)種子為雪里蕻(九頭鳥)，為青縣青風(fēng)種業(yè)有限公司產(chǎn)品。將雪菜種子用70%乙醇進(jìn)行表面消毒處理，用無菌水漂洗后播種到土壤中，培養(yǎng)溫度為26 ℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照16 h/d。用含有10% PEG6000的水溶液處理30 d苗齡的雪菜幼苗12 h，收集幼苗的全株，樣品經(jīng)液氮速凍后，置于-70 ℃冰箱保存，用于總RNA制備。

PrimeScriptTM1st Strand cDNA，PrimeSTAR? HS DNA Polymerase，T-Vector pMD? 19(Simple)購于TaKaRa公司。DL2000 DNA Marker購于TaKaRa公司，Marker Ⅰ、Marker Ⅲ、RNAprep pure Plant Kit、瓊脂糖凝膠回收試劑盒和DNA純化試劑盒均購于天根生化科技(北京)有限公司。PCR引物合成及PCR產(chǎn)物測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取及第一鏈cDNA合成 采用RNAprep pure Plant Kit提取上述處理雪菜的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量。第1鏈cDNA合成按照PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行。

1.2.2BjSnRK2C基因克隆 以擬南芥AtSnRK2C(NP_974170.1)氨基酸序列作為檢索序列，進(jìn)行Protein Blast搜索，下載AlSnRK2C(XP_020874391.1)、CsSnRK2C(XP_019093971.1)、RsSnRK2C(XP_019577936.1)、BoSnRK2C(XP_013588502.1)、BrSnRK2C(XP_009104577.1)、BnSnRK2C(XP_013676330.1)6條氨基酸序列，登錄Blockmaker(http://blocks.fhcrc.org/blocks/make_blocks.html)，進(jìn)行Block比對(duì)，在保守區(qū)域進(jìn)行CodeHop引物搜索，設(shè)計(jì)1對(duì)簡(jiǎn)并引物(5′-GGAGRTT KTGTSGACGGCAAC-3′，5′-CCAWCSGCACRGGAGA GTCCAG-3′)，利用PrimeSTAR? HS DNA Polymerase擴(kuò)增BjSnRK2C基因保守區(qū)。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃ 10 s; 55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、末端加A和純化后克隆至T-Vector pMDTM19(Simple)上進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)保守區(qū)的測(cè)序結(jié)果，以第1鏈cDNA為模板，分別設(shè)計(jì)2條同向嵌套引物，利用PrimeSTAR?HS DNA Polymerase對(duì)BjSnRK2C基因的3′端和5′進(jìn)行SON-PCR(Single oligonucleotide nested PCR)擴(kuò)增。擴(kuò)增3′端的引物為5′-CAGC ACCACGTGTAAAGATATGTG-3′，5′-TTGGATACTCA AAGTCAGGAGTTC-3′，2條引物間距離為57 bp；擴(kuò)增5′端的引物為5′-ATGACAGTAACTAACTCCT GAG-3′，5′-CCTCCGGCGGCATATTCCATTAC-3′，2條引物間距離為97 bp。SON-PCR擴(kuò)增程序參照Antal等[17]方法進(jìn)行?；厥?′端和5′端擴(kuò)增產(chǎn)物，克隆至T-Vector pMDTM19(Simple)進(jìn)行測(cè)序。利用Contig 1軟件對(duì)上述3段序列進(jìn)行拼接，根據(jù)拼接序列設(shè)計(jì)引物5′-AATCGCTTTGCATTATTATTACATC-3′，5′-TGAGAATCAAACACCTCAACAATAC-3′，對(duì)拼接序列進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。

1.2.3BjSnRK2C基因的生物信息學(xué)分析 基因編碼區(qū)的預(yù)測(cè)、序列提交、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析，分別采用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)、Banki(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/?tool=genbank)和ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)在線程序完成。利用ScanProsite(http://prosite.expasy.org/scanprosite/)、TMpred Server(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)、NetPhos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)、ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)、SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)、Signal P 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線程序分別對(duì)BjSnRK2C蛋白進(jìn)行保守功能域、跨膜區(qū)、磷酸化位點(diǎn)、親水性/疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽分析預(yù)測(cè)。亞細(xì)胞定位和蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分別采用PSORT Prediction(http://psort1.hgc.jp/form.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)程序進(jìn)行。BlastP搜索與BjSnRK2C同源的蛋白序列，基于MEGA 5.0軟件以臨近法完成蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，利用GENEDOC軟件生成蛋白多序列比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雪菜BjSnRK2C基因的克隆

雪菜幼苗的總RNA提取結(jié)果顯示(圖1-A)，所提取的總RNA 5S，18S，28S條帶較完整和清晰，可以用于合成cDNA第1鏈的模板。以第1鏈cDNA為模板對(duì)目的基因保守區(qū)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，產(chǎn)生730 bp左右的特異性片段(圖1-B)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序得到729 bp的cDNA序列，與擬南芥AtSnRK2C(NM_202441.3)核苷酸序列相似性為91.7%。3′端擴(kuò)增結(jié)果顯示，第1輪和第2輪SON-PCR反應(yīng)各產(chǎn)生2條目的條帶(圖1-C)，產(chǎn)物大小符合引物設(shè)計(jì)的預(yù)期結(jié)果?；厥盏?輪反應(yīng)產(chǎn)生的最大條帶，經(jīng)T-A克隆測(cè)序得到736 bp的cDNA序列。5′端擴(kuò)增結(jié)果顯示，第1輪SON-PCR反應(yīng)產(chǎn)生大小約560 bp的特異條帶(圖1-D)，第2輪SON-PCR反應(yīng)產(chǎn)生2條目的條帶(圖1-D)，最大條帶符合引物設(shè)計(jì)的預(yù)期結(jié)果?；厥盏?輪反應(yīng)產(chǎn)生的最大條帶，經(jīng)T-A克隆測(cè)序得到462 bp的cDNA序列。3段cDNA序列(729，736，462 bp)被Contig 1軟件拼接成1條1 380 bp的cDNA序列。根據(jù)拼接序列兩端設(shè)計(jì)1對(duì)引物進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，產(chǎn)生1條大小約1 400 bp的特異條帶(圖1-E)，測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 380 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物序列與拼接序列完全一致。ORF Finder預(yù)測(cè)結(jié)果顯示(圖2)，1 380 bp的cDNA具有1個(gè)137 bp的3′-非編碼區(qū)(3′-UTR)，1個(gè)1 029 bp的開放閱讀框(ORF)和1個(gè)214 bp的5′-非編碼區(qū)(5′-UTR)，編碼342個(gè)氨基酸。將該cDNA全長(zhǎng)序列命名為BjSnRK2C，提交至GenBank，獲得登錄號(hào)為MF983711。

A. 雪菜總RNA提取; B. BjSnRK2C基因保守區(qū)擴(kuò)增; C. BjSnRK2C基因3′端擴(kuò)增; D. BjSnRK2C基因5′端擴(kuò)增; E. BjSnRK2C基因全長(zhǎng)擴(kuò)增。1. DL2000 DNA Marker；2. PCR產(chǎn)物；3. DL2000 DNA Marker；4. 3′端第1輪PCR產(chǎn)物；5. 3′端第2輪PCR產(chǎn)物；6. Marker Ⅰ；7. 5′端第1輪PCR產(chǎn)物；8. 5′端第2輪PCR產(chǎn)物；9. PCR產(chǎn)物；10. Marker Ⅲ。

圖2 BjSnRK2C基因cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide acid sequence and deduced amino acid sequence of the BjSnRK2C gene

2.2 雪菜BjSnRK2C蛋白激酶的氨基酸組成和理化性質(zhì)分析

BjSnRK2C全長(zhǎng)cDNA編碼342個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)為5.61，理論分子量為38.2 ku；BjSnRK2C蛋白中Ser、Gly、Leu、Asp、Ile、Glu、Val、Lys含量較高，分別為9.4%，8.2%，7.9%，7.6%，7.6%，7.3%，6.7%，6.1%；BjSnRK2C蛋白中帶負(fù)電荷的殘基(Asp+Glu)總數(shù)為51個(gè)，帶正荷的殘基(Arg+Lys)總數(shù)為41個(gè)；BjSnRK2C蛋白分子式為C1688H2651N463O516S15，平均疏水性(GRAVY)為-0.278，脂肪氨基酸指數(shù)(AI)為85.5。BjSnRK2C蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為42.63，屬于不穩(wěn)定蛋白，與擬南芥AtSnRK2C蛋白激酶的氨基酸組成極為相似。

2.3 BjSnRK2C蛋白激酶的序列分析

為了明確BjSnRK2C蛋白激酶的結(jié)構(gòu)特征，對(duì)推導(dǎo)的BjSnRK2C蛋白激酶的氨基酸序列進(jìn)行ScanProsite在線預(yù)測(cè)和多序列比對(duì)。ScanProsite預(yù)測(cè)結(jié)果表明，BjSnRK2C蛋白包含1個(gè)酸性氨基酸序列延伸的C-端激酶調(diào)控域及1個(gè)高度保守的N-端蛋白激酶催化域。高度保守的N-端催化域具有1個(gè)24個(gè)氨基酸的ATP結(jié)合位點(diǎn)(圖3-黑框Ⅰ)和1個(gè)13個(gè)氨基酸的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶激活位點(diǎn)(圖3-黑框Ⅱ)。C-端包含1個(gè)34個(gè)氨基酸的結(jié)構(gòu)域Ⅰ(Domain Ⅰ)(圖3-黑框Ⅲ)，缺少1個(gè)44個(gè)氨基酸的結(jié)構(gòu)域Ⅱ(Domain Ⅱ)(圖3-黑框Ⅳ)。BjSnRK2C氨基酸序列與擬南芥AtSnRK2.8(NP_974170.1)、水稻OsSAPK9(BAD18005.1)、擬南芥AtSnRK2.3(NP_201489.1)、水稻OsSAPK6(BAD18002.1)和擬南芥AtSnRK2.10 (NP_176290.1)的氨基酸序列的相似性分別為84.21%，66.08%，65.20%，64.33%，64.33%(圖3)。這與SnRK2家族成員的高度保守的N-端催化域和特異的C-端激酶調(diào)控域相關(guān)，SnRK2家族成員在功能上的相似性與差異性、響應(yīng)脅迫的相似性與差異性等都可能歸因于SnRK2s序列的一致性和多樣性。

圖3 BjSnRK2C蛋白激酶多序列比對(duì)Fig.3 Multiple sequence alignment of the BjSnRK2C protein kinase

2.4 BjSnRK2C蛋白激酶的進(jìn)化分析

為了明確BjSnRK2C蛋白激酶同其他SnRK2s的進(jìn)化關(guān)系，用來自雪菜、擬南芥、玉米、馬鈴薯的17個(gè)SnRK2成員的氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果如圖4所示。17個(gè)SnRK2蛋白激酶可以分為3組，雪菜BjSnRK2C蛋白激酶同擬南芥AtSnRK2.8、水稻OsSAPK2、玉米ZmSnRK2.2、玉米ZmSnRK2.1和水稻OsSAPK1這6個(gè)成員聚為一組，其中,BjSnRK2C蛋白激酶與擬南芥AtSnRK2.8蛋白激酶關(guān)系最近，表明它們屬于同源基因，可能具有類似的功能。

圖4 BjSnRK2C蛋白聚類分析Fig.4 Phylogenic analysis of the BjSnRK2C protein

2.5 BjSnRK2C信號(hào)肽的預(yù)測(cè)和分析

信號(hào)肽是由長(zhǎng)度5～30 個(gè)N-末端氨基酸組成的短肽鏈(有時(shí)不一定在N-端)，其功能是引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移。利用SignalP4.1 Server對(duì)BjSnRK2C進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，可能沒有信號(hào)肽區(qū)域存在于BjSnRK2C蛋白激酶中(圖5)。

圖5 BjSnRK2C蛋白信號(hào)肽的預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of BjSnRK2C protein signal peptide

2.6 BjSnRK2C蛋白激酶的的跨膜區(qū)分析

α-螺旋結(jié)構(gòu)通常作為蛋白質(zhì)序列中跨越細(xì)胞膜的區(qū)域，構(gòu)成跨膜區(qū)的氨基酸大部分必須是疏水性氨基酸，這樣才能使膜蛋白順利通過細(xì)胞膜的磷脂雙分子層。 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示(圖6)，可能有5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域存在于BjSnRK2C蛋白中。由外向內(nèi)的跨膜結(jié)構(gòu)域有1個(gè)，位于182-198位，長(zhǎng)度為17個(gè)氨基酸，分?jǐn)?shù)為1 109。由內(nèi)向外的跨膜結(jié)構(gòu)域有4個(gè)：第1個(gè)位于65-81位，長(zhǎng)度為17個(gè)氨基酸，分?jǐn)?shù)為304；第2個(gè)位于102-119位，長(zhǎng)度為18個(gè)氨基酸，分?jǐn)?shù)為153；第3個(gè)位于183-200位，長(zhǎng)度為18個(gè)氨基酸，分?jǐn)?shù)為1 139；第4個(gè)位于298-314位，長(zhǎng)度為17個(gè)氨基酸，分?jǐn)?shù)為148。所以，BjSnRK2C蛋白激酶可能存在2個(gè)顯著跨膜結(jié)構(gòu)域(分?jǐn)?shù)大于500)。

圖6 BjSnRK2C蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of BjSnRK2C protein transmembrane domain

2.7 BjSnRK2C蛋白激酶的亞細(xì)胞定位

為了掌握雪菜BjSnRK2C蛋白的表達(dá)和作用位置，利用在線預(yù)測(cè)軟件PSORT Prediction對(duì)BjSnRK2C蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位。預(yù)測(cè)結(jié)果表明，BjSnRK2C蛋白的可能定位在細(xì)胞質(zhì)(Cytoplasm)、微體(Microbody)、線粒體基質(zhì)空間(Mitochondrial matrix space)和溶酶體(Lysosome)上。這4個(gè)位置的決定性系數(shù)(Certainty)分別為0.450，0.396，0.100，0.100，所以，推測(cè)BjSnRK2C蛋白最可能定位的位置是在細(xì)胞質(zhì)上。

2.8 BjSnRK2C蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)分析

大部分前體蛋白需要經(jīng)過翻譯后修飾才能成為有功能的蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)翻譯后修飾中最重要、最常見的方式之一是蛋白質(zhì)的磷酸化。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示(圖7)，BjSnRK2C蛋白激酶可能有4個(gè)酪氨酸(Tyr)、5個(gè)蘇氨酸(Thr)、21個(gè)絲氨酸(Ser)成為磷酸化位點(diǎn)。擬南芥AtSnRK2.8蛋白激酶可能有5個(gè)酪氨酸(Tyr)、8個(gè)蘇氨酸(Thr)、16個(gè)絲氨酸(Ser)成為磷酸化位點(diǎn)。二者可能的磷酸化位點(diǎn)的數(shù)目和位置極為相似，它們可能具有類似的磷酸化過程。

圖7 BjSnRK2C蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.7 Prediction of phosphorylation sites in the BjSnRK2C protein

2.9 BjSnRK2C蛋白激酶的親水性和疏水性分析

氨基酸的親水性和疏水性是蛋白質(zhì)固有的特征，氨基酸的親水性和疏水性之間的平衡決定著蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征，而氨基酸內(nèi)的疏水作用在很大程度上決定著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。所以，分析和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的親水性和疏水性可以為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測(cè)提供重要的理論依據(jù)。氨基酸的親水性和疏水性分析結(jié)果顯示(圖8)，BjSnRK2C蛋白激酶最大疏水性氨基酸值為2.189，最小疏水性氨基酸值為-2.689，存在多個(gè)明顯的親水區(qū)域，而且組成BjSnRK2C蛋白激酶的大部分氨基酸屬于親水性氨基酸。據(jù)此推斷，雪菜BjSnRK2C蛋白激酶屬于親水性蛋白。

圖8 BjSnRK2C蛋白激酶親水性/疏水性分析Fig.8 Hydrophobicty/phydrophilicity prediction of the BjSnRK2C protein kinase

2.10 BjSnRK2C蛋白激酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示(圖9)，雪菜BjSnRK2C蛋白激酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有130個(gè)α-螺旋(Alpha helix)、126個(gè)無規(guī)則卷曲(Random coil)、59個(gè)延伸鏈(Extended strand)和27個(gè)β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)。與擬南芥AtSnRK2.8蛋白激酶的139個(gè)α-螺旋、111個(gè)無規(guī)則卷曲、58個(gè)延伸鏈和35個(gè)β-轉(zhuǎn)角極為相似，暗示雪菜BjSnRK2C蛋白激酶可能與擬南芥AtSnRK2.8蛋白激酶具有相似的功能。

β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈、α-螺旋和無規(guī)則卷曲分別用依次增多的豎線表示。Beta turn, extended strand, alpha helix and random coil are indicated with increased vertical lines in turn.

2.11 BjSnRK2C蛋白激酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖10所示，雪菜BjSnRK2C蛋白激酶主要由α-螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角構(gòu)成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。此外，雪菜BjSnRK2C蛋白激酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)與擬南芥AtSnRK2.8蛋白激酶極為相似，推測(cè)它們具有類似的功能。

圖10 BjSnRK2C蛋白激酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.10 Three-dimensional structure prediction of the BjSnRK2C protein kinase

3 結(jié)論與討論

SnRK2蛋白激酶包含1個(gè)由27個(gè)氨基酸組成的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶激活環(huán)，其序列為DF GYSKSSVLHSQPKSTVGTPAYIAPE。對(duì)擬南芥AtSnRK2.6(NP_567945.1)和水稻SAPK2(BAD17998.1)蛋白激酶研究結(jié)果表明，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶激活環(huán)上的3個(gè)絲氨酸/蘇氨酸殘基(下劃線處)對(duì)SnRK2蛋白激酶的酶活起到關(guān)鍵的作用[18-19]。用天冬氨酸替代這3個(gè)氨基酸中的前2個(gè)后，AtSnRK2.6蛋白激酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照，只能使底物蛋白輕微磷酸化。同樣，水稻SAPK2絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶激活環(huán)上的3個(gè)絲氨酸/蘇氨酸殘基全部、兩兩或逐一被天冬氨酸取代后，無法檢測(cè)到SAPK2蛋白激酶活性。多序列比對(duì)結(jié)果顯示，雪菜BjSnRK2C蛋白激酶激活環(huán)序列與擬南芥AtSnRK2.8的該序列完全一致，推測(cè)雪菜BjSnRK2C蛋白激酶與擬南芥AtSnRK2.6蛋白激酶具有相似的磷酸化作用。

多序列比對(duì)結(jié)果顯示，不同SnRK2蛋白激酶成員在N末端高度保守，而在C末端高度特異。SnRK2家族成員在C末端包含一個(gè)酸性補(bǔ)丁(D/E)，一般富含天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)，依據(jù)這一特點(diǎn)將SnRK2成員分為SnRK2a(酸性補(bǔ)丁中富含D)和 SnRK2b(酸性補(bǔ)丁中富含E)2個(gè)組[20]。序列分析顯示，雪菜BjSnRK2C蛋白激酶的C末端也包含1個(gè)谷氨酸(D)的酸性補(bǔ)丁，因此，BjSnRK2C蛋白激酶屬于SnRK2a家族中的一員?；贑末端結(jié)構(gòu)組成和系統(tǒng)發(fā)生，又可將SnRK2家族成員分為Group Ⅰ、GroupⅡ和Group Ⅲ共3個(gè)組[21]。進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果表明，雪菜BjSnRK2C蛋白激酶被歸為Group Ⅱ成員，這與Group Ⅱ和Group Ⅲ屬于SnRK2a，而Group Ⅰ屬于SnRK2b的研究結(jié)果是一致的。SnRK2蛋白激酶家族成員的C末端主要包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域：一個(gè)是Domain Ⅰ，該區(qū)域是SnRK2蛋白激酶響應(yīng)非生物脅迫的必要元件，Group Ⅰ、GroupⅡ和Group Ⅲ這3組成員都具備這一結(jié)構(gòu)域；另一個(gè)是Domain Ⅱ，為Group Ⅲ成員所特有的一段序列，是響應(yīng)ABA應(yīng)答不可缺少的元件，在與PP2C、ABI1等磷酸酶的相互作用以及響應(yīng)ABA應(yīng)答等方面發(fā)揮著重要的作用[22-23]。除SnRK2.9外，擬南芥其余9個(gè)SnRK2成員都響應(yīng)高滲脅迫，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)Group Ⅰ成員不響應(yīng)ABA脅迫，Group Ⅱ成員對(duì)ABA脅迫不響應(yīng)或具有微弱的響應(yīng)，Group Ⅲ成員強(qiáng)烈響應(yīng)ABA脅迫[24]。10個(gè)水稻SnRK2成員也都響應(yīng)高滲脅迫，其中Group Ⅰ和Group Ⅱ中的3個(gè)成員(SAPK8、SAPK9和SAPK10)也響應(yīng)ABA脅迫[19]。這些研究結(jié)果與SnRK2家族成員的高度保守的N端催化域和特異的C端激酶調(diào)控域是相關(guān)的，SnRK2家族成員在功能上的相似性與差異性、響應(yīng)脅迫的相似性與差異性等都可能歸因于SnRK2s序列的一致性和多樣性。與擬南芥AtSnRK2.8蛋白激酶的研究結(jié)果極其相似，雪菜BjSnRK2C蛋白激酶的C末端僅含1個(gè)由34個(gè)氨基酸組成的Domain Ⅰ，缺少1個(gè)由44個(gè)氨基酸組成的Domain Ⅱ，暗示雪菜BjSnRK2C基因與擬南芥AtSnRK2.8有類似的功能，在參與非生物脅迫過程中很可能也是不依賴ABA調(diào)控通路的。

作為植物體內(nèi)與脅迫相關(guān)的重要植物激素，ABA在植物許多生理生化的過程中起到尤為重要的作用。SnRK2蛋白激酶可通過SnRK2-AREB/ABF調(diào)控通路引發(fā)一系列ABA應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄。ABA應(yīng)答基因的啟動(dòng)子上含有多個(gè)保守的響應(yīng)ABA的順式作用元件ABRE，SnRK2蛋白激酶可以磷酸化轉(zhuǎn)錄因子如ABFs/AREBs，活性被磷酸化調(diào)節(jié)的反式因子隨后與ABRE順式作用元件結(jié)合，啟動(dòng)ABA響應(yīng)基因的表達(dá)[9-10]。小麥中的TaABF可以被PKABA1磷酸化[25]，TRAB1可以被水稻的SAPK10、SAPK9及SAPK8蛋白激酶磷酸化[26]。擬南芥蛋白激酶SnRK1.1能夠磷酸化開花調(diào)控途徑中的轉(zhuǎn)錄因子FD[27],雪菜BjSnRK2C蛋白激酶能否磷酸化ABFs/AREBs還不清楚，需要進(jìn)一步研究。

利用RT-PCR和SON-PCR技術(shù)從雪菜中克隆了1個(gè)SnRK2基因，命名為BjSnRK2C，經(jīng)過生物信息學(xué)分析鑒定，它具有SnRK2蛋白激酶家族的特征，為雪菜SnRK2基因家族中的成員。