呂亞楠，余國(guó)武，2，黃玉碧，2

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 作物科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，四川 成都 611130)

淀粉(Amylum)作為植物中重要的貯藏多糖，是植物種子的主要成分。淀粉可以為食物提供80%的能量，是食物的重要組成部分[1]。玉米是三大糧食作物之一，隨著時(shí)代的進(jìn)步和科技的發(fā)展，淀粉已經(jīng)成為一種重要的商業(yè)產(chǎn)品，在能源、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域的應(yīng)用，已進(jìn)入穩(wěn)步健康發(fā)展階段[2]。在玉米籽粒中，淀粉的比例達(dá)到70%左右，因此，淀粉的質(zhì)量對(duì)玉米的質(zhì)量有直接的影響[3]。植物體內(nèi)淀粉的合成是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，它是由幾種酶共同催化下，以蔗糖為起始原料，進(jìn)行一系列生理生化反應(yīng)合成的[4]。而其中ADPG焦磷酸化酶(AGPase)是淀粉合成代謝途徑中起始關(guān)鍵限速酶[5]。因此，深入研究AGPase，對(duì)淀粉的合成起到重要作用，有利于研究淀粉生物合成的分子機(jī)制及其調(diào)控。

有研究表明，AGPase的活性影響淀粉的合成。在植物的葉和塊莖中，通過效應(yīng)子3-磷酸甘油酸的激活作用和無機(jī)磷酸的抑制作用，AGPase的活力與光合作用活性相協(xié)調(diào)[6-7]。Stark等[8]在馬鈴薯中轉(zhuǎn)入AGPase，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，增加了35%的淀粉產(chǎn)量。同樣， Wang等[9]研究中，構(gòu)建AGPase與胚乳組織特異啟動(dòng)子的重組載體，并將其轉(zhuǎn)入到玉米中表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，種子質(zhì)量增加了22%～25%。另外，發(fā)現(xiàn)了一種大腸桿菌突變體，將其轉(zhuǎn)進(jìn)水稻進(jìn)行表達(dá)，水稻的產(chǎn)量提高了11%[10]。因此，深入研究AGPase，提高其活性，有利于淀粉產(chǎn)量的增加，對(duì)作物的育種研究有重要的意義。

高等植物的AGPase是由2個(gè)大亞基(LSU)和2個(gè)稍小的小亞基(SSU)組成的一個(gè)異源四聚體酶(α2β2)。一般大亞基對(duì)AGPase具有調(diào)控的功能，而小亞基則具有催化功能[11]。AGPase有多種類型的同工酶，并且有多個(gè)基因編碼。其中，玉米AGPL2是AGPase同工酶的一種大亞基，主要存在于胚乳中，編碼518個(gè)氨基酸。它可以與AGPase其他亞基組成一種或幾種形式的AGPase。水稻胚乳AGPase是由2個(gè)小亞基(AGPS2b)和2個(gè)大亞基(AGPL2)組成的異源四聚體，在其催化作用下在細(xì)胞質(zhì)中合成ADP-葡萄糖[12]。而且在水稻胚乳中，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPL2和AGPS2b)的表達(dá)水平在空間上與淀粉顆粒的差異性分布是相關(guān)的，并且編碼ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的AGPL2和AGPS2b的轉(zhuǎn)錄水平似乎調(diào)節(jié)穎果發(fā)育時(shí)期淀粉顆粒的異步發(fā)育[13]。有研究表明，改變AGPase 7種亞基的組合方式和結(jié)構(gòu)，能夠增強(qiáng)土豆(Solanumtuberosum)塊莖[7，14]、玉米(Zeamays)[15]、小麥(Triticumaestivum)[16]和水稻(Oryzasativa)種子[17]中AGPase的活性和淀粉的積累。因此，設(shè)計(jì)玉米AGPL2特異性引物，構(gòu)建原核表達(dá)載體，使其在E.coli能夠高效表達(dá)，純化目的蛋白并制備AGPL2多克隆抗體，為研究玉米AGPL2蛋白的表達(dá)分析、AGPase的活性乃至淀粉的合成奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

以四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所選育的中國(guó)西南地區(qū)優(yōu)良玉米骨干系08-641(R08)為材料，該材料特點(diǎn)為淀粉含量較高。

本研究所用的主要試劑：反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ以及DNA連接酶和蛋白酶抑制劑等(TaKaRa)；蛋白質(zhì)親和純化介質(zhì)GSH-coupled Agarose Affinity Matris(Genstar)、NC膜(Hybond C Extra)；弗氏完全佐劑和不完全佐劑(Sigma)、HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體(Abbkine)；Quick StartTMBradford 1x dye reagen(Bio-Rad)、HRP-DAB顯色試劑盒(Thermo)、蛋白分子量預(yù)染蛋白Marker(Solarbio)、WB-MASTER Protein Standard(GenScript)。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。雌性新西蘭大白兔，質(zhì)量為1.5～2.0 kg，由達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PGEX-6T-1-AGPL2原核表達(dá)載體的構(gòu)建 玉米授粉后20 d，分離胚乳，提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)AGPL2帶有EcoR Ⅰ和SalⅠ酶切位點(diǎn)的上下游引物。通過PCR從玉米胚乳cDNA中擴(kuò)增目的片段，連接至pMD-19-simple-T載體擴(kuò)增后，用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切回收AGPL2基因片段，與同樣雙酶切后的表達(dá)質(zhì)粒PGEX-6T-1定向連接，用CaCl2化學(xué)法通過熱擊轉(zhuǎn)化E.coliDH5α菌株，涂板后倒平板培養(yǎng)過夜，挑取單菌落于1 mL Luria-Bertani(LB)液體培基(含100 μg/mL氨芐青霉素)中，37 ℃振蕩培養(yǎng)4～6 h，進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，選取能夠檢測(cè)到目的條帶的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)并用堿裂解法提取質(zhì)粒，進(jìn)行EcoR Ⅰ和SalⅠ雙酶切驗(yàn)證，然后將重組質(zhì)粒送到測(cè)序公司進(jìn)行最后確認(rèn)。

1.2.2 GST-AGPL2融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將經(jīng)過確認(rèn)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞BL21，涂板并倒平板過夜培養(yǎng)，挑取單克隆于1 mL LB(含100 μg/mL氨芐青霉素)中，37 ℃培養(yǎng)4～6 h，然后進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)。將檢測(cè)正確的菌液接種于LB(含100 μg/mL氨芐青霉素)中，37 ℃振蕩培養(yǎng)，使菌液OD600在0.4～0.8，加入0.5 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)于28 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h。分別在誘導(dǎo)0，3，6 h時(shí)取1 mL菌液，收集菌體，用100 μL超純水重懸菌體，加入蛋白上樣緩沖(20 mmol/L Tris-HCl，0.4% SDS，5%甘油，1% β-巰基乙醇，0.02%溴酚藍(lán)，pH值6.8)，煮沸裂解5～10 min，離心(12 000 r/min，2～5 min)，吸取上清進(jìn)行10% SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)。

1.2.3 GST-AGPL2融合蛋白的純化 將融合蛋白表達(dá)成功的菌液離心(4 ℃，4 000 r/min，5～10 min)，去上清收集菌體，重懸于PBS緩沖液，離心去上清，重復(fù)2～3次。然后用PBS重懸菌體并加入蛋白酶抑制劑，置于冰上，超聲破碎使細(xì)胞裂解，離心(4 ℃，10 000 r/min，10 min)收集上清。將上清加入預(yù)先平衡的含Glutathione beads的純化柱中，在4 ℃搖床過夜結(jié)合。去除上清，用5～10倍柱體積的PBS緩沖液洗滌beads。再用洗脫液洗脫，收集組分，重復(fù)5次。最后將收集的蛋白各取出10 μL進(jìn)行10% SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢測(cè)。

1.2.4 多克隆抗體的制備 購(gòu)買2 kg新西蘭大白兔，適應(yīng)環(huán)境3～4 d。取兔耳靜脈血約500 μL，分離血清作為陰性對(duì)照。血液于37 ℃放置2 h，然后4 ℃放置過夜；離心(4 ℃，4 000 r/min，10 min)，收集上清，重復(fù)2～3次；血清中加入15%的甘油和0.2‰的疊氮化鈉，混勻后置于-80 ℃保存。第一次免疫新西蘭大白兔時(shí)，將純化的蛋白和不完全佐劑按1∶1混合，直至1 000 r/min離心不分層，然后多點(diǎn)注射兔子皮下。再次注射時(shí)，純化的蛋白和完全佐劑按1∶1混合。每隔14 d免疫一次，連續(xù)免疫4次。最后一次注射7 d后，在兔子的頸動(dòng)脈處取所有血液，分離血清并Western Blot檢測(cè)評(píng)價(jià)抗血清。

1.2.5 GST-AGPL2蛋白rTEV Protease酶切反應(yīng) 取7.5 μg純化的GST-AGPL2融合蛋白，總體系為150 μL，pH值7.0，加入rTEV Protease(3 μL 25 U)30 ℃孵育，在0，1.5，3.5，6.5 h分別取出30 μL反應(yīng)液，然后各取出10 μL約 500 ng蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。

1.2.6 玉米不同組織蛋白的提取及蛋白定量 將樣品在液氮中研磨至粉末，稱質(zhì)量，以1 g樣品加入2 mL蛋白提取液(100 mmol/LTris-HCl，pH值7.0，40 mmol/L β-巰基乙醇，10 mmol/L MgCl2，100 mmol/L KCl，15%甘油)的比例加入適當(dāng)?shù)奶崛∫海⒓尤氲鞍酌敢种苿?，混勻，放置冰?0 min；離心(4 ℃，12 000 r/min，15 min)，收集上清，重復(fù)2次；在1 mL快速測(cè)定蛋白濃度反應(yīng)液中加入2 μL的上清，測(cè)OD595以確定其蛋白濃度。

1.2.7 Western Blot試驗(yàn) Western Blot采用濕轉(zhuǎn)法，在SDS-PAGE結(jié)束后，電壓90 V，轉(zhuǎn)膜2 h；用麗春紅染液染色5 min，觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果，TBST(150 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0，0.05% Tween 20)洗膜3次，每次5 min；加入封閉液(含有5%脫脂奶粉的TBST)，在搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉1 h；將AGPL2多克隆兔抗體按照適當(dāng)比例用TBST稀釋，4 ℃緩慢搖動(dòng)孵育過夜，回收一抗，TBST洗膜4次，每次10 min；將HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG按照1∶10 000稀釋，室溫孵育1 h，回收二抗，再用TBST緩沖液清洗膜4次，每次10 min；加入1∶1混合均勻的顯影液和定影液，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。

2 結(jié)果與分析

2.1 PGEX-6T-1-AGPL2原核表達(dá)載體的構(gòu)建

為了構(gòu)建原核表達(dá)載體PGEX-6T-1-AGPL2，選取PGEX-6T-1作為目標(biāo)載體，該載體含有一個(gè)GST標(biāo)簽，GST與目的基因間還有一個(gè)TEV Protease酶切位點(diǎn)，可以在試驗(yàn)需要時(shí)去除GST標(biāo)簽(圖1-A)。以玉米胚乳cDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到AGPL2基因片段，其大小為1 500 bp左右，與理論分子量相符(圖1-B)。經(jīng)酶切、連接反應(yīng)成功構(gòu)建PGEX-6T-1-AGPL2載體。將重組質(zhì)粒PGEX-6T-1-AGPL2進(jìn)行EcoR Ⅰ和SalⅠ雙酶切驗(yàn)證，獲得條帶大小約為1 500 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1-C)。進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證，表明PGEX-6T-1-AGPL2表達(dá)載體構(gòu)建成功。

A. 載體構(gòu)建；B. AGPL2 PCR擴(kuò)增；C. 重組質(zhì)粒的酶切鑒定。A.Vector construction； B. PCR amplification of AGPL2； C.Identification of recombinant plasmids by restriction enzyme digestion.

2.2 PGEX-6T-1-AGPL2融合蛋白的誘導(dǎo)純化及鑒定

由上步獲得的PGEX-6T-1-AGPL2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，獲得重組工程菌株。在0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下，GST-AGPL2融合蛋白的表達(dá)量增加，蛋白分子量約83 ku，與理論分子量相符(圖2-A)。并且在28 ℃條件下，用0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h，目的蛋白表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增加，說明目的蛋白在此條件下能夠得到高水平表達(dá)。為獲得足夠量的AGPL2蛋白，先后純化得到6管濃度不一的蛋白，其條帶比較單一，蛋白質(zhì)量較高(圖2-B)。用已知的不同濃度BSA作對(duì)照，6管蛋白濃度介于10～200 ng/μL；其中第6管蛋白濃度最高，介于50～200 ng/μL。這些結(jié)果表明，GST-AGPL2重組蛋白成功被純化，可用作抗原制備抗體。

A. GST-AGPL2融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的考馬斯亮藍(lán)染色；B. GST-AGPL2融合蛋白純化的考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)；1-6.純化的GST-AGPL2融合蛋白。A. The expression of GST-AGPL2 fusion protein was detected by Coomassie brilliant blue staining； B. The purification of GST-AGPL2 fusion protein was detected by Coomassie brilliant blue staining；1-6.Purified GST-AGPL2 fusion protein.

2.3 兔抗血清制備及特異性檢測(cè)

將上步獲得的高質(zhì)量純化蛋白，免疫新西蘭大白兔，分離血清，獲得兔多克隆抗體。為了驗(yàn)證AGPL2抗體的特異性，將上步純化得到的GST-AGPL2融合蛋白用rTEV Protease去除GST標(biāo)簽，進(jìn)行Western Blot檢測(cè)(圖3)。結(jié)果表明，rTEV Protease酶切前抗體能夠特異地檢測(cè)到GST-AGPL2蛋白條帶，酶切后抗體檢測(cè)到GST-AGPL2、AGPL2和GST這3條帶，且隨著酶切時(shí)間的增加AGPL2條帶的信號(hào)逐漸增強(qiáng)，說明AGPL2抗體能夠特異地檢測(cè)納克級(jí)抗原，具有很好的特異性和靈敏性。

抗體稀釋比例為1∶5 000。Antibody dilution ratio is 1∶5 000.

2.4 玉米AGPL2蛋白的時(shí)空表達(dá)分析

在體外，AGPL2抗體能識(shí)別其抗原，但是否能識(shí)別玉米體內(nèi)的蛋白還不清楚。因此，為了研究玉米內(nèi)源AGPL2蛋白是否能被制備的抗體識(shí)別及AGPL2表達(dá)模式與分布情況，提取玉米08641不同組織及其授粉后不同時(shí)期的胚乳蛋白，進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，結(jié)果表明，玉米不同組織中檢測(cè)到的信號(hào)強(qiáng)弱不一，說明AGPL2蛋白在不同組織中的表達(dá)具有組織特異性(圖4-A)。胚乳中AGPL2蛋白的表達(dá)量最高，其次是胚，而在根、莖和葉中表達(dá)量很少甚至檢測(cè)不到，說明AGPL2蛋白功能主要在胚和胚乳中。淀粉主要在胚乳中積累，為了進(jìn)一步研究在淀粉積累中胚乳AGPL2的表達(dá)模式，分離授粉后不同階段的胚乳，提取總蛋白并進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，結(jié)果表明，在授粉10 d內(nèi)AGPL2蛋白含量很少，10～15 d AGPL2蛋白的表達(dá)量劇增，在15，20 d的信號(hào)最強(qiáng)，隨后逐漸減弱(圖4-B)。這一結(jié)果與淀粉的積累模式相符，說明AGPL2在淀粉的積累過程中可能參與了淀粉的合成。也表明AGPL2抗體能夠很好地識(shí)別玉米胚乳內(nèi)的抗原。以上結(jié)果說明，AGPL2多克隆抗體能特異地識(shí)別玉米體內(nèi)的蛋白。在玉米中，AGPL2的表達(dá)主要在胚乳中，尤其在授粉后15，20 d表達(dá)水平較高。

A.玉米AGPL2蛋白在不同組織的分布檢測(cè)，抗體稀釋比為1∶2 000；B.玉米胚乳中的AGPL2蛋白在授粉后不同時(shí)期的表達(dá)檢測(cè)，抗體稀釋比為1∶5 000。A.Distribution of maize AGPL2 protein in different tissues，antibody dilution ratio is 1∶2 000；B. Expression of AGPL2 protein in maize endosperm at different stages after pollination；antibody dilution ratio is 1∶5 000.

3 結(jié)論與討論

本研究擴(kuò)增編碼AGPase大亞基多個(gè)基因之一的AGPL2基因，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體PGEX-6T-1-AGPL2。在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)GST-AGPL2蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在28 ℃、0.5 mmol/L IPTG條件下該蛋白能夠得到高水平的表達(dá)。用親和純化的GST-AGPL2蛋白作為抗原，免疫新西蘭大白兔成功制備其多克隆抗體，抗體具有較高的特異性和靈敏性。并利用AGPL2抗體初步研究了玉米AGPL2蛋白的時(shí)空表達(dá)分布，說明AGPL2蛋白主要存在于胚乳，其表達(dá)模式與淀粉積累規(guī)律一致，對(duì)進(jìn)一步探索和研究植物中AGPL2蛋白、AGPase及淀粉的合成具有重要的意義。

兔多克隆抗體AGPL2具有較高的特異性和效價(jià)。在體外抗體特異性試驗(yàn)中，檢測(cè)的總抗原蛋白500 ng，rTEV Protease去除GST標(biāo)簽前檢測(cè)到了GST-AGPL2，而酶切后出現(xiàn)了不帶標(biāo)簽的AGPL2及GST蛋白。結(jié)果表明，AGPL2多克隆抗體不但能識(shí)別AGPL2蛋白，而且也能識(shí)別GST。而在玉米體內(nèi)不存在GST蛋白，因此，AGPL2多克隆抗體具有較高的特異性。在抗體效價(jià)方面，試驗(yàn)并未直接用Elisa實(shí)驗(yàn)去評(píng)估效價(jià)[18]，直接采用了Western Blot去驗(yàn)證抗體。因在抗原檢測(cè)中，抗體的稀釋比為1∶5 000，在體內(nèi)玉米AGPL2蛋白檢測(cè)試驗(yàn)中，也采用了1∶2 000的稀釋比例。這些結(jié)果表明，AGPL2抗體具有較高的效價(jià)。另外，AGPL2抗體檢測(cè)的總抗原蛋白為500 ng，其中AGPL2的量遠(yuǎn)低于500 ng，因此證明AGPL2抗體可用于檢測(cè)納克級(jí)蛋白，具有較高的特異性和靈敏性?？傊?，以上結(jié)果說明，試驗(yàn)獲得了具有較高特異性和效價(jià)的抗體。

在多種植物中發(fā)現(xiàn)，AGPase的大小亞基不止一種基因編碼，而是由多個(gè)基因編碼，并且這些基因存在于不同的組織或器官，具有組織表達(dá)特異性[19-24]。本研究對(duì)玉米的根、莖、葉、種皮、胚、胚乳中的AGPL2亞基進(jìn)行免疫雜交時(shí)，不同組織AGPL2蛋白的表達(dá)量不同，并且AGPL2在胚乳中表達(dá)量最高，表明了AGPL2亞基具有組織表達(dá)特異性且主要存在于胚乳。在黃斌全[25]的研究中，對(duì)胚乳、胚、根和葉中的AGPL2進(jìn)行熒光定量，結(jié)果出現(xiàn)AGPL2在胚中的表達(dá)量最高，其次是葉，最低是根。與本研究的結(jié)果不一致，可能是因?yàn)楸狙芯渴腔诘鞍姿剑S斌全[25]是在RNA水平上進(jìn)行研究的。有研究表明，RNA水平和蛋白水平往往不一致[26]。并對(duì)玉米不同授粉時(shí)期的胚乳裂解液進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，檢測(cè)到的信號(hào)強(qiáng)弱不一，且信號(hào)由弱到強(qiáng)再變?nèi)?，表明了玉米胚乳中AGPL2的表達(dá)模式是先增加后降低，這與黃斌全[25]研究的熒光定量結(jié)果一致，且與淀粉的積累規(guī)律相符。在玉米胚乳組織的表達(dá)分布中，AGPL2抗體在35，40 d主要識(shí)別了2條條帶，推測(cè)由于大亞基蛋白同源性較高AGPL2抗體也可能識(shí)別AGPase的其他亞基。