金賀，趙志煒，王玉蘭，張旭，王蓉,2*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，北京市老年病醫(yī)療研究中心，神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053； 2. 北京腦重大疾病研究院，北京 100053)

衰老是生命過程中的必然規(guī)律，神經(jīng)系統(tǒng)作為重要的人體機(jī)能調(diào)節(jié)系統(tǒng)，是受衰老影響最大的系統(tǒng)之一。衰老腦組織發(fā)生的一系列特征性改變，包括脂褐素沉積、髓鞘發(fā)育受損、神經(jīng)細(xì)胞萎縮、細(xì)胞間突觸聯(lián)系減少、生化物質(zhì)異常等與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生密切相關(guān)， 可能是疾病的初級(jí)階段[1-2]。因此，了解導(dǎo)致腦衰老，尤其是病理性腦衰老的危險(xiǎn)因素及其相關(guān)分子機(jī)制對(duì)預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病具有重要意義。

代謝綜合征(metabolic syndrome， MS)是以胰島素抵抗(insulin resistance， IR)為核心病理改變的各種代謝性疾病的總稱，是腹型肥胖、糖代謝異常、2型糖尿病、脂代謝紊亂、高血壓、高胰島素血癥等多種代謝異常癥狀集中發(fā)生在某一個(gè)體的異常病理現(xiàn)象。代謝綜合征在機(jī)制上可引起機(jī)體發(fā)生胰島素抵抗、能量代謝異常、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、自噬過程改變等，而近年來基礎(chǔ)及臨床研究表明這些可調(diào)節(jié)性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常與腦衰老、阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性病變密切相關(guān)[3-7]。大量流行病學(xué)研究證實(shí)，與代謝綜合征相關(guān)的糖尿病、高血壓、肥胖等是腦衰老的潛在獨(dú)立危險(xiǎn)因素，故代謝紊亂可能是病理性腦衰老發(fā)生的始動(dòng)因子[8]。

對(duì)代謝綜合征的研究目前大多采用高脂高糖飲食喂養(yǎng)模型，但這一模型忽略了飲食結(jié)構(gòu)的改變對(duì)機(jī)體造成的影響[9]。追趕生長(zhǎng)的概念由Leitch在1951年總結(jié)提出，饑荒、飲食不當(dāng)或某些引起生長(zhǎng)發(fā)育受限的疾病都可繼發(fā)出現(xiàn)追趕生長(zhǎng)(catch-up growth， CUG)[10-11]。CUG主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)抑制在營(yíng)養(yǎng)恢復(fù)后機(jī)體出現(xiàn)的代償性快速生長(zhǎng)現(xiàn)象。成年期遭遇營(yíng)養(yǎng)不良的個(gè)體，后續(xù)由于生活水平快速提高導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)過剩的“追趕生長(zhǎng)”現(xiàn)象在我國(guó)及其他發(fā)展中國(guó)家經(jīng)歷饑荒40-50年后普遍存在，并且節(jié)食減肥突然中斷的現(xiàn)象在當(dāng)今社會(huì)人群中亦為廣泛[12]。大量研究證實(shí)，CUG會(huì)對(duì)機(jī)體造成長(zhǎng)期不利影響，導(dǎo)致代謝綜合征、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、高血壓、二型糖尿病等疾病的發(fā)病率增高，但對(duì)衰老及神經(jīng)系統(tǒng)的影響尚鮮有報(bào)道[13]。本研究以不同能量飲食喂養(yǎng)為切入點(diǎn)，誘導(dǎo)C57小鼠出現(xiàn)代謝綜合征模型，以期為代謝綜合征及其并發(fā)神經(jīng)功能損害的防治提供新的研究思路和防治策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4周齡SPF級(jí)C57BL/6 J小鼠40只，雄性，體重(17.2±0.9)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2016-0011】，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境中【SYXK(京)2015-0016】。

課題得到首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：20170630)。

1.1.2 主要試劑和儀器

血糖儀及血糖試紙(美國(guó)羅氏)；三酰甘油(triglyceride， TG)試劑盒、總膽固醇(total cholesterol,TC)試劑盒、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)試劑盒、胰島素(Insulin)試劑盒(南京建成生物工程研究所)； H-7500透射電子顯微鏡(日本)，P53抗體、磷酸化P53抗體(美國(guó)，Cell Signaling Technology)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型的建立

40只C57小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組(normal control group， NC)，以正常能量飼料(粗蛋白19.1%，粗脂肪4%，碳水化合物59%，總代謝能3.484 Kcal/g)喂養(yǎng)；低能量組(calorie-restricted group，CR)，以低能量飼料(粗蛋白19.145%，粗脂肪2.52%，碳水化合物37.17%，總代謝能2.479 Kcal/g)喂養(yǎng)；高能量組(high energy group， HE)，以高能量飼料(粗蛋白19.145%，粗脂肪21.52%，碳水化合物47.17%，總代謝能4.589 Kcal/g)喂養(yǎng)；追趕生長(zhǎng)組(catch-up growth group，CUG)，低能量飲食喂養(yǎng)六周后開放高能飲食喂養(yǎng)，各組動(dòng)物均連續(xù)喂養(yǎng)12周。飼料配方購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。以上動(dòng)物均于天黑前投食，低能量飲食喂養(yǎng)的動(dòng)物投食量與同體重正常對(duì)照組動(dòng)物的進(jìn)食量相一致。動(dòng)物喂養(yǎng)員每周2～3次更換鋸末墊料，每周室溫和相對(duì)濕度控制在(23±2)℃和(55±5)%，每天12 h光照/12 h黑夜，動(dòng)物可自由攝水。

1.2.2 生化指標(biāo)檢測(cè)嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行

計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)：HOMA-IR=(FPG×FINS)/22.5。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)海馬組織P53蛋白和磷酸化P53蛋白水平

10%水合氯醛麻醉小鼠，犧牲取腦，冰浴中分離海馬組織，包入預(yù)先做好的錫箔紙中，投入液氮速凍，-80℃保存。取凍存的海馬組織，置于玻璃勻漿器內(nèi)勻漿，隨后加入蛋白裂解液冰上裂解30 min，4℃ 12 000 r/min離心10 min取上清。各吸取3 μL，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，加入6×蛋白上樣緩沖液調(diào)整上樣量15 μL /孔，100℃變性5 min。采用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法上樣電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h； 然后分別與目的抗體P53(1∶1000)和磷酸化P53(1∶1000)4℃雜交過夜；TBST洗膜3次×10 min； 雜交二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次×10 min；使用Millipore發(fā)光液，計(jì)算機(jī)凝膠顯影系統(tǒng)曝光、顯影，Image J軟件進(jìn)行條帶灰度分析。

1.2.4 電鏡技術(shù)觀察海馬區(qū)脂褐素

10%水合氯醛對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，經(jīng)左心室-升主動(dòng)脈插管灌注并固定，首先灌注生理鹽水100～150 mL，同時(shí)剪開右心耳，待肝完全變白，右心耳流出澄清液體后，注入4℃預(yù)冷的4%多聚甲醛固定液緩慢灌注，待肝變硬、四肢僵硬，斷頭取腦，分離海馬組織，切成1 mm3組織塊。置于2%多聚甲醛 + 2.5%戊二醛固定液中4℃固定2 h。梯度酒精脫水、置換、包埋，半薄切片定位，超薄切片機(jī)切片，厚度為100 nm， 撈在150目的銅網(wǎng)上，1%醋酸雙氧鈾染色20 min，沖洗晾干后檸檬酸鉛染色2 min，透射電鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS21.0，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。體重、血糖采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析，組間比較采用單因素方差分析。P< 0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P< 0.01認(rèn)為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重和血糖的變化

低能量組體重持續(xù)低于正常對(duì)照組(P< 0.05)；高能量組體重顯著高于正常對(duì)照組，差異有顯著性(P< 0.01)；追趕生長(zhǎng)組于開放飲食兩周后，體重追趕上正常對(duì)照組(P< 0.05)，但未追趕上高能量組。低能量組血糖處于最低狀態(tài)，于實(shí)驗(yàn)第6周開始與正常對(duì)照組相比差異有顯著性(P< 0.05)； 高能量組血糖持續(xù)高于正常對(duì)照組，差異有顯著性(P< 0.01)；追趕生長(zhǎng)組在開放飲食兩周后，血糖明顯高于正常對(duì)照組(P< 0.01)，并接近高能量組血糖水平。(圖1)

2.2 代謝綜合征相關(guān)指標(biāo)的變化

低能量組小鼠膽固醇、三酰甘油、胰島素樣生長(zhǎng)因子1、胰島素、HOMA-IR均低于正常對(duì)照組，其中胰島素樣生長(zhǎng)因子1顯著低于正常對(duì)照組，差異有顯著性(P< 0.05)； 高能量組各指標(biāo)均高于正常對(duì)照組，膽固醇和胰島素樣生長(zhǎng)因子1差異有顯著性(P< 0.05)； 追趕生長(zhǎng)組膽固醇水平和胰島素樣生長(zhǎng)因子1水平顯著高于正常對(duì)照組(P< 0.01)，HOMA-IR高于正常對(duì)照組(P< 0.05)。(表1)

2.3 海馬組織P53蛋白與磷酸化P53蛋白的表達(dá)

低能量組P53與磷酸化P53蛋白表達(dá)水平低于正常對(duì)照組，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異無顯著性(P> 0.05)； 高能量組和追趕生長(zhǎng)組P53與磷酸化P53蛋白表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組(P< 0.05)，其中追趕生長(zhǎng)組升高尤為明顯(P< 0.01)(圖2)。

2.4 海馬組織脂褐素沉積

與正常對(duì)照組相比，在特定大小的腦區(qū)內(nèi)低能量組脂褐素沉著較少，可見少量散在的脂褐素顆粒；高能量組和追趕生長(zhǎng)組可見明顯脂褐素蓄積，胞質(zhì)內(nèi)脂褐素小體沉積成簇狀；其中追趕生長(zhǎng)組脂褐素沉積最為明顯(圖3)。

注：A. 各組小鼠體重變化；B. 各組小鼠血糖變化。與正常對(duì)照組比較，*P< 0.05， **P< 0.01。圖1 小鼠體重和血糖的變化Note. A. Changes in body weight of mice in each group. B. Changes in blood glucose of mice in each group. NC，normal control group. CR，calorie-restricted group. HE，high-energy group. RH，catch-up growth group. Compared with the normal control group，*P< 0.05，**P< 0.01.Figure 1 Changes in body weight and blood glucose in mice

組別Groups膽固醇Cholesterol(mmol/L)三酰甘油Triglyceride(mmol/L)胰島素樣生長(zhǎng)因子1 IGF-1 (mg/L) 胰島素Insulin(ng/mL)胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR正常對(duì)照組(NC)2.492±0.2710.556±0.1220.197±0.0340.885±0.1690.708±0.211低能量組(CR)1.532±0.5320.342±0.0960.120±0.012*0.751±0.2260.491±0.143高能量組(HE)4.422±1.150**0.762±0.1390.276±0.052*1.186±0.2521.340±0.219追趕生長(zhǎng)組(RH)4.144±0.183**0.704±0.1890.294±0.044**1.336±0.398 1.579±0.698*

注：與正常對(duì)照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. NC，normal control group. CR，calorie-restricted group. HE，high-energy group. RH, catch-up growth group. Compared with the normal control group，*P< 0.05，**P< 0.01.

注：A. 各組小鼠腦海馬組織P53蛋白和磷酸化P53蛋白免疫印跡；B. P53蛋白表達(dá)水平；C. 磷酸化P53蛋白表達(dá)水平。NC，正常對(duì)照組； CR低能量組； HE，高能量組；RH，追趕生長(zhǎng)組。與正常對(duì)照組比較, *P< 0.05，**P< 0.01。圖2 小鼠腦海馬組織P53蛋白與磷酸化P53蛋白表達(dá)水平Note. A. Immunoblotting of P53 protein and phosphorylated P53 protein in hippocampus of mice in each group. B. P53 protein expression level. C. Phosphorylated P53 protein expression level. NC，normal control group. CR， calorie-restricted group. HE，high-energy group. RH， catch-up growth group. Compared with the normal control group，*P< 0.05，**P< 0.01.Figure 2 Expression of P53 protein and phosphorylated P53 protein in hippocampus of brain tissue

注：A. 正常對(duì)照組；B. 低能量組；C. 高能量組；D. 追趕生長(zhǎng)組。圖3 電鏡下腦組織海馬區(qū)脂褐素(× 30 000，標(biāo)尺：1.0 μm)Note. A. normal control group. B. calorie-restricted group. C. high-energy group. D. catch-up growth group.Figure 3 Lipofuscin in the hippocampus of brain tissue under an electron microscope (×30 000, scale=1.0 μm)

3 討論

動(dòng)物飲食由低能量驟然提升至高能量的改變被稱為“追趕生長(zhǎng)飲食模式”，可導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生加速生長(zhǎng)，不同組織追趕生長(zhǎng)的速度不同，脂肪組織的生長(zhǎng)速度明顯高于其他組織，可形成“追趕性肥胖”[14]。在本實(shí)驗(yàn)之前，對(duì)追趕生長(zhǎng)的研究一直較多關(guān)注內(nèi)分泌系統(tǒng)，少有文章報(bào)道機(jī)體發(fā)生追趕生長(zhǎng)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響，直到最近肖榮教授課題組通過大規(guī)模流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)生命早期經(jīng)歷營(yíng)養(yǎng)不良，而后營(yíng)養(yǎng)水平大幅提升的人群，在中老年期出現(xiàn)認(rèn)知功能下降的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高[15]。本研究采用不同能量飲食喂養(yǎng)小鼠，試從機(jī)制上探討飲食模式的改變對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，追趕生長(zhǎng)組小鼠膽固醇、三酰甘油、胰島素樣生長(zhǎng)因子1等代謝指標(biāo)升高的同時(shí)，表現(xiàn)出明顯的胰島素抵抗傾向。胰島素受體亦分布在大腦的廣泛區(qū)域，尤其是與記憶功能密切相關(guān)的海馬組織。大量臨床、基礎(chǔ)和流行病學(xué)研究提供了充分的證據(jù)表明胰島素抵抗參與神經(jīng)退行性疾病的病理過程，與認(rèn)知功能下降具有明顯相關(guān)性[16-17]。中年期肥胖個(gè)體并同時(shí)伴有胰島素抵抗，是其老年期神經(jīng)退行性疾病發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[8]。

形態(tài)學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)追趕生長(zhǎng)喂養(yǎng)的小鼠海馬區(qū)出現(xiàn)明顯的P53和磷酸化P53-ser15蛋白表達(dá)水平升高。P53基因作為一種重要的抑癌基因，編碼 393 個(gè)氨基酸組成的含磷蛋白質(zhì)，可誘發(fā)多種細(xì)胞凋亡，是公認(rèn)的衰老標(biāo)志分子。體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表明，神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，伴隨P53 基因的高水平表達(dá)[18-21]。DNA損傷可引起P53在ser15位點(diǎn)磷酸化(P53-ser15)，磷酸化的P53在神經(jīng)細(xì)胞凋亡中起重要作用，而且P53-ser15磷酸化及P53蛋白高水平表達(dá)可能會(huì)加快腦老化和神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展[19]。

進(jìn)一步對(duì)腦組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，我們發(fā)現(xiàn)追趕生長(zhǎng)飲食喂養(yǎng)的小鼠海馬區(qū)出現(xiàn)明顯的脂褐素沉積現(xiàn)象。神經(jīng)元內(nèi)脂褐素沉積可使生物膜的通透性、酶的催化功能、受體的結(jié)構(gòu)等發(fā)生異常改變，并常伴隨晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products， AGEs)和丙二醛(malonedialdehyde， MDA)的積聚，導(dǎo)致正常生化代謝過程減慢或停滯，最終引起腦內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生改變，是迄今唯一較為明確而公認(rèn)的腦衰老的特征性金標(biāo)準(zhǔn)[22]。

本課題研究表明，追趕生長(zhǎng)飲食模式可引起小鼠代謝綜合征，同時(shí)誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)促凋亡基因P53顯著表達(dá)，以及明顯的脂褐素沉積現(xiàn)象，進(jìn)一步從病理學(xué)角度提供了追趕生長(zhǎng)飲食模式導(dǎo)致小鼠發(fā)生病理性腦衰老的證據(jù)。而值得引起關(guān)注的是，追趕生長(zhǎng)組動(dòng)物肥胖水平雖不及高能量組動(dòng)物，但腦衰老樣病變卻更加顯著，由此我們推斷追趕生長(zhǎng)導(dǎo)致的機(jī)體胰島素抵抗在致神經(jīng)系統(tǒng)退行性變中發(fā)揮了重要作用。而在抗衰老的研究中，通過熱量限制達(dá)到抗衰老效應(yīng)已被證明是目前最為可靠的方法[23]。1935年McCay等研究發(fā)現(xiàn)嚙齒類動(dòng)物從幼年開始或成年期以后每天攝入正常飲食能量的30%～50%可使壽命延長(zhǎng)10%～20%，近年來許多科學(xué)家也通過研究表明CR能延緩衰老并預(yù)防衰老相關(guān)疾病的發(fā)生。CR對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的抗衰老效應(yīng)包括提高機(jī)體認(rèn)知和記憶能力，減緩神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展[24-26]。因此，結(jié)合本課題的研究結(jié)果，我們推測(cè)追趕生長(zhǎng)是機(jī)體處于飲食平衡狀態(tài)時(shí)，由于營(yíng)養(yǎng)攝入水平的大幅提高打破了CR形成的腦保護(hù)機(jī)制，從而對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生與腦衰老密切相關(guān)[27]。腦衰老過程是對(duì)神經(jīng)保護(hù)機(jī)制和神經(jīng)再生機(jī)制的挑戰(zhàn)，最終發(fā)生的是“健康腦衰老”還是“非健康腦衰老”取決于基因和環(huán)境因素的共同參與和控制。隨著全球人口老齡化進(jìn)程的加快，如何防治衰老所致的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病是備受關(guān)注的問題。本研究著眼于廣泛存在于當(dāng)今社會(huì)的不同能量飲食問題，發(fā)現(xiàn)在追趕生長(zhǎng)飲食模式下機(jī)體除可發(fā)生代謝綜合征相關(guān)疾病，還可引起腦衰老樣病變，這一神經(jīng)-內(nèi)分泌動(dòng)物模型為進(jìn)一步探討如何預(yù)防和延緩腦衰老的發(fā)生和發(fā)展提供了新思路。